抗家蠶BmGATA6多克隆抗血清的制備方法及多克隆抗血清與應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種多克隆抗血清，具體涉及一種抗家蠶BmGATA6多克隆抗血清的制 備方法及由其制備的多克隆抗血清與應用。
【背景技術】
[0002] GATA蛋白家族是一組能與含有保守的（T/A)GATA(A/G)基序啟動子結合的轉錄因 子，家族成員已發(fā)現(xiàn)在動物、真菌、植物等生物中廣泛存在，在真核生物的增殖、分化和發(fā)育 中扮演著重要的角色。哺乳動物中以人類為例已經(jīng)被鑒定有6個GATA蛋白，分別在造血 系統(tǒng)，心臟，腸道等組織器官的分化和發(fā)育中起著關鍵的作用。昆蟲中以果蠅為例也被鑒 定出多個GATA蛋白，其中被研宄最為廣泛的是在造血過程中扮演指揮調節(jié)作用的Serpent 和在腸道、眼睛、鬃毛等發(fā)育中起到調節(jié)作用的Panner。但是有關家蠶GATA蛋白的研宄鮮 有報道，對其在家蠶中的作用也不清楚。雖然GATA是較為保守的蛋白家族，但是物種間的 差異，抗體制備時氨基酸序列的選擇等因素，均導致GATA抗體不能共用，因此要解析家蠶 BmGATA6蛋白在家蠶中的功能，順利進行后續(xù)基礎性實驗，需要家蠶BmGATA6蛋白抗原及抗 體的發(fā)明。

【發(fā)明內容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一種抗家蠶BmGATA6多克隆抗血清的制備方法及由其制 備的多克隆抗血清與應用。
[0004] 具體地，所述的抗家蠶BmGATA6多克隆抗血清的制備方法，包含采用SEQIDNO:1 所示序列表示的抗原通過動物免疫獲得所述抗家蠶BmGATA6多克隆抗血清。
[0005] 具體地，所述抗原可以通過下述步驟制得：
[0006] 1)家蠶BmGATA6的克隆和分析：
[0007] 根據(jù)NCBI上預測的BmGATA6的氨基酸序列，設計如SEQIDNO:4-5所示的擴增引 物，進行PCR擴增，獲得第一擴增產(chǎn)物；
[0008] 所述第一擴增產(chǎn)物與第一連接載體連接后獲得第一連接產(chǎn)物，所述第一連接產(chǎn)物 轉化第一感受態(tài)細胞，獲得第一陽性克隆，然后對第一陽性克隆進行測序驗證，測序獲得的 BmGATA6全長編碼基因序列如SEQIDNO:3所示；
[0009] 2)家蠶BmGATA6的原核表達及蛋白純化：
[0010] 根據(jù)步驟1)獲得的BmGATA全長編碼基因序列，截取N端從43bp至986bp的序 列，獲得SEQIDNO:1所示的序列，設計如SEQIDNO:6-7所示的原核表達引物，進行PCR 擴增，獲得第二擴增產(chǎn)物；
[0011] 所述第二擴增產(chǎn)物與第二連接載體連接后獲得第二連接產(chǎn)物，所述第二連接產(chǎn)物 轉化第二感受態(tài)細胞，進行蛋白誘導表達；
[0012] 對誘導表達的蛋白進行SDS-PAGE電泳檢測，選出較純的含有BmGATA6蛋白的洗脫 液，多次透析，濃縮，將其凍干成為蛋白干粉，保存，備用。
[0013] 進一步地，所述誘導表達時，以IPTG至終濃度為分別為0. 4mM、0. 6mM、0. 8mM、 1. OmM后在16°C條件下培養(yǎng)20h和37°C條件下培養(yǎng)5小時分別進行BmGATA6蛋白誘導表 達。
[0014] 進一步地，以IPTG濃度為0. 6mM，在16°C條件下培養(yǎng)20h的條件為最終誘導條件。
