口蹄疫病毒O型、A型、AsiaⅠ型三重實(shí)時熒光RT-PCR檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及獸用生物診斷制品技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及口蹄疫病毒0型、A型、Asial型 Ξ重實(shí)時巧光RT-PCR檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 口蹄疫（Foot and mouth disease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒（Foot and mouth disease virus,FMDV)引起的偶蹄動物發(fā)生的急性、熱性和高度接觸性傳染病?？谔阋咴跉W 洲、亞洲、非洲、南北美洲及大洋洲歷史上皆有過發(fā)生，歐洲、亞洲、拉下美洲、非洲在近代史 上從未間斷發(fā)生。它破壞性很大，對生產(chǎn)、生活和經(jīng)濟(jì)等方面造成嚴(yán)重的危害，被世界動物 衛(wèi)生組織列為A類傳染病之首?？谔阋卟《揪哂卸嘈托裕灿?個血清型。不同血清型口蹄疫 病毒之間，不能產(chǎn)生交互免疫，因此，快速準(zhǔn)確地對口蹄疫病毒定型在口蹄疫的研究和防疫 中至關(guān)重要。
[0003] 我國周邊國家和地區(qū)存在口蹄疫的流行，印度和中亞地區(qū)存在多種血清型病毒， 印度素有"毒庫"之稱，中亞地區(qū)也被稱為"病毒走廊"，我國有不同血清型病毒侵入的危險。 當(dāng)前對我國威脅較大的是0型、A型、Asia I型3種血清型，0型、A型、Asia I型3種血清型的 RNA序列同源性為60%~70%。編碼結(jié)構(gòu)蛋白的P1區(qū)比編碼非結(jié)構(gòu)蛋白的其他區(qū)域差異更 大。用于設(shè)計(jì)分型引物的1D片斷同源性約60%，而且同一血清型的病毒差異也比較大。運(yùn)就 給引物設(shè)計(jì)帶來了困難。在引物設(shè)計(jì)時，要綜合考慮方法的特異性和檢出率，具有良好特異 性的同時，叉要具有高檢出率。本發(fā)明下載了49條0型FMDV序列、34條Asia I型序列和57條A 型序列，在充分比較同源性的基礎(chǔ)上，選取了多個血清型之間同源性低、血清型內(nèi)同源性高 的基因區(qū)段。最后經(jīng)過篩選，選取了比較理想的區(qū)段設(shè)計(jì)引物，在眾多參考序列的基礎(chǔ)上， 提高了檢出率。因此本發(fā)明建立的多重RT-PCR方法旨在用于區(qū)分運(yùn)巧中血清型病毒。
[0004] 控制FMD的關(guān)鍵在于早發(fā)現(xiàn)、早隔離、早預(yù)防，因而快速、敏感、可靠的診斷方法受 到人們的重視。目前，國內(nèi)檢疫、診斷該病常用的方法有病毒分離和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等， 運(yùn)些方法或需長時間才能獲得檢測結(jié)果，或檢出率低。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)具有靈敏性 高、特異性強(qiáng)、操作簡便等特點(diǎn)，已被廣泛用于分子生物學(xué)各個領(lǐng)域，在分子克隆、疾病診斷 等方面發(fā)揮著重要作用。相對常規(guī)診斷方法。PCR檢測準(zhǔn)確、直接，對于口蹄疫病毒的快速定 型具有重要意義。巧光PC時目較普通PCR操作更加方便快捷、靈敏度更高。因此，本發(fā)明利用 巧光定量RT-PCR來區(qū)分0型、A型和Asial型的FMDV，設(shè)計(jì)了 3對引物和3條探針，并組建一種 口蹄疫病毒0型、A型、Asial型Ξ重實(shí)時巧光RT-PCR檢測試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引本發(fā)明的目的是提供口蹄疫病毒0型、A型、431曰1型；重實(shí)時巧光RT-PCR檢測試劑 盒。
[0006]本發(fā)明為解決上述問題所采取的技術(shù)方案是：口蹄疫病毒0型、A型、Asial型Ξ重 實(shí)時巧光RT-PCR檢測試劑盒，包括病毒RNA提取試劑和RT-qPCR擴(kuò)增試劑，其中RT-qPCR擴(kuò)增 試劑包括擴(kuò)增反應(yīng)液、酶系、陽性對照和陰性對照； 所述擴(kuò)增反應(yīng)液為5XHS One-step RT-PCR buffer、^對引物、Ξ條TaqMan巧光探針 和滅菌超純水的混合物； 用于檢測口蹄疫病毒0型、A型和Asial型的巧光定量RT-PCR引物和探針序列如下：
