專利名稱：戊型肝炎病毒抗體以及利用所述抗體檢測(cè)戊型肝炎病毒的方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種針對(duì)HEV ORF2抗原的單克隆抗體，以及使用競(jìng)爭(zhēng)ELISA與所述單克隆抗體的抑制率小于50％，優(yōu)選的小于25％的單克隆抗體。本發(fā)明還涉及一種抗體組合物，其中含有至少一種前述單克隆抗體；一種使用雙抗體夾心ELISA方法檢測(cè)HEV抗原的試劑盒，其含有前述抗體組合物；以及利用前述抗體組合物通過雙抗體夾心ELISA方法檢測(cè)樣品中HEV抗原的體外方法。本發(fā)明還涉及所述抗體組合物用于檢測(cè)HEV抗原的用途。
背景技術(shù)：
戊型肝炎病毒(HEV)為腸道傳播非甲非乙型肝炎(EntericallyTransmitted non-A，non-B hepatitis，ET-NANBH)的主要病原體。過去認(rèn)為，戊型肝炎主要流行于非洲和亞洲等不發(fā)達(dá)地區(qū)，隨著近年來對(duì)戊型肝炎病毒(HEV)研究的深入以及相關(guān)檢測(cè)手段的完善，在歐洲、美國(guó)和日本越來越多的非輸入性HE病例見諸報(bào)道，HEV的流行情況遠(yuǎn)比先前想象的嚴(yán)重，因此HEV病毒的檢測(cè)工作越來越得到重視。
流行病學(xué)研究表明，從感染HEV到出現(xiàn)臨床癥狀的時(shí)間在15-60天左右，病程持續(xù)時(shí)間1-6周。而在實(shí)驗(yàn)感染中，志愿者感染HEV后大約36天出現(xiàn)臨床癥狀。
現(xiàn)有的戊型肝炎病原學(xué)檢測(cè)主要有以下幾種方法1.免疫學(xué)檢測(cè)免疫學(xué)檢測(cè)方法針對(duì)抗HEV抗體，主要采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，檢測(cè)血清中的抗HEV IgM、IgA和IgG抗體。
由于HEV抗體的不同型別對(duì)于HEV感染的檢測(cè)具有不同的意義，故HEV抗體檢測(cè)試劑需要針對(duì)抗HEV的不同型別抗體分別進(jìn)行檢測(cè)。目前的HEV IgG檢測(cè)試劑采用間接法，這種方法特異性不高，而且抗HEV IgG抗體在感染后持續(xù)時(shí)間很長(zhǎng)，因此，僅僅檢測(cè)IgG抗體不能有效的區(qū)分既往感染、近期感染和急性感染。此外，抗HEV IgG抗體在非流行地區(qū)陽性率為1-5％，但在HEV流行地區(qū)25歲以上人群中陽性率可達(dá)40％，對(duì)戊型肝炎急性感染的診斷存在一定的干擾作用，IgM抗體作為急性感染和/或近期感染的標(biāo)志，具有比IgG更高的診斷價(jià)值。IgM抗體作為感染后最早出現(xiàn)的抗體，存在親和力和特異性低的缺點(diǎn)，IgM抗體的這種特性決定了HEV IgM抗體檢測(cè)試劑存在敏感性和特異性都較低的缺點(diǎn)。
而且目前的IgM檢測(cè)試劑多采用間接法或捕獲法，Yu et al建立的捕獲法的靈敏度高于經(jīng)典間接法，但人體內(nèi)IgM-類風(fēng)濕因子和抗HEV IgG的同時(shí)存在可能引起假陽性，因?yàn)镮gM-類風(fēng)濕因子可以和抗HEV IgG的Fc段橋聯(lián)，通過對(duì)樣品進(jìn)行稀釋來提高試劑的特異性，但這樣做的同時(shí)又降低了試劑的敏感性。
Chau et al認(rèn)為，IgA抗體也可以作為HEV近期或急性感染的標(biāo)志抗體，雖然IgA抗體陽性持續(xù)時(shí)間與在HEV感染診斷中的意義還有待臨床和流行病學(xué)研究的進(jìn)一步證實(shí)。
目前，國(guó)際上公認(rèn)的HEV抗體ELISA檢測(cè)試劑為Genelab公司和Abott公司的HEV抗體檢測(cè)試劑盒，它們均采用HEV 1型和2型抗原為檢測(cè)抗原。
2.分子生物學(xué)檢測(cè)分子生物學(xué)檢測(cè)是指使用RT-PCR方法檢測(cè)血清、糞便和組織等樣本中的HEV病毒基因組RNA。然而，作為腸道傳播病毒，HEV病毒血癥持續(xù)時(shí)間很短，許多病人就醫(yī)時(shí)已度過病毒血癥期或已接近末期，血液中的病毒RNA拷貝數(shù)很低，難以通過RT-PCR檢出，這種情況在醫(yī)藥衛(wèi)生條件不發(fā)達(dá)的發(fā)展中國(guó)家尤其突出。糞便排毒雖然持續(xù)時(shí)間略長(zhǎng)于病毒血癥，但樣品采集困難，易受污染且糞便中可能存在影響PCR的物質(zhì)。目前報(bào)道的RT-PCR在HE病人中檢出的陽性率存在很大的差別，從30％至80％不等，這可能與樣品采集時(shí)間、樣品保存情況、引物匹配、PCR條件和其它不確定因素有關(guān)。因此，目前檢測(cè)HEV RNA的RT-PCR診斷方法僅用于實(shí)驗(yàn)室研究，還沒有商品化的試劑被臨床采用。
