一種a型口蹄疫競爭elisa抗體檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物檢測領(lǐng)域，具體涉及一種A型口蹄疫競爭ELISA抗體檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 口蹄疫是一種由口蹄疫病毒引發(fā)的高傳染性的偶蹄動物疾病，由于其傳播性強(qiáng)， 發(fā)病率高嚴(yán)重影響各國的畜牧業(yè)的發(fā)展，同時它亦是人畜共患病，社會危害性極大，已被列 為國家農(nóng)業(yè)部歸為一類傳染病。根據(jù)血清型口蹄疫共分為A、0、C、Asia I、SAT I、SAT II、 SAT III七種，每個型又有若干個亞型，它們之間的抗原性都有很大的不同，給口蹄疫的防治 工作帶來很多困難。開發(fā)一種實用、靈敏、特異的檢測診斷方法十分必要。
[0003] 目前關(guān)于口蹄疫的診斷技術(shù)大致分為五大類臨床診斷、血清學(xué)診斷、生物學(xué)試驗、 分子生物學(xué)檢測技術(shù)以及環(huán)介導(dǎo)；其中以血清學(xué)中ELISA檢測方法最為快速、敏感、準(zhǔn)確。 關(guān)于口蹄疫酶聯(lián)免疫吸附試驗主要有液相阻斷ELISA、固相競爭ELISA、間接ELISA和間接 夾心ELISA等，它們在應(yīng)用中都存在一定的弊端。液相阻斷法不僅可以檢測病毒感染還可 以檢測抗體評價疫苗免疫效果，在市場中得到廣泛的推廣，但其亦存在耗時，操作步驟繁 瑣，人為誤差大等弊端；間接法等雖然操作簡單，較為快捷，但是不能定量評價樣本中抗體 滴度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種A型口蹄疫競爭ELISA抗體檢測試劑盒，能夠快速、簡 便、靈敏的進(jìn)行檢測。
[0005] 本發(fā)明為解決上述問題所采取的技術(shù)方案是：一種A型口蹄疫競爭ELISA抗體檢 測試劑盒，試劑盒內(nèi)設(shè)有洗滌液、樣品稀釋液、顯色液和終止液，還包括A型口蹄疫陰陽性 對照血清、包被A型口蹄疫多抗的96孔反應(yīng)板、能夠與反應(yīng)板中包被的抗體和加入反應(yīng)板 的樣品中抗體反應(yīng)生成結(jié)合物的A型口蹄疫病毒抗原，以及能夠與所述結(jié)合物反應(yīng)生成雙 抗夾心結(jié)合物的辣根過氧化物酶標(biāo)記的A型口蹄疫單克隆抗體。
[0006] 所述A型口蹄疫多抗的96孔反應(yīng)板是以A型口蹄疫兔抗血清為包被抗體，通過以 下方法制備得到： (1) 、A型口蹄疫兔抗血清與PB緩沖液按體積比為1 : 4000的比例稀釋，然后以 100 μ L/孔的加樣量加入到反應(yīng)板中，備用； (2) 、將步驟（1)的反應(yīng)板在溫度為4°C下包被20h，經(jīng)洗滌液洗滌2-3次后，向反應(yīng)板 中加入封閉液，每孔200 μ L，備用； (3) 、將步驟（2)制得的反應(yīng)板置于溫度為4°C的條件下封閉16h，甩液后在溫度為37°C 的條件下干燥3h，即制得A型口蹄疫多抗的反應(yīng)板。
[0007] 包被A型口蹄疫多抗的反應(yīng)板所用封閉液為牛血清蛋白體積濃度為5%的PB緩沖 液。
[0008] 所述A型口蹄疫兔抗血清的制備方法，包括以下步驟： 1) 、將A型口蹄疫重組蛋白與弗氏完全佐劑按I : 1的體積別混合乳化，制得乳化液， 備用； 2) 、對重為I. 8-2. 2kg的兔子進(jìn)行首次免疫，每隔兩周用乳化液對兔子進(jìn)行一次加強(qiáng) 免疫； 3) 、末次加強(qiáng)免疫后的第7天進(jìn)行一次耳緣靜脈采血，檢測血清抗體效價，0D450nm值 達(dá)到1.9-2. 1時，進(jìn)行心臟采血，并將血清純化即制得A型口蹄疫兔抗血清。
