用于診斷戊型肝炎病毒感染的方法和試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域、病毒學(xué)領(lǐng)域和免疫學(xué)領(lǐng)域，特別是免疫學(xué)診斷領(lǐng)域。具體而 言，本發(fā)明公開了，用于診斷受試者是否感染了戊型肝炎病毒（Hepatitis E Virus，HEV)， 或是否患有戊型肝炎的方法，其包括：（1)測(cè)定來自所述受試者的尿液樣品中戊型肝炎病 毒抗原（HEV-Ag)的存在；和（2)確定所述受試者是否感染了 HEV或是否患有戊型肝炎；其 中，HEV-Ag在所述受試者的尿液樣品中的存在表示，受試者感染了 HEV或者患有戊型肝炎； 以及用于所述方法的試劑盒。此外，本發(fā)明還公開了用于篩選能夠抗戊型肝炎病毒感染或 治療戊型肝炎的候選藥物的方法，以及用于所述方法的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 戊型肝炎（Hepatitis E)主要通過糞-口途徑傳播，但也可通過污染的食物、水源 引起散發(fā)或暴發(fā)流行。世界衛(wèi)生組織2012年7月提供的數(shù)據(jù)顯示，全世界每年約有2000 萬人感染戊型肝炎。戊型肝炎已經(jīng)成為流行最普遍的病毒性肝炎之一。
[0003] 戊型肝炎主要由戊型肝炎病毒Gfepatitis E Virus，HEV)引起。戊型肝炎病毒 為單股正鏈RNA病毒，其病毒顆粒呈球形，直徑27-34nm，無囊膜，核衣殼呈二十面體立體對(duì) 稱。HEV基因組長(zhǎng)7. 6kb，其3'端有poly A尾，包含三個(gè)開放閱讀讀框（ORF);其中，ORFl 位于5'端（約2kb)，為非結(jié)構(gòu)蛋白基因，包含依賴RNA的RNA多聚酶序列；0RF2位于3' 端（約2kb)，為結(jié)構(gòu)蛋白的主要部分，編碼核衣殼蛋白；0RF3與ORFl和0RF2有重疊（全長(zhǎng) 369bp)，為病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因，可編碼病毒特異性免疫反應(yīng)抗原。
[0004] 戊型肝炎病毒在感染人和動(dòng)物后，在體內(nèi)復(fù)制、增殖，形成病毒血癥。因此，通過檢 測(cè)血液（血清或血漿）中的戊型肝炎病毒核酸（HEV RNA)或戊型肝炎病毒抗原（HEV-Ag) 的存在，可以判斷受試者是否感染了 HEV。目前臨床急性、慢性肝炎的診斷，獻(xiàn)血員中HEV攜 帶者的篩選，以及科學(xué)研宄中有關(guān)人和動(dòng)物HEV感染情況的調(diào)查，主要基于以下方法：通過 RT-PCR檢測(cè)血清中的HEV RNA或通過ELISA檢測(cè)血清中的HEV-Ag。
[0005] 然而，RT-PCR檢測(cè)法的實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜、所需的實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備昂貴，對(duì)樣本的采集和 保存條件要求高，并且其實(shí)驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定，易出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性，這大大限制了其應(yīng)用。 ELISA檢測(cè)法的實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，但血清中抗HEV抗體（HEV-Ab)的存在影響著HEV-Ag的檢 測(cè)，這使得ELISA檢測(cè)法的靈敏度降低。此外，由于在HEV感染的不同階段，血清中HEV-Ab 的水平在不斷發(fā)生變化，因此，HEV-Ab對(duì)ELISA檢測(cè)法的影響也在不斷發(fā)生改變，這使得 ELISA檢測(cè)法的檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定。
[0006] 因此，本領(lǐng)域需要開發(fā)操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、并且檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定的檢測(cè)HEV感染的 方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 在本發(fā)明中，除非另有說明，否則本文中使用的科學(xué)和技術(shù)名詞具有本領(lǐng)域技術(shù) 人員所通常理解的含義。并且，本文中所用的核酸化學(xué)、免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室操作步驟均為相應(yīng)領(lǐng) 域內(nèi)廣泛使用的常規(guī)步驟。同時(shí)，為了更好地理解本發(fā)明，下面提供相關(guān)術(shù)語的定義和解 釋。