已知HEV在感染機(jī)體后進(jìn)行復(fù)制，產(chǎn)生足夠量病毒后可引起肝組織的損傷，臨床上表現(xiàn)為肝炎癥狀，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)則會(huì)顯示相關(guān)酶類呈異常反應(yīng)，為顯性感染；有些感染者機(jī)體內(nèi)雖也有病毒的復(fù)制，但沒有引起典型的臨床癥狀，為隱性感染。無論是顯性還是陰性感染，在感染的早期機(jī)體內(nèi)均存在HEV，如果檢測(cè)手段足夠靈敏，在此期間可檢出HEV的核酸和抗原。隨著感染過程的進(jìn)展，病毒可誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，首先誘導(dǎo)感染者產(chǎn)生抗HEV IgM抗體，并持續(xù)一定時(shí)間，在IgM產(chǎn)生以后IgG也會(huì)隨著產(chǎn)生，并持續(xù)較長(zhǎng)的時(shí)間，同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生IgA抗體。隨著抗體的產(chǎn)生，機(jī)體內(nèi)病毒的滴度也會(huì)逐步降低，最后徹底清除。檢測(cè)IgM抗體以及IgG抗體的動(dòng)態(tài)變化可以診斷HEV的急性感染，但在抗體產(chǎn)生以前，HEV的病毒核酸和抗原就已經(jīng)存在，因此檢測(cè)HEV病毒核酸和抗原可達(dá)到更早期診斷的目的。
目前有些實(shí)驗(yàn)室已發(fā)展了HEV核酸檢測(cè)技術(shù)，但其操作繁雜、技術(shù)要求高、容易污染、成本較高等缺點(diǎn)限制了其廣泛應(yīng)用。如果開發(fā)研制技術(shù)要求比較低的抗原檢測(cè)方法，將會(huì)為HEV感染的早期診斷提供很重要的工具。
為了及時(shí)準(zhǔn)確檢測(cè)HEV感染，長(zhǎng)期以來一直迫切需要更為靈敏和準(zhǔn)確的快速檢測(cè)方法。為了解決上述問題，本發(fā)明人通過采用HEV ORF2作為抗原免疫小鼠，篩選針對(duì)所述HEV抗原的單克隆抗體，獲得了能夠以高靈敏度直接檢測(cè)樣品中存在的微量HEV抗原的試劑盒，從而實(shí)現(xiàn)了在HEV感染早期進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)。
發(fā)明概述本發(fā)明一方面，涉及一種針對(duì)HEV ORF2抗原的單克隆抗體。
本發(fā)明的另一方面還涉及使用競(jìng)爭(zhēng)ELISA與本發(fā)明所述單克隆抗體的抑制率小于50％，優(yōu)選的小于25％的單克隆抗體。。
本發(fā)明的另一方面，還涉及一種抗體組合物，其中含有至少一種前述單克隆抗體。
本發(fā)明的再一方面，涉及一種用于雙抗體夾心ELISA方法檢測(cè)HEV抗原的試劑盒，其中含有前述抗體組合物。
本發(fā)明的又一方面，涉及利用前述抗體組合物通過雙抗體夾心ELISA方法檢測(cè)樣品中HEV抗原的體外方法。
本發(fā)明還涉及所述抗體組合物用于檢測(cè)HEV抗原的用途。
發(fā)明詳述現(xiàn)已確認(rèn)的HEV基因組共存在3個(gè)開放讀碼框(ORF 1-3)。ORF1(約28-5106nt)編碼HEV病毒最大的蛋白，該蛋白約186kDa，包括至少4個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)。到目前為止只有很少實(shí)驗(yàn)室能夠表達(dá)完整的ORF1蛋白，分段表達(dá)的ORF1蛋白多應(yīng)用于功能學(xué)研究，目前ORF1片段僅在HEV抗體Western印跡檢測(cè)試劑中應(yīng)用，ELISA檢測(cè)試劑中很少使用。
ORF2基因長(zhǎng)1980bp(約5147nt-7126nt)，編碼分子量約為72kDa的病毒衣殼蛋白。ORF2蛋白有一個(gè)111氨基酸的信號(hào)序列和三個(gè)可能用于分泌表達(dá)的潛在的糖基化位點(diǎn)。在HEV感染中抗ORF2蛋白抗體具有重要意義，雖然HEV的感染機(jī)理仍未闡明，但作為HEV衣殼蛋白的ORF2蛋白在感染過程中很可能扮演著與宿主細(xì)胞膜上的受體結(jié)合并誘發(fā)病毒脫殼和進(jìn)入細(xì)胞的角色，因此目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的多數(shù)中和抗體都為抗ORF2蛋白抗體。
目前用于抗體檢測(cè)的ORF2蛋白主要來源于昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)的完整ORF2蛋白和大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)的ORF2蛋白片段，但不同的抗原表現(xiàn)出不同的抗體結(jié)合能力，比如ORF2蛋白片段比ORF2蛋白全長(zhǎng)能更有效的結(jié)合恢復(fù)期病人血清中的抗HEV抗體。使用合成肽對(duì)ORF2蛋白的抗原性研究過程中，發(fā)現(xiàn)ORF2蛋白的12-147、381-504和573-660區(qū)域存在較多的能夠與HE病人血清反應(yīng)的抗原表位，這些區(qū)域適合于HEV抗體檢測(cè)試劑的構(gòu)建。
