戊型肝炎病毒抗體檢驗(yàn)通用elisa法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種病毒抗體檢驗(yàn)方法，尤其涉及一種人、豬戊型肝炎病毒抗體檢驗(yàn)通用ELISA法及其應(yīng)用。一種戊型肝炎病毒抗體檢驗(yàn)通用ELISA法，所述通用ELISA法為單抗阻斷ELISA法，使用豬戊型肝炎病毒的ORF3重組蛋白作為包被抗原。應(yīng)用本發(fā)明建立的阻斷ELISA方法對從廣東省收集的100份豬血清和100份豬場工作人員血清進(jìn)行HEV陽性血清的檢驗(yàn)，得出結(jié)果與現(xiàn)有檢驗(yàn)試劑盒檢驗(yàn)結(jié)果的符合率為97%、98%。
【專利說明】戊型肝炎病毒抗體檢驗(yàn)通用ELISA法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種病毒抗體檢驗(yàn)方法，尤其涉及一種人、豬戊型肝炎病毒抗體檢驗(yàn)通用ELISA法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]戊型肝炎是引起爆發(fā)性及散發(fā)性肝炎的主要原因，血清學(xué)調(diào)查表明，世界1/3人口曾經(jīng)感染過戍型肝炎病毒(Hepatitis E virus, HEV)。無論是在發(fā)展中國家還是在發(fā)達(dá)國家，戊型肝炎都不再是一種罕見的疾病，在發(fā)達(dá)國家每年約有1.3萬-2.6萬人慢性肝炎患者因合并HE死亡。戊型肝炎具有比較明顯的年齡特異性，對于老年人、慢性肝炎患者及孕婦危害性尤高，孕婦感染HEV的死亡率可達(dá)20%。眾多研究表明，豬HEV可能是人感染HEV的主要來源之一，因此，積極開展動物源性HEV的研究將會對公共衛(wèi)生及動物源性食品安全的實(shí)施具有巨大的幫助。
目前在我國大部分地區(qū)，不但在人群中可以檢驗(yàn)到高比例存在的HEV陽性血清，同時在家畜(豬、馬、牛、羊)及寵物(犬)體內(nèi)同樣可以發(fā)現(xiàn)高比例的HEV陽性血清，特別是在豬群中感染率尤為明顯。通過對我國分離到的病毒遺傳物質(zhì)測序比對發(fā)現(xiàn)，無論是人源還是動物源的HEV大多數(shù)屬于IV型。而且對我國東部及南部的分離株分析發(fā)現(xiàn)，豬HEV與人HEV具有較高的相似性。因此有學(xué)者推測，豬可能是HEV重要的儲存器，并通過污染水源和食品，作為一種人獸共患病原在豬群及人群中自由傳播。
[0003]
【發(fā)明內(nèi)容】

本發(fā)明的目的在于提供一種人、豬以及多種動物戊型肝炎病毒抗體檢驗(yàn)通用ELISA法。
[0004]發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的。
[0005]本發(fā)明提供一種人、豬戊型肝炎病毒抗體檢驗(yàn)通用ELISA法，具體為一種單抗阻斷ELISA法，所述的單抗阻斷ELISA法中使用豬戊型肝炎病毒的0RF3重組蛋白作為包被抗原。
[0006]包括以下步驟:
S1.包被抗原:用包被液將0RF3重組蛋白稀釋加入酶標(biāo)板孔中，靜置；
S2.封閉:將步驟SI的酶標(biāo)板用PBST洗板，加入封閉液，在35~39°C封閉；
S3.加樣:將步驟S2所得的酶標(biāo)板棄液清洗，將待檢血清稀釋并加入到清洗后的酶標(biāo)板中，反應(yīng)；
S4.加入酶標(biāo)抗體:將HRP標(biāo)記的0RF3單克隆抗體稀釋加入到步驟S3所得的酶標(biāo)板中，反應(yīng)；
S5.顯色:將底物加入到步驟S4所得酶標(biāo)板中，顯色反應(yīng)；
S6.終止及測定:在步驟S5所得的酶標(biāo)板中加入終止液，測定0D490nm值。
[0007]優(yōu)選地，該單抗阻斷ELISA法包括以下步驟:
S1.包被抗原:用包被液將0RF3重組蛋白稀釋至0.5^10 μ g/100 μ L，以每孔100 μ L的量加入酶標(biāo)板孔中，4°C靜置12h ;同時設(shè)置抗原空白對照孔；
52.封閉:棄去板孔中的液體，PBST洗板5次，每次3min，每孔加入封閉液200μ L，37°C作用I~4h ；