[0008] 如本文中所使用的，術(shù)語"戊型肝炎病毒抗原"（其在本文中簡(jiǎn)稱為HEV Ag或 HEV-Ag)是指，由HEV表達(dá)的具有抗原性的蛋白。如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，HEV基因 組長(zhǎng)7. 6kb，包含3個(gè)開放閱讀讀框（ORF);其中，ORFl主要編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，0RF2主要 編碼核衣殼蛋白，0RF3主要編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白。因此，HEV表達(dá)的抗原蛋白主要由HEV 的0RF2和0RF3編碼。因此，在本申請(qǐng)中，戊型肝炎病毒抗原包括，HEV 0RF2編碼的抗 原蛋白和/或HEV 0RF3編碼的抗原蛋白。HEV 0RF2和0RF3的完整基因序列可從各 種公共數(shù)據(jù)庫(kù)（例如 NCBI)獲得，參見例如 AJ272108、JQ655736、AB177373、KJ001824、 JN995570等。根據(jù)這些已知的基因序列，可容易地確定HEV 0RF2和0RF3編碼的抗原蛋 白。另外，有關(guān)HEV的0RF2和0RF3及其編碼的蛋白的信息，還可參見例如Khudyakov Y E, Khudyakova N S, Fields H A, et al. Epitope mapping in proteins of hepatitis E virus[J]. Virology, 1993, 194(I):89-96 ；Yarbough P 0, Tam A ff, Fry K E, et al. Hepatitis E virus:identification of type-common epitopes[J]. Journal of virology,1991, 65(11):5790-7 ；Ahmad I, Holla R P,Jameel S. Molecular virology of hepatitis E virus [J]. Virus research, 2011, 161(I):47-58 ；Khudyakov Y E, Favorov M 0, Khudyakova N S, et al. Artificial mosaic protein containing antigenic epitopes of hepatitis E virus[J]· Journal of virology, 1994,68 (11):7067-74;和 Ulanova T 1, Obriadina A P, Talekar G, et al. A new artificial antigen of the hepatitis E virus[J]. Journal of immunoassay&immunochemistry，2009, 30(I):18-39。
[0009] 如本文中所使用的，術(shù)語"抗體"是指，通常由兩對(duì)多肽鏈（每對(duì)具有一條"輕" (L) 鏈和一條"重"(H)鏈）組成的免疫球蛋白分子?？贵w輕鏈可分類為κ和λ輕鏈。重鏈可 分類為μ、S、γ、α或ε，并且分別將抗體的同種型定義為IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在 輕鏈和重鏈內(nèi)，可變區(qū)和恒定區(qū)通過大約12或更多個(gè)氨基酸的"J"區(qū)連接，重鏈還包含大 約3個(gè)或更多個(gè)氨基酸的"D"區(qū)。各重鏈由重鏈可變區(qū)（V h)和重鏈恒定區(qū)（Ch)組成。重鏈 恒定區(qū)由3個(gè)結(jié)構(gòu)域（CH1、C H2*CH3)組成。各輕鏈由輕鏈可變區(qū)（VJ和輕鏈恒定區(qū)（Q) 組成。輕鏈恒定區(qū)由一個(gè)結(jié)構(gòu)域Q組成?？贵w的恒定區(qū)可介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織或 因子，包括免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞（例如，效應(yīng)細(xì)胞）和經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的第一組分（Clq)的結(jié) 合。V h和八區(qū)還可被細(xì)分為具有高變性的區(qū)域（稱為互補(bǔ)決定區(qū)（CDR))，其間散布有較保 守的稱為構(gòu)架區(qū)（FR)的區(qū)域。各由按下列順序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、 FR4從氨基末端至羧基末端排列的3個(gè)⑶R和4個(gè)FR組成。各重鏈/輕鏈對(duì)的可變區(qū)（Vh 和V1)分別形成抗體結(jié)合部位。氨基酸至各區(qū)域或結(jié)構(gòu)域的分配遵循Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987and 1991))，或 Chothia&Lesk(1987) J. Mol. Biol. 196:901-917 ;Chothia 等人（1989) Nature 342:878-883的定義。術(shù)語"抗體"不受任何特定的產(chǎn)生抗體的方法限制。例如，其 包括，特別地，重組抗體、單克隆抗體和多克隆抗體?？贵w可以是不同同種型的抗體，例如， IgG(例如，IgGl，IgG2, IgG3 或 IgG4 亞型），IgAl，IgA2, IgD，IgE 或 IgM 抗體。