ORF3編碼HEV病毒的一個(gè)小磷酸化蛋白，分子量約為13.5kDa。它同被稱為AMBP的肝細(xì)胞骨架蛋白相互作用。ORF3蛋白較小，其含有的抗原表位也相對(duì)較少，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的3個(gè)ORF3蛋白抗原表位(31-40、63-76和105-122)均為線性表位，其中ORF3蛋白的C`端，特別是105-122aa，抗原性較高，HE病人中針對(duì)該表位的抗體陽性率較高，目前的抗體診斷試劑中多包括ORF3蛋白的部分片段。
為了獲得直接檢測(cè)HEV抗原的高靈敏度檢測(cè)方法，本發(fā)明人使用HEV ORF2免疫小鼠，常規(guī)方法制備雜交瘤細(xì)胞，使用免疫原包被ELISA板進(jìn)行檢測(cè)和篩選，共制備24株雜交瘤細(xì)胞用于進(jìn)一步篩選。
除非另外定義，這里所用的所有技術(shù)和科學(xué)名詞都表達(dá)的是在本發(fā)明涉及領(lǐng)域里的熟練技術(shù)人員所理解的通常含義。這里所用的命名和在細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、核酸化學(xué)、免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室操作步驟均為相應(yīng)領(lǐng)域內(nèi)廣泛使用的常規(guī)步驟。
抗體包含通過二硫鍵連接在一起的多肽鏈集合體。稱為輕鏈和重鏈的兩條多肽主鏈構(gòu)成抗體的所有主要結(jié)構(gòu)類別(同型物)。重鏈和輕鏈都進(jìn)一步分為稱作可變區(qū)和恒定區(qū)的一些亞區(qū)。重鏈包括單個(gè)的可變區(qū)和三個(gè)不同的恒定區(qū)，輕鏈則包括單個(gè)可變區(qū)(不同于重鏈的可變區(qū))和單個(gè)的恒定區(qū)(不同于重鏈的恒定區(qū))。重鏈和輕鏈的可變區(qū)負(fù)責(zé)抗體的結(jié)合特異性。
“重鏈可變區(qū)”是指一種多肽，(1)其長(zhǎng)度為110至125個(gè)氨基酸；(2)其氨基酸順序相應(yīng)于本發(fā)明單克隆抗體從重鏈N末端氨基酸開始的重鏈氨基酸順序。同樣，“輕鏈可變區(qū)”是指一種多肽，(1)其長(zhǎng)度為95至115個(gè)氨基酸；(2)其氨基酸順序相應(yīng)于本發(fā)明單克隆抗體從輕鏈N末端氨基酸開始的輕鏈氨基酸順序。
所用的術(shù)語Fab、Fc、F(ab)2及Fv各有其標(biāo)準(zhǔn)的免疫學(xué)含義(見Klein，免疫學(xué)，John Wiley，New York，1982；Parham，Chapter14，in Weir，ed.免疫化學(xué)，4thEd.，Blackwell Scientific Publishers，Oxford，1986)。
本發(fā)明的一方面，涉及一種針對(duì)HEV ORF2抗原的單克隆抗體。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，采用已知技術(shù)建立本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞系。該方法通常包括一種可持久傳代的細(xì)胞系與一種可產(chǎn)生所需抗體的B淋巴細(xì)胞融合。從注射了靶抗原的哺乳動(dòng)物來獲得適當(dāng)淋巴細(xì)胞的技術(shù)是熟知的。一般說來，如果需要人的細(xì)胞，可使用外周血淋巴細(xì)胞；如果需要非人類哺乳動(dòng)物細(xì)胞，則使用脾細(xì)胞或淋巴結(jié)細(xì)胞。給宿主哺乳動(dòng)物重復(fù)注射純化的抗原，并使該哺乳動(dòng)物產(chǎn)生所需的抗體生成細(xì)胞，然后收集這些細(xì)胞與可持久傳代的細(xì)胞系進(jìn)行融合。細(xì)胞融合技術(shù)也是本領(lǐng)域內(nèi)熟知的。一般包括將細(xì)胞與融合劑如聚乙二醇混合。用標(biāo)準(zhǔn)方法如HAT選擇法選擇雜交瘤細(xì)胞。使用ELISA法等標(biāo)準(zhǔn)的免疫分析法分析這些雜交瘤的培養(yǎng)基以選擇出分泌所需抗體的雜交瘤。使用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)由培養(yǎng)基中回收抗體。在應(yīng)用任一種上述技術(shù)時(shí)有許多文獻(xiàn)可供參考(Kohler等人，雜交瘤技術(shù)(Hybridoma Techniques)，Cold Spring Harbor Laboratory，NewYork，1980；Tijssen，酶免疫檢測(cè)的實(shí)踐與理論(Practice andTheory of Enzyme Immunoassays)，Elsevier，Amsterdam，1985；等等)。
抗體片段的應(yīng)用和產(chǎn)生也是熟知的。如Fab片段(Tijssen，酶免疫檢測(cè)的實(shí)踐與理論，Elsevier，Amsterdam，1985)和Fv片段(Hochman等人，生物化學(xué)(Biochemistry)，121130-1135，1973；Sharon等人，生物化學(xué)，151591-1594，1976；Ehrlich等人，美國(guó)專利4470925)。此外，可借助已知技術(shù)用本發(fā)明的這些化合物和組合物構(gòu)建雙特異性抗體，如通過雜交瘤的進(jìn)一步融合(即形成所謂四重雜交瘤)(Quadromas)(Reading，美國(guó)專利4474493)或半分子的化學(xué)再連接(Brennan等人，科學(xué)(Science)，22981-83，1985)。