53.加樣:棄去板孔中的液體、洗板，待檢血清事先以待檢血清與PBST按l:fl:200的體積比例進(jìn)行稀釋，然后向酶標(biāo)板每孔中加入稀釋后的待檢血清100 μ L，37 °C作用60min ；
54.加入酶標(biāo)抗體:棄去板孔中的液體、洗板，每孔加入HRP標(biāo)記的ORF3單克隆抗體100 μ L，HRP標(biāo)記的ORF3單克隆抗體事先用PBST稀釋至濃度為10-7~l(r3mg/mL，37°C作用60 min ；
55.顯色:棄去板孔中的液體、洗板，每孔加入底物溶液lOOyL，室溫避光作用10-25
min ；
56.終止及測定:每孔加入211101/1^2304 5(^1^終止反應(yīng)，測定OD490nm值，記錄結(jié)果。
[0008]優(yōu)選地，SI中包被液為pH=9.6,0.05mol/L碳酸鹽緩沖液，0RF3重組蛋白被包被液稀釋至 1 μ g/100 μ Lo
[0009]優(yōu)選地，S2中封閉液為2% BSA,封閉的作用時間為此。
[0010]優(yōu)選地，S2中待檢血清事先用以待檢血清與PBST按1:10的體積比例進(jìn)行稀釋，S3中HRP標(biāo)記的0RF3單克隆抗體事先用PBST稀釋至濃度為10_5mg/mL。
[0011]優(yōu)選地，S5中底物溶液為TMB底物溶液，顯色的作用時間為20min。
[0012]優(yōu)選地,還包括步驟S7:
57.根據(jù)步驟S6測定的0D490nm值，將計算阻斷率，當(dāng)阻斷率≤53.1時，判斷為陽性；當(dāng)阻斷率≥58.3，判斷為陰性；當(dāng)53.1〈阻斷率〈58.3時，判定為疑似，需要重新檢查一次。
[0013]根據(jù)需求在提供一種上述的戊型肝炎病毒抗體檢驗(yàn)通用ELISA法在人或動物戊型肝炎病毒抗體檢驗(yàn)試劑中的應(yīng)用。
[0014]根據(jù)需求在提供一種上述的戊型肝炎病毒抗體檢驗(yàn)通用ELISA法的應(yīng)用，其特征在于，用于人、豬戊型肝炎病毒抗體的檢驗(yàn)。
[0015]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:
1.HEV屬于單股正鏈RNA病毒,是戍肝病毒屬的唯一成員。該病毒具有一個7.2 kb的基因組，含有三個開放閱讀框(ORFs)，分別為編碼具有復(fù)制功能的多聚蛋白的0RF1、編碼病毒衣殼蛋白的0RF2以及編碼具有調(diào)節(jié)細(xì)胞蛋白激酶活性的0RF3。其中0RF3蛋白質(zhì)量最小，可作為靶蛋白進(jìn)行抗體的檢測。氨基酸序列分析表明，HEV 0RF3比較保守，基因IV型人源HEV 0RF3和豬源HEV 0RF3之間的相似性在91.1%_93.9%之間。因此本研究選用0RF3蛋白作為診斷分子進(jìn)行人、豬HEV陽性血清的檢測。
[0016]2.ELISA作為常用的檢測方法具有靈敏、快速、特異、高通量等特點(diǎn)。本研究選用單抗阻斷ELSIA方法，該方法還具有以下特征:可減少包被抗原中雜蛋白對結(jié)果的干擾，減少非特異性結(jié)果的出現(xiàn)；單抗與抗原的結(jié)合具有高度均質(zhì)性和較強(qiáng)的特異性，對陽性血清可以產(chǎn)生穩(wěn)定的阻斷效果；檢測包括人在內(nèi)的多種種屬動物血清時，避免更換二抗。
[0017]3.本研究以豬源HEV 0RF3重組蛋白作為包被抗原，其單克隆抗體作為阻斷抗體，建立用于檢測人、豬甚至多種動物HEV陽性血清的、通用的阻斷ELISA方法，檢測方法的容錯率高。
[0018]4.本研究建立的單抗阻斷ELISA的優(yōu)化條件為:HEV 0RF3重組純化蛋白包被濃度為I μ g/100 μ L，封閉液封閉條件為37°C 2h，待檢血清稀釋倍數(shù)為1:10，阻斷用0RF3單克隆抗體濃度為10_5mg/mL,底物顯色條件為室溫避光20min。并采用了補(bǔ)正措施,臨界值判定標(biāo)準(zhǔn)為PI ( 53.1時，可以判斷為陽性；當(dāng)PI≥58.3判斷為陰性；當(dāng)53.1〈PI < 58.3
時，判定為疑似，需要重新檢查一次。
【具體實(shí)施方式】