[0010] 如本文中所使用的，術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合片段"是指全長(zhǎng)抗體的一個(gè)或多個(gè)部 分，所述部分保持結(jié)合抗體所結(jié)合的相同抗原（例如，HEV-Ag)的能力，與完整抗體競(jìng)爭(zhēng)對(duì) 抗原的特異性結(jié)合。通常參見，F(xiàn)undamental Immunology, Ch. 7Paul，W.，ed.，第 2 版，Raven Press, N.Y. (1989)，其以其全文通過引用合并入本文，用于所有目的?？赏ㄟ^重組DNA技術(shù) 或通過完整抗體的酶促或化學(xué)斷裂產(chǎn)生抗原結(jié)合片段。在一些情況下，抗原結(jié)合片段包括 ?813、？313'、？(313'） 2、？(1、？￥、(^13和互補(bǔ)決定區(qū)（0)1〇片段、單鏈抗體（例如，8〇?￥)、嵌合抗 體、雙抗體（diabody)和這樣的多肽，其包含足以賦予多肽特異性結(jié)合抗原能力的抗體的 至少一部分。
[0011] 如本文中所使用的，術(shù)語"Fd片段"意指由VjP ChI結(jié)構(gòu)域組成的抗體片段；術(shù)語 "Fv片段"意指由抗體的單臂的八和V H結(jié)構(gòu)域組成的抗體片段；術(shù)語"dAb片段"意指由V H 結(jié)構(gòu)域組成的抗體片段（Ward等人，Nature 341:544-546(1989));術(shù)語"Fab片段"意指由 八、VH、C# ChI結(jié)構(gòu)域組成的抗體片段；術(shù)語"F(ab'）2片段"意指包含通過鉸鏈區(qū)上的二硫 橋連接的兩個(gè)Fab片段的抗體片段。
[0012] 在一些情況下，抗體的抗原結(jié)合片段是單鏈抗體（例如，scFv)，其中Vlj和 Vh結(jié)構(gòu)域通過使其能夠產(chǎn)生為單個(gè)多肽鏈的連接體配對(duì)形成單價(jià)分子（參見，例 如，Bird 等人，Science 242:423-426 (1988)和 Huston 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988))。此類 scFv 分子可具有一般結(jié)構(gòu)！NH2-Vf 接頭-Vh-COOH 或 NH2-Vh-接 頭C00H。合適的現(xiàn)有技術(shù)接頭由重復(fù)的GGGGS氨基酸序列或其變體組成。例如，可 使用具有氨基酸序列（GGGGS) 4的接頭，但也可使用其變體（Holliger等人（1993)，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448)?？捎糜诒景l(fā)明的其他接頭由 Alfthan 等人（1995)， Protein Eng. 8:725-731，Choi 等人（2001)，Eur. J. Immunol. 31:94-106，Hu 等人（1996)， Cancer Res. 56:3055-3061，Kipriyanov 等人（1999)，J. Mol. Biol. 293:41-56 和 Roovers 等人（2001)，Cancer Immunol.描述。
[0013] 在一些情況下，抗體是雙抗體，即，雙價(jià)抗體，其中V 結(jié)構(gòu)域在單個(gè)多肽鏈上 表達(dá)，但使用太短的連接體以致不允許在相同鏈的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間配對(duì)，從而迫使結(jié)構(gòu)域 與另一條鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)并且產(chǎn)生兩個(gè)抗原結(jié)合部位（參見，例如，Holliger P.等 人，Proc. Natl.Acad. Sci. USA 90:6444-6448(1993)，和 Poljak R.J.等人，Structure 2:1121-1123(1994))〇
[0014] 可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)（例如，重組DNA技術(shù)或酶促或化學(xué)斷裂 法）從給定的抗體獲得抗體的抗原結(jié)合片段（例如，上述抗體片段），并且以與對(duì)于完整抗 體的方式相同的方式就特異性篩選抗體的抗原結(jié)合片段。
[0015] 如本文中所使用的，術(shù)語"免疫學(xué)測(cè)定"是指，利用抗原-抗體之間的特異性相互 作用/結(jié)合親和力來進(jìn)行的測(cè)定，其一般可用于檢測(cè)特定抗原或者抗體在樣品中的存在 或水平。此類免疫學(xué)測(cè)定是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，包括但不限于，ELISA測(cè)定，Western 印跡，表面等離子共振法，Elispot測(cè)定等。