還可用重組方法制得本發(fā)明雜交瘤特有的抗體和抗體片段。利用本領(lǐng)域熟知的方法可方便地從本發(fā)明雜交瘤中獲得編碼本發(fā)明單克隆抗體的編碼序列，尤其是重鏈的可變區(qū)序列和輕鏈的可變區(qū)序列。本領(lǐng)域內(nèi)熟練的技術(shù)人員可方便地利用這些編碼序列分析出對(duì)于單克隆抗體結(jié)合特異性重要的氨基酸區(qū)域，如存在于抗體基因輕鏈和重鏈可變區(qū)的決定簇互補(bǔ)區(qū)域(CDR)CDR1、CDR2和CDR3，其相應(yīng)的氨基酸序列構(gòu)成了抗體的特異性抗原結(jié)合區(qū)域。利用這些氨基酸序列，用重組方法可制得具有與單克隆抗體相同或相似特異結(jié)合能力的多肽，如將抗體重鏈可變區(qū)基因與輕鏈可變區(qū)基因順序連接表達(dá)而成的單鏈抗體(ScFv)；將抗體重鏈可變區(qū)基因與輕鏈可變區(qū)基因或CDRs基因置換到人類抗體的相應(yīng)位置，表達(dá)出更接近于人類抗體而又具有原單克隆抗體結(jié)合特異性的人源單克隆抗體；等等。
根據(jù)上述方法，本發(fā)明人利用戊型肝炎病毒ORF2免疫小鼠，制備單克隆抗體。根據(jù)布達(dá)佩斯條約，本發(fā)明人已于2005年12月30日將分泌本發(fā)明所述單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，中國(guó)，武漢，武漢大學(xué))，分別為保藏號(hào)為CCTCC-C0200519的雜交瘤細(xì)胞系HEV-NICPBP04、保藏號(hào)為CCTCC-C0200520的雜交瘤細(xì)胞系HEV-NICPBP07和保藏號(hào)為CCTCC-C0200521的雜交瘤細(xì)胞系HEV-NICPBP58。
根據(jù)本發(fā)明制備的各個(gè)單克隆抗體及其結(jié)合活性片段，本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得編碼所述單克隆抗體或其結(jié)合活性片段的核苷酸序列，以及根據(jù)遺傳密碼子的簡(jiǎn)并性產(chǎn)生的不同變體。根據(jù)本發(fā)明公開的內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員可用多種方法制備包含上述核苷酸序列之重組表達(dá)載體，以及由所得重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞的選擇和轉(zhuǎn)化為本領(lǐng)域技術(shù)人員周知，只要其能夠表達(dá)本發(fā)明所述的單克隆抗體或其結(jié)合活性片段。
本發(fā)明的另一方面還涉及使用競(jìng)爭(zhēng)ELISA與本發(fā)明所述單克隆抗體的抑制率小于50％，優(yōu)選的小于25％的單克隆抗體。。所述單克隆抗體即為與本發(fā)明上述雜交瘤細(xì)胞系所分泌的單克隆抗體識(shí)別相同或相似表位的單克隆抗體。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知曉，可通過選擇性標(biāo)記，并對(duì)標(biāo)記后抗體滴定，競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定對(duì)位點(diǎn)的識(shí)別。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明人通過改良過碘酸鈉方法對(duì)抗體進(jìn)行選擇性HRP標(biāo)記。標(biāo)記后的抗體濃度稀釋至50μg/ml，使用免疫原包被的ELISA板進(jìn)行滴定，滴定過程中對(duì)標(biāo)記的抗體進(jìn)行倍比稀釋。根據(jù)單克隆抗體的分組和標(biāo)記抗體情況，對(duì)分組后抗體做競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)，相似單克隆抗體是否識(shí)別相同或相似的抗原表位。與競(jìng)爭(zhēng)抗體濃度相同的無關(guān)單克隆抗體作為陰性對(duì)照，與競(jìng)爭(zhēng)抗體濃度相同與標(biāo)記抗體同株的未標(biāo)記抗體作為陽性對(duì)照。37℃孵育1小時(shí)后，洗板，TMB顯色，450nm處讀取A值，計(jì)算競(jìng)爭(zhēng)抗體對(duì)標(biāo)記抗體的抑制率。公式如下抑制率＝(A競(jìng)爭(zhēng)-A陽性/A陰性-A陽性)×100％如抑制率≥75％為兩株單克隆抗體所識(shí)別位點(diǎn)完全不相關(guān)；≥50％＜75％為不完全相關(guān)；≥25％＜50％為相關(guān)；＜25％為完全相關(guān)。