[0019]下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、設(shè)備和方法為本【技術(shù)領(lǐng)域】常規(guī)市購的試劑、設(shè)備和常規(guī)使用的方法。
[0020]主要試劑
1.豬HEV0RF3重組蛋白
2.辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的豬HEV0RF3單克隆抗體為實(shí)驗(yàn)室制備，初始濃度為lmg/mL
3.包被液(pH9.6 0.05 mol/L 碳酸鹽緩沖液)=NaHCO3 0.586g, Na2CO3 0.318g，滅菌水200mL，ρΗ9.6
4.磷酸鹽緩沖液(PBS):NaCl 8.5g, NaH2PO4.Iffi2O 2.894g, KCl 0.26g, K2HPO40.261g，滅菌水 lL，pH7.2
5.封閉液:IOOmLPBS中含2g牛血清白蛋白(BSA)
6.PBST:1OOOmLPBS 中加入 0.5mL 的 Tween-20
7.四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物溶液(天根生化科技有限公司)，其他試劑為國產(chǎn)分析純
8.終止液(2mo I/L濃硫酸):濃硫酸22.2mL,蒸餾水177.8mL。
[0021]儀器設(shè)備及耗材
小型離心機(jī)、酶標(biāo)儀、移液器、96孔ELISA板(Coring)
實(shí)施例1
阻斷ELISA檢驗(yàn)方法的建立:
51.包被抗原:用包被液將0RF3蛋白稀釋至Iμ g/100 μ L,以每孔100 μ L的量加入酶標(biāo)板中，4°C靜置12h ;同時設(shè)置抗原空白對照孔；
52.封閉:棄去孔中液體，PBST洗板5次，每次3min，加入封閉液，每孔200μL，37°C作用 60 min ；
53.加入待檢血清:棄去孔中液體、洗板,加入待檢血清，每孔100μL，37°C作用60min ;同時設(shè)置待檢血清空白對照孔；
54.結(jié)合抗體:棄去孔中液體、洗板，加入HRP標(biāo)記的0RF3mAb，每孔lOOyL，37°C作用 60 min ；
55.顯色:棄去板孔中的液體、洗板，每孔加入底物溶液100μ L，室溫避光作用15 min ；
56.終止及測定:每孔加入2mo I/LH2SO4 50 μ L終止反應(yīng)，測定0D490nm值，記錄結(jié)果。
[0022]按公式計算阻斷率:
Percentage inhibition (PI) = (0D待檢血清空白對照-OD待檢血清)/ (0D待檢血清空白對照-OD抗原空白對
照)X100%。[0023]實(shí)施例2
檢驗(yàn)方法臨界值的判斷:
收集應(yīng)用商品化HEV檢驗(yàn)試劑盒(北京萬泰生物科技有限公司)檢驗(yàn)為陰性的100份血清樣品，用建立的阻斷ELISA檢驗(yàn)其阻斷率，計算平均值Cr)和標(biāo)準(zhǔn)差(S)，以確定結(jié)果判定的臨界值。
[0024]當(dāng)PI≤z +2s時，判定為陽性；
當(dāng)PI > Z +3s時，判定為陰性；
當(dāng)z +2s〈PI < X +3s時，判定為疑似，需要重新檢查一次。
結(jié)果表明z=42.7，^=5.2。因此當(dāng)PI ( 53.1時，可以判斷為陽性；當(dāng)PI≥58.3判斷為陰性；當(dāng)53.1〈PI < 58.3時，判定為疑似，需要重新檢查一次。
[0025]實(shí)施例3
最佳抗原包被量的確定
S1.包被抗原:用包被液將0RF3蛋白分別稀釋至0.5 μ g/100 μ LU μ g/100 μ L、5 μ g/100 μ LUOy g/100 μ L，以每孔100 μ L的量加入酶標(biāo)板中，4°C靜置12h ；
S2.封閉:棄去孔中液體，PBST洗板5次，每次3min，加入封閉液，每孔200μ L，37°C作用 60 min ；
S3.加入待檢血清:棄去孔中液體、洗板,加入待檢血清，每孔100μL，37°C作用60
min ；
S4.加入HRP標(biāo)記的mAb:棄去孔中液體、洗板，加入稀釋的HRP標(biāo)記的0RF3mAb，每孔100yL，37°C作用優(yōu)化后