所述酶系為如per M-MLV Reverse Transcriptase、Hots1:a;rt HiTaq DNA Polymerase 和酶緩沖液混合物； 所述陽性對照為含F(xiàn)MDV病毒0型、A型、Asial型基因片段的Τ載體質(zhì)粒混合物，陰性對照 為滅菌超純水。
[0007] 上述口蹄疫病毒0型、A型、Asial型Ξ重實(shí)時巧光RT-PCR檢測試劑盒，所述病毒RNA 提取試劑包括平衡液化、緩沖液RG、緩沖液RD、緩沖液RW、RNA洗脫液、RNase化ee吸附柱和 收集管、RNase化ee離屯、管W及實(shí)時巧光8聯(lián)排管。
[000引有益效果 本發(fā)明根據(jù)口蹄疫病毒0型、A型和Asial型的基因序列，設(shè)計(jì)3對特異性引物和3條探 針，能在一次PCR擴(kuò)增過程中實(shí)現(xiàn)對口蹄疫病毒不同基因型的監(jiān)測。本發(fā)明包含了病料提取 RNA和RT-qPCR擴(kuò)增所需的全部試劑，不需操作人員再另外準(zhǔn)備，具有快速簡便、靈敏度高、 特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，可最大限度的減少人為誤差。
【附圖說明】
[0009]圖1是本發(fā)明試劑盒對口蹄疫病毒0型-A型-Asial型混合物的Ξ重檢驗(yàn)結(jié)果； 圖2是本發(fā)明試劑盒對0型口蹄疫病毒的敏感性試驗(yàn)結(jié)果； 圖3是本發(fā)明試劑盒對A型口蹄疫病毒的敏感性試驗(yàn)結(jié)果； 圖4是本發(fā)明試劑盒對Asial型口蹄疫病毒的敏感性試驗(yàn)結(jié)果； 圖5是本發(fā)明試劑盒對口蹄疫病毒的特異性試驗(yàn)結(jié)果。 具體實(shí)施例
[0010] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的描述，實(shí)施例中的方法，如無特殊說 明均為常規(guī)方法： 一種口蹄疫病毒0型、A型、Asial型Ξ重實(shí)時巧光RT-PCR檢測試劑盒，包括病毒RNA提取 試劑(A盒)和RT-qPCR擴(kuò)增試劑(B盒)兩個部分。
[0011] A盒包括5瓶RNA提取試劑，分別是平衡液化(室溫密封保存）、緩沖液RG(室溫密封 保存）、緩沖液RD(室溫密封保存）、緩沖液RW(室溫密封保存)和RNA洗脫液(室溫密封保存）； 4份附屬物，分別為RNase Free吸附柱和收集管、RNase Free離屯、管、實(shí)時巧光8聯(lián)排管和 說明書。
[0012] B盒包括4支試劑，分別是擴(kuò)增反應(yīng)液、酶系、陽性對照和陰性對照。擴(kuò)增反應(yīng)液含 dNTPs、MgC12、反應(yīng)緩沖液、口蹄疫病毒A型上游引物和下游引物、探針（巧光報告集團(tuán)為 FAM)、口蹄疫病毒0型上游引物和下游引物、探針（巧光報告集團(tuán)為VIC)、口蹄疫病毒Asia I型上游引物和下游引物、探針（巧光報告集團(tuán)為肥〇)，95〇μL/支；酶系為S叫er M-MLV Reverse Transcriptase、Hots1:a;rt HiTaq DNA Polymerase和酶緩沖液混合物，45W.L/支； 陽性對照為含F(xiàn)MDV病毒0型、A型、Asial型基因片段的Τ載體質(zhì)?；旌衔?，5〇μL/支，分裝于 可立離屯、管中；陰性對照為滅菌超純水，5〇μL/支，分裝于可立離屯、管中。其中，5Χ服化e-step RT-PCR buffer購自深圳市菲鵬生物股份有限公司，引物由Invi化ogen公司合成。引 物序列如下： 所述引物序列和探針序列如下。其中，不同型的探針?biāo)x的巧光標(biāo)記也不同，A型探針 標(biāo)記為FAM，0型為VIC，AsiaI型為肥D。
[0013] 本發(fā)明試劑盒的使用方法如下： 一、病毒RNA提取 (1)組織提取:取新鮮病變組織，在液氮冷凍下迅速研磨成粉末，將粉末放入到1.5 mL 滅菌EP管中； 血液提取:取500 [iL新鮮血液，置于1.5血滅菌EP管中； 細(xì)胞提取:收獲病變細(xì)胞，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶反復(fù)置于-80°C冰箱，和室溫水浴中，快速凍融 Ξ次，收集病毒懸液，室溫1200 r/min，離屯、5 min,收集沉淀。將細(xì)胞沉淀轉(zhuǎn)移至1.5 mL滅 菌EP管中。
[0014] (2)吸附柱活化：向吸附柱中加入60〇μΧ平衡液化，室溫靜置5min，室溫120(K)rpm