本發(fā)明的另一方面，還涉及一種抗體組合物，其中含有至少一種由保藏號(hào)為CCTCC-C0200519的雜交瘤細(xì)胞系HEV-NICPBP04、保藏號(hào)為CCTCC-C0200520的雜交瘤細(xì)胞系HEV-NICPBP07和保藏號(hào)為CCTCC-C0200521的雜交瘤細(xì)胞系HEV-NICPBP58所分泌的單克隆抗體。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述抗體組合物同時(shí)含有為CCTCC-C0200519的雜交瘤細(xì)胞系HEV-NICPBP04、保藏號(hào)為CCTCC-C0200520的雜交瘤細(xì)胞系HEV-NICPBP07和保藏號(hào)為CCTCC-C0200521的雜交瘤細(xì)胞系HEV-NICPBP58所分泌的單克隆抗體，優(yōu)選的所述抗體的比例為2∶5∶2。
本發(fā)明的再一方面，涉及一種用于雙抗體夾心ELISA方法檢測(cè)HEV抗原的試劑盒，所述試劑盒中包含診斷有效量的至少一種本發(fā)明的單克隆抗體或其結(jié)合活性片段，或本發(fā)明前述的抗體組合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，適當(dāng)?shù)?，該試劑盒中還應(yīng)當(dāng)包括適當(dāng)?shù)妮d體，緩沖劑/液，和用于檢測(cè)所產(chǎn)生信號(hào)的試劑如市售的第二抗體，及使用說明書。
本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，對(duì)于固相反應(yīng)檢測(cè)而言，可以將本發(fā)明所述單克隆抗體固定于固相載體，也可以將待測(cè)樣品固定于固相載體上。反應(yīng)通常在室溫下進(jìn)行一段時(shí)間，檢測(cè)過程中需要洗滌不與本發(fā)明所述單克隆抗體結(jié)合的樣品的步驟。
對(duì)于液相反應(yīng)而言，通?？梢韵蛱幵谔囟ň彌_體系中的待測(cè)樣品直接加入本發(fā)明所述單克隆抗體，然后在適于抗原抗體發(fā)生相互作用的溫度下，例如室溫下，反應(yīng)一段時(shí)間。
本發(fā)明組合物中所涉及的第二抗體的選擇取決于本發(fā)明單克隆抗體的來源。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，如何根據(jù)單克隆抗體的來源選擇相應(yīng)的第二抗體。本發(fā)明所述第二抗體可以是放射性同位素標(biāo)記的，包括但不限于使用選自32P、125I、S、2H等；也可以是非放射性同位素標(biāo)記的，包括但不限于使用選自辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、生物素、鏈霉親和素等標(biāo)記。本發(fā)明所述檢測(cè)方法中使用的檢測(cè)劑，取決于檢測(cè)過程使用的第二抗體的標(biāo)記物。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉如何選擇合適的檢測(cè)試劑。
本發(fā)明的又一方面，涉及利用前述抗體組合物通過雙抗體夾心ELISA方法檢測(cè)樣品中HEV抗原的體外方法。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括如下步驟1)采用同時(shí)含有CCTCC-C0200519的雜交瘤細(xì)胞系HEV-NICPBP04、保藏號(hào)為CCTCC-C0200520的雜交瘤細(xì)胞系HEV-NICPBP07和保藏號(hào)為CCTCC-C0200521的雜交瘤細(xì)胞系HEV-NICPBP58所分泌的單克隆抗體，優(yōu)選的，所述抗體的比例為2∶5∶2，的抗體組合物，作為捕獲抗體包被酶標(biāo)板；2)向包被有捕獲抗體的酶標(biāo)板條中加入使用含5％牛血清PBST10倍稀釋的待測(cè)血清，孵育，洗滌；3)加入羊抗HEV多抗，孵育，洗滌；4)然后加入生物素標(biāo)記兔抗羊IgG抗體，孵育，洗滌；5)再加入HRP標(biāo)記親和素，孵育，洗滌；6)加入底物顯色。
本發(fā)明還涉及所述抗體組合物用于檢測(cè)HEV抗原的用途。
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步加以說明。
實(shí)施例1 雜交瘤細(xì)胞系的產(chǎn)生取6～8周齡雌性Balb/c小鼠，初次免疫每只小鼠肌肉注射用福氏完全佐劑乳化的5μg抗原(總體積50μl)。15天后進(jìn)行二次基礎(chǔ)免疫，方法為取相同量的抗原用福氏不完全佐劑乳化，肌肉注射。30天后，尾靜脈加強(qiáng)注射5μg不加佐劑的抗原，并于加強(qiáng)免疫后72小時(shí)，殺死小鼠，收集血液，取脾制備脾細(xì)胞懸液(懸于RPMI1640培養(yǎng)基中)，細(xì)胞計(jì)數(shù)板細(xì)胞計(jì)數(shù)。按1/6于脾細(xì)胞的數(shù)量取培養(yǎng)的SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞，混合后離心，利用聚乙二醇(PEG 1500)使脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合。將細(xì)胞懸液與等體積的飼養(yǎng)細(xì)胞混合后，分置于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(200μl/孔)于5％二氧化碳培養(yǎng)箱(ESPEC BNA-311)37℃培養(yǎng)。3天后，用HT培養(yǎng)基(黃嘌呤(hypoxanthn，H)1.361mg+胸腺嘧啶核苷(thymidine，T)0.388mg，加RPMI1640(GIBCO公司)培養(yǎng)基至100mL。45～50℃條件下溶解后，過濾除菌。)半保留換液。7天后，用NE2重組抗原包被板，利用如下述酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中所得雜交瘤細(xì)胞上清培養(yǎng)液。對(duì)于ELISA檢測(cè)為陽性的細(xì)胞克隆，利用有限稀釋法進(jìn)行克隆化。