[0015] 進一步地，第一連接載體是pMD19-T Simple載體，第一感受態(tài)細胞是DH5 a感受 態(tài)細胞。
[0016] 進一步地，第二連接載體是pET32a載體，第二感受態(tài)細胞是BL21感受態(tài)細胞。
[0017] 進一步地，所述動物免疫包括對HRP標記小鼠，以濃度為2 y g/ml的抗原包被液進 行多次多點免疫，計算小鼠產(chǎn)生的家蠶BmGATA6蛋白抗血清的效價。
[0018] 進一步地，所述制備方法包含：以家蠶5齡6天的中腸的石蠟切片作為樣本，對家 蠶BmGATA6蛋白抗血清進行免疫熒光檢測。
[0019] 本發(fā)明還提供根據(jù)上述制備方法制備的抗家蠶BmGATA6多克隆抗血清。
[0020] 根據(jù)上述的制備方法制備的抗家蠶BmGATA6多克隆抗血清能夠用于檢測鱗翅目 昆蟲中保守的GATA蛋白。
[0021] 本發(fā)明成功克隆家蠶BmGATA6基因，原核表達純化出有活性的蛋白，通過多次免 疫小鼠產(chǎn)生多克隆抗血清，可以進行體內BmGATA6蛋白表達水平的western檢測，以及組織 石蠟切片（需要抗原修復）后的免疫熒光，細胞爬片的免疫熒光等實驗。本發(fā)明能夠進一 步用于家蠶BmGATA6蛋白以及鱗翅目昆蟲中保守的GATA蛋白的功能研宄。本抗血清可以 用于家蠶BmGATA6蛋白及與其高度保守的鱗翅目GATA蛋白功能的基礎研宄，包括western 及免疫熒光等方面的檢測。
[0022] 為讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例， 并配合附圖，作詳細說明如下。
【附圖說明】
[0023] 圖1是家蠶BmGATA6氨基酸保守結構域預測視圖。
[0024] 圖2A和圖2B是不同濃度IPTG及不同溫度下誘導BmGATA6蛋白后SDS-PAGE電泳 檢測。圖2A為16°C誘導，圖2B為37°C誘導。
[0025] 圖3是不同溫度誘導及超聲波破碎后在上清和沉淀中SDS-PAGE電泳檢測BmGATA6 蛋白的表達情況，其中對誘導后的BL21菌液超聲處理后，分別提取上清與沉淀中的蛋白進 行考染檢測，M是marker，l#是 37°C，0mM IPTG上清；2#是 37°C，0mM IPTG沉淀；3# 是 37°C， 0. 6mM IPTG誘導上清；4#是 37°C，0. 6mM IPTG誘導沉淀；5#是 16°C，0. 6mM IPTG誘導上清； 6# 是 16°C，0. 6mM IPTG 誘導沉淀。
[0026] 圖4是不同濃度咪唑洗脫蛋白后SDS-PAGE電泳檢測。
[0027] 圖5是3只小鼠產(chǎn)生的抗血清的western檢測。其中M表示marker，陰性血清中 為預染marker，抗血清比例均為1 : 5000。
[0028] 圖6是家蠶中腸石蠟切片檢測BmGATA6抗血清的免疫熒光效果?？贵w稀釋比例均 為 1 : 4000。 【具體實施方式】 [0029] 試驗材料
【主權項】
1. 一種抗家蠶BmGATA6多克隆抗血清的制備方法，其特征在于，所述方法包含采用SEQ ID NO :1所示序列表示的抗原通過動物免疫獲得所述抗家蠶BmGATA6多克隆抗血清。