[0009] 所述A型口蹄疫競爭ELISA抗體檢測試劑盒的檢測方法，包括以下步驟： !D、對96孔反應(yīng)板進(jìn)行樣品布局，劃分為樣品列、陽性對照列、陰性對照列和多個病毒 抗原對照孔，備用； 在反應(yīng)板中樣品列的各孔內(nèi)分別加入50 μ L樣品稀釋液，然后向樣品列第一行的 各孔分別加入50 μ L已稀釋2倍的樣品液，混合并攪拌均勻后制得稀釋4倍后的樣品液，再 從樣品列第一行各孔中吸取50 μ L樣品液加入到第二行的各孔中，制得稀釋8倍后的樣品 液，重復(fù)上述吸取、稀釋過程，制得稀釋不同倍數(shù)的樣品液，采取同樣的方法對陽性對照血 清、陰性對照血清和PBST進(jìn)行稀釋，得到稀釋不同倍數(shù)的陽性對照血清液、陰性對照血清 液和病毒抗原對照液，備用； ③、向反應(yīng)板中的各孔分別加入50 μ L的病毒抗原，之后進(jìn)行封板，并在溫度為37°C下 溫育60min，備用； ：§、取出步驟@的反應(yīng)板并用洗滌液連續(xù)清洗4-6次，然后在洗水紙上甩干，向反應(yīng)板 的各孔內(nèi)分別加入A型口蹄疫酶標(biāo)單抗50 μ L，之后封板并在溫度為37°C下溫育35min，備 用； ⑤、取出步驟的反應(yīng)板并用洗滌液連續(xù)清洗4-6次，然后向反應(yīng)板的各孔內(nèi)分別加 入底物溶液50 μ L，在溫度為37°C下避光溫育15min，然后向每孔內(nèi)分別加入終止液50 μ L， 并在450nm的波長下讀取吸光值，計算其抗體效價； ?、若抗體效價大于或等于1:64判為口蹄疫A型抗體陽性；1:64~1:32時，判為可疑； 小于或者等于1:32,判為陰性；可疑血清樣品進(jìn)行復(fù)測，復(fù)測抗體效價大于或等于1:64,判 為陽性，小于1:64判為陰性。
[0010] 有益效果 一、通過采用本發(fā)明的試劑盒對原來體外反應(yīng)工藝進(jìn)行改進(jìn)，大大縮短了反應(yīng)時間，由 原來的4小時縮短為1. 5小時，節(jié)省了體外反應(yīng)的原輔料，更加快捷、經(jīng)濟(jì)。
[0011] 二、本發(fā)明采用酶標(biāo)抗體進(jìn)行反應(yīng)，比傳統(tǒng)的酶標(biāo)二抗工藝，檢測更為準(zhǔn)確靈敏。
[0012] 三、采用本發(fā)明方法包被的反應(yīng)板吸附性強(qiáng)，能夠有效促進(jìn)檢測的準(zhǔn)確性。 具體實施例
[0013] 一種A型口蹄疫競爭ELISA抗體檢測試劑盒，試劑盒內(nèi)設(shè)有洗滌液、樣品稀釋液、 顯色液和終止液，還包括A型口蹄疫陰陽性對照血清、包被A型口蹄疫多抗的96孔反應(yīng)板、 能夠與反應(yīng)板中包被的抗體和加入反應(yīng)板的樣品中抗體反應(yīng)生成結(jié)合物的A型口蹄疫病 毒抗原，以及能夠與所述結(jié)合物反應(yīng)生成雙抗夾心結(jié)合物的辣根過氧化物酶標(biāo)記的A型口 蹄疫單克隆抗體。
[0014] 所述A型口蹄疫多抗的96孔反應(yīng)板是以A型口蹄疫兔抗血清為包被抗體，通過以 下方法制備得到： (1) 、A型口蹄疫兔抗血清與PB緩沖液按體積比為1 : 4000的比例稀釋，然后以 100 μ L/孔的加樣量加入到反應(yīng)板中，備用； (2) 、將步驟（1)的反應(yīng)板在溫度為4°C下包被20h，經(jīng)洗滌液洗滌2-3次后，向反應(yīng)板 中加入封閉液，每孔200 μ L，備用； (3) 、將步驟（2)制得的反應(yīng)板置于溫度為4°C的條件下封閉16h，甩液后在溫度為37°C 的條件下干燥3h，即制得A型口蹄疫多抗的反應(yīng)板。
[0015] 包被A型口蹄疫多抗的反應(yīng)板所用封閉液為牛血清蛋白體積濃度為5%的PB緩沖 液。
[0016] 所述A型口蹄疫兔抗血清的制備方法，包括以下步驟： 1) 、將A型口蹄疫重組蛋白與弗氏完全佐劑按I : 1的體積別混合乳化，制得乳化液， 備用； 2) 、對重為I. 8-2. 2kg的兔子進(jìn)行首次免疫，每隔兩周用乳化液對兔子進(jìn)行一次加強(qiáng) 免疫； 3) 、末次加強(qiáng)免疫后的第7天進(jìn)行一次耳緣靜脈采血，檢測血清抗體效價，0D450nm值 達(dá)到1