ELISA檢測(cè)法經(jīng)HPLC純化的抗原，溶解于0.05mol/L碳酸包被緩沖液(20.02gNa2CO3，2.52g NaHCO3加去離子水至1升，pH為9.5)中，濃度約為0.3μg/ml，在96孔聚乙烯微量滴定板的各孔表面上吸附2小時(shí)(37℃)，再置于4℃過夜。用PBS-吐溫洗滌液(8.0g NaCl、0.2g KH2PO4、2.9g Na2HPO4·12H2O、0.2g KCl和0.5ml吐溫20，加去離子水至1升，pH為7.4)洗滌滴定板以除去未結(jié)合的抗原蛋白。然后用200μl/孔的封閉液(1×PBS溶液，組成同前)中加入2％明膠、0.2％酪蛋白和2％蔗糖)37℃封閉2小時(shí)。甩凈、拍干后真空封閉，4℃保存。
檢測(cè)時(shí)，于每孔中加入100μl細(xì)胞培養(yǎng)液上清；每塊96孔微量滴定板設(shè)一陽性對(duì)照，加入100μl小鼠多抗血清(1∶100稀釋使用)；另設(shè)一陰性對(duì)照，加入100μlHT細(xì)胞培養(yǎng)液。37℃溫浴30分鐘，用PBS-吐溫洗滌液洗5遍，拍干后加入過氧化物酶結(jié)合的羊抗鼠免疫球蛋白(HRP-GAM Ig，DAKO公司)，37℃溫浴30分鐘，取出后用PBS-吐溫洗滌液洗5遍，拍干后先后加入底物液A、B各50μl(底物液A成分為顯色液A成分為13.42g Na2HPO4·12H2O、4.2g檸檬酸·H2O和0.3g過氧化氫，用去離子水中調(diào)節(jié)體積為700ml；顯色液B成分為0.2g四甲基聯(lián)苯胺、20ml二甲基甲酰胺用去離子水中調(diào)節(jié)體積為700ml)，37℃顯色10分鐘，加入50μl終止液(2M H2SO4)終止反應(yīng)，并于酶標(biāo)儀上檢測(cè)各孔的OD450值，通常以O(shè)D450值高于陰性對(duì)照2倍以上者視為陽性。
單克隆抗體腹水的獲得及純化取10周齡的健康Balb/c小鼠，腹腔注射福氏不完全佐劑，每只0.5ml。2～7天后，收集克隆化的雜交瘤細(xì)胞，離心去上清，加入不含血清的培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至2×105～2×106個(gè)/ml，每只小鼠注射0.5ml。7～10天后小鼠腹部增大，開始收集腹水。3000rpm離心15分鐘，吸取中間澄清部分的液體，0.45μm的微孔濾膜過濾除菌，分裝后-20℃保存。
將處理好的腹水用0.02mol/L、pH7.4的PBS(81ml 0.2mol/LNa2HPO4，19ml 0.2mol/L NaH2PO4，加生理鹽水至100ml)對(duì)倍稀釋，攪拌下逐滴緩慢加入硫酸銨(濃度達(dá)到50％飽和度)，4℃過夜。4℃，12000rpm離心15分鐘，棄上清，將沉淀溶于原腹水體積2倍的PBS中。攪拌下逐滴緩慢加入硫酸銨，使硫酸銨濃度達(dá)到33％飽和度，4℃靜置過夜。4℃，12000rpm離心15分鐘，棄上清，將沉淀溶于原腹水體積2倍的PBS中。攪拌下逐滴緩慢加入硫酸銨，(濃度達(dá)到50％飽和度)，4℃過夜。4℃，12000rpm離心15分鐘，棄上清。將沉淀溶于適量的PBS中，裝入透析帶中，放入50～100倍含20mmol/L NaCl，pH7.8的120mmol/L Tris-HCl緩沖液中4℃攪拌下脫鹽12小時(shí)左右，期間更換3次以上透析液。取出后分裝-20℃保存。
以上述方法，篩選出了24株分泌抗HEV-ORF2單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
實(shí)施例2單克隆抗體的制備、純化、純度鑒定小鼠腹腔注射液體石蠟0.5ml/只，一周后，預(yù)處理小鼠腹腔注射雜交瘤細(xì)胞106/只，誘生腹水，一周后抽取含單克隆抗體的腹水，收集腹水3000g離心30分鐘，吸取上清，-70℃凍存?zhèn)溆谩?br> 采集的腹水采用辛酸-飽和硫酸胺沉淀法純化單克隆抗體，純化后采用紫外分光光度法測(cè)定單克隆抗體濃度，并采用SDS-PAGE電泳分析純化單克隆抗體純度。