2. 根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述抗原通過下述步驟制得： 1) 家蠶BmGATA6的克隆和分析： 根據(jù)NCBI上預測的BmGATA的氨基酸序列，設計如SEQ ID N0:4-5所示的擴增引物，進 行PCR擴增，獲得第一擴增產(chǎn)物； 所述第一擴增產(chǎn)物與第一連接載體連接后獲得第一連接產(chǎn)物，所述第一連接產(chǎn)物轉 化第一感受態(tài)細胞，獲得第一陽性克隆，然后對第一陽性克隆進行測序驗證，測序獲得的 BmGATA6全長編碼基因序列如SEQ ID NO :3所示； 2) 家蠶BmGATA6的原核表達及蛋白純化： 根據(jù)步驟1)獲得的BmGATA全長編碼基因序列，截取N端從43bp至986bp的序列，獲 得SEQ ID N0:1所示的序列，設計如SEQ ID N0:6-7所示的原核表達引物，進行PCR擴增， 獲得第二擴增產(chǎn)物； 所述第二擴增產(chǎn)物與第二連接載體連接后獲得第二連接產(chǎn)物，所述第二連接產(chǎn)物轉化 第二感受態(tài)細胞，進行蛋白誘導表達； 對誘導表達的蛋白進行SDS-PAGE電泳檢測，選出較純的含有BmGATA6蛋白的洗脫液， 多次透析，濃縮，將其凍干成為蛋白干粉，保存，備用。
3. 根據(jù)權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述誘導表達時，以IPTG至終濃度為 分別為〇. 4mM、0. 6mM、0. 8mM、l. OmM后在16°C條件下培養(yǎng)20h和37°C條件下培養(yǎng)5小時分 別進行BmGATA6蛋白誘導表達。
4. 根據(jù)權利要求3所述的制備方法，其特征在于，以IPTG濃度為0. 6mM，在16°C條件下 培養(yǎng)20h的條件為最終誘導條件。
5. 根據(jù)權利要求2至4中任一項所述的制備方法，其特征在于，第一連接載體是 PMD19-T Simple載體，第一感受態(tài)細胞是DH5a感受態(tài)細胞。
6. 根據(jù)權利要求2至4中任一項所述的制備方法，其特征在于，第二連接載體是 pET32a載體，第二感受態(tài)細胞是BL21感受態(tài)細胞。
7. 根據(jù)上述任一權利要求所述的制備方法，其特征在于，所述動物免疫包括對HRP標 記小鼠，以濃度為2 y g/ml的抗原包被液進行多次多點免疫，計算小鼠產(chǎn)生的家蠶BmGATA6 蛋白抗血清的效價。
8. 根據(jù)權利要求7所述的制備方法，其特征在于，進一步包含：以家蠶5齡6天的中腸 的石蠟切片作為樣本，對家蠶BmGATA6蛋白抗血清進行免疫熒光檢測。
9. 權利要求1-8中任一項的制備方法制備的抗家蠶BmGATA6多克隆抗血清。
10. 權利要求1-8中任一項的制備方法制備的抗家蠶BmGATA6多克隆抗血清在檢測鱗 翅目昆蟲中保守的GATA蛋白中的應用。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種抗家蠶BmGATA6多克隆抗血清的制備方法及由其制備的多克隆抗血清與應用。其中，所述方法包含采用SEQ ID NO:1所示序列表示的抗原通過動物免疫獲得所述抗家蠶BmGATA6多克隆抗血清。所述抗原通過下述步驟制得：1)家蠶BmGATA6的克隆和分析：2)家蠶BmGATA6的原核表達及蛋白純化。本抗血清可以用于家蠶BmGATA6蛋白及與其高度保守的鱗翅目GATA蛋白功能的基礎研究，包括western及免疫熒光等方面的檢測。
【IPC分類】C07K16-06, C12N15-70, C07K16-18, G01N33-68, C12N15-12
【公開號】CN104628854
【申請?zhí)枴緾N201510055532
【發(fā)明人】崔紅娟, 徐曼, 譚鵬, 楊麗群, 向仲懷
【申請人】西南大學
【公開日】2015年5月20日
【申請日】2015年2月3日