實(shí)施例3抗原和抗體包被及封閉使用96孔聚苯乙烯板(Polystyrene microtiter plates，Maxisorp F96，Nunk Laboratories，Glostrup，Denmark)進(jìn)行包被，使用0.05M NaHCO3緩沖液(pH9.6)將抗體稀釋至合適濃度，抗原稀釋為2.5μg/ml，每孔加入100μl，37℃2小時(shí)，用pH7.4的含0.1％Tween PBS(PBST)洗滌3遍后，每孔加入含20％牛血清的包被緩沖液200μl，37℃封閉2小時(shí)，PBST洗滌3遍后，保存于4℃?zhèn)溆谩?br> 間接ELISA間接ELISA中，使用含5％牛血清的PBST將待檢抗體稀釋至合適濃度，加入包被有抗原的微孔板中，100μl/孔，37℃孵育1小時(shí)，PBST洗滌5遍。然后每孔加入100μl使用含5％牛血清PBST15000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體，37℃孵育30分鐘后，PBST洗滌五遍，加入TMB底物，37℃顯色15分鐘。在波長(zhǎng)450nm處讀取各孔A值。
ELISA板使用2.5μg/ml免疫原包被，二抗采用HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體，使用間接法對(duì)純化的單克隆抗體進(jìn)行親和力粗測(cè)，純化單克隆抗體均稀釋至濃度為10μg/ml，向下倍比稀釋至0.3ng/ml，平行雙孔，每板設(shè)陰性對(duì)照兩孔，使用無關(guān)鼠源單克隆抗體作為陰性對(duì)照。TMB顯色后，450nm讀取A值。繪制同一單克隆抗體不同濃度下A值與濃度的折線圖，并計(jì)算四參數(shù)曲線，由四參數(shù)曲線計(jì)算A50時(shí)單克隆抗體濃度，以A50濃度代表該株單克隆抗體的親和力。結(jié)果見表1表1單克隆抗體對(duì)抗原的親和力測(cè)定

實(shí)施例4采用競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定所述單克隆抗體的識(shí)別表位競(jìng)爭(zhēng)ELISA根據(jù)標(biāo)記抗體的滴定結(jié)果，將標(biāo)記抗體濃度稀釋至A值約為2.00左右，同時(shí)將競(jìng)爭(zhēng)抗體濃度稀釋為標(biāo)記抗體現(xiàn)濃度的10倍。競(jìng)爭(zhēng)抗體和標(biāo)記抗體各50ul加入微孔板中，平行雙孔測(cè)定。與競(jìng)爭(zhēng)抗體濃度相同的無關(guān)單抗作為陰性對(duì)照，與競(jìng)爭(zhēng)抗體濃度相同與標(biāo)記抗體同株的未標(biāo)記抗體作為陽性對(duì)照。37℃孵育1小時(shí)，PBST洗滌5次，加入TMB底物緩沖液顯色，波長(zhǎng)450nm，讀取A值，計(jì)算競(jìng)爭(zhēng)抗體對(duì)標(biāo)記抗體的抑制率。
抑制率＝(A競(jìng)爭(zhēng)-A陽性/A陰性-A陽性)×100％改良過碘酸鈉方法對(duì)本發(fā)明所述單克隆抗體進(jìn)行選擇性HRP標(biāo)記，分別標(biāo)記4、7、8、15、26、27、29、34、40、44、52、56、58、72、80和97號(hào)抗體。標(biāo)記后的抗體濃度稀釋至50μg/ml，使用免疫原包被的ELISA板進(jìn)行滴定，滴定過程中對(duì)標(biāo)記的抗體進(jìn)行倍比稀釋。根據(jù)單克隆抗體的分組和標(biāo)記抗體情況，對(duì)分組后抗體做競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)相似單克隆抗體是否識(shí)別相同或相似抗原表位。計(jì)算競(jìng)爭(zhēng)抗體對(duì)標(biāo)記抗體的抑制率
抑制率＝(A競(jìng)爭(zhēng)-A陽性/A陰性-A陽性)×100％如抑制率≥75％為兩株單克隆抗體所識(shí)別位點(diǎn)完全不相關(guān)；≥50％＜75％為不完全相關(guān)；≥25％＜50％為相關(guān)；＜25％為完全相關(guān)。表2競(jìng)爭(zhēng)ELISA結(jié)果

注配對(duì)中后面一個(gè)抗體為標(biāo)記抗體根據(jù)競(jìng)爭(zhēng)抑制結(jié)果和分組的情況23株單克隆抗體中識(shí)別位點(diǎn)完全相關(guān)的為3-50-72-80；40-44；56-90-97；26-67；17-52；34-58；8-20識(shí)別位點(diǎn)相關(guān)的為2-29；40-44-29識(shí)別位點(diǎn)不完全相關(guān)的為40-44-29；8-7；20-7實(shí)施例5使用HEV1型、4型和豬源HEV攻毒后2周的猴血清選擇適宜的包被抗體LAB間接夾心法ELISA包被有單克隆抗體的酶標(biāo)板條中加入使用含5％牛血清PBST 10倍稀釋的待測(cè)血清，37℃孵育2小時(shí)，PBST洗滌3遍。加入羊抗HEV多抗，37℃孵育1小時(shí)，PBST洗滌5遍，加入生物素標(biāo)記兔抗羊IgG抗體，37℃孵育30分鐘后，PBST洗滌5遍，再加入HRP標(biāo)記親和素，37℃孵育30分鐘后，PBST洗滌5遍，加入TMB底物，37℃顯色15分鐘。在波長(zhǎng)450nm處讀取各孔A值。
為了確定適于包被的單克隆抗體，分別使用10μg/ml的單克隆抗體包被EILSA板，采用LAB間接夾心法ELISA對(duì)20倍稀釋的HEV1型，4型和豬源HEV攻毒后2周的猴血清進(jìn)行檢測(cè)，選取能夠同時(shí)檢出3種不同HEV的11株抗體進(jìn)行進(jìn)一步的篩選。
表3不同單克隆抗體作為包被抗體時(shí)對(duì)1、4和豬型HEV攻毒后猴血清檢測(cè)的S/Co值

實(shí)施例6.最適包被抗體-單克隆抗體的篩選使用佑安醫(yī)院收集的抗HEV IgG和IgM雙陽血清27份，對(duì)選擇的11株單克隆抗體進(jìn)行進(jìn)一步的篩選。，最終確定5株適于包被的單克隆抗體分別為4、7、15、34、58號(hào)。結(jié)果見表4
表4不同單克隆抗體作為包被抗體時(shí)對(duì)佑安醫(yī)院收集的27份抗HEVIgG和IgM雙陽血清檢測(cè)的S/Co值 實(shí)施例7.包被抗體組合物的選擇選擇合適的單克隆抗體進(jìn)行了包被單克隆抗體的搭配選擇，對(duì)不同單克隆抗體的搭配比例進(jìn)行摸索，對(duì)單克隆抗體的包被濃度進(jìn)行摸索，對(duì)27份臨床樣本進(jìn)行重新測(cè)定。
根據(jù)以上單克隆抗體對(duì)27份血清的反應(yīng)性確定了6個(gè)組合，使用總濃度為10μg/ml的以上單克隆抗體組合的等濃度混合物包被ELISA板，LAB間接夾心法檢測(cè)上述27份臨床血清，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，確定58-4-7組合最檢出率最高。結(jié)果見表5。
表5不同抗體組合對(duì)佑安醫(yī)院收集的27份抗HEV IgG和IgM雙陽血清檢測(cè)的S/Co值
實(shí)施例8.包被抗體組合物最佳配比的選擇對(duì)58-4-7組合中各個(gè)單克隆抗體比例進(jìn)行摸索，總濃度為10μg/ml，將總濃度分為9份，分別檢測(cè)58-4-7不同搭配比例情況下對(duì)佑安醫(yī)院收集的27份抗HEV IgG和IgM雙陽血清中的7份具有代表性血清的檢測(cè)效果。最終確定58-4-7搭配比例為2∶5∶2。結(jié)果見表6。
表6.58-4-7抗體組合物中不同搭配比例情況下對(duì)7份代表性血清檢測(cè)的S/Co值

實(shí)施例9.最適包被濃度的確定按照單克隆抗體58-4-7比例為2∶5∶2包被ELISA板，包被濃度分別為20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml和1.25μg/ml，對(duì)30份血清進(jìn)行重新測(cè)定，根據(jù)陽性樣品檢出率和陰性A值，確定最合適的包被濃度為5μg/ml。
權(quán)利要求
1.一種針對(duì)HEV ORF2抗原的單克隆抗體，其為1)HEV-NICPBP04，由保藏號(hào)為CCTCC-C200519的雜交瘤分泌；2)HEV-NICPBP07，由保藏號(hào)為CCTCC-C200520的雜交瘤分泌；和3)HEV-NICPBP58，其特征在于由保藏號(hào)為CCTCC-C200521的雜交瘤分泌。
2.一種針對(duì)HEV ORF2抗原的單克隆抗體，其特征在于所述單克隆抗體與權(quán)利要求1的單克隆抗體的競(jìng)爭(zhēng)性ELISA抑制率小于50％，優(yōu)選的小于25％。
3.一種抗體組合物，其中含有至少一種權(quán)利要求1或2中的單克隆抗體。
4.權(quán)利要求3的抗體組合物，其由權(quán)利要求1中所述的單克隆抗體HEV-NICPBP04、HEV-NICPBP07和HEV-NICPBP58組成。
5.權(quán)利要求4的抗體組合物，其中單克隆抗體HEV-NICPBP04、HEV-NICPBP07和HEV-NICPBP58的比例為2∶5∶2。
6.一種用于雙抗體夾心ELISA方法檢測(cè)HEV抗原的試劑盒，其特征在于含有權(quán)利要求3的抗體組合物。
7.一種利用雙抗體夾心ELISA方法檢測(cè)樣品中HEV抗原的體外方法。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述抗體組合物由單克隆抗體HEV-NICPBP04、HEV-NICPBP07和HEV-NICPBP58組成。
9.權(quán)利要求7的方法，其中所述抗體組合物中單克隆抗體HEV-NICPBP04、HEV-NICPBP07和HEV-NICPBP58的比例為2∶5∶2。
10.權(quán)利要求3的抗體組合物用于檢測(cè)HEV抗原的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種針對(duì)HEV ORF2抗原的單克隆抗體，以及使用競(jìng)爭(zhēng)ELISA與所述單克隆抗體的抑制率小于50％，優(yōu)選的小于25％的單克隆抗體。本發(fā)明還涉及一種抗體組合物，其中含有至少一種前述單克隆抗體；一種使用雙抗體夾心ELISA方法檢測(cè)HEV抗原的試劑盒，其含有前述抗體組合物；以及利用前述抗體組合物通過雙抗體夾心ELISA方法檢測(cè)樣品中HEV抗原的體外方法。本發(fā)明還涉及所述抗體組合物用于檢測(cè)HEV抗原的用途。
文檔編號(hào)G01N33/576GK101034090SQ200610056960
公開日2007年9月12日 申請(qǐng)日期2006年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月8日
發(fā)明者王佑春, 李秀華, 張峰, 喬杉 申請(qǐng)人:中國(guó)藥品生物制品檢定所, 北京萬泰生物藥業(yè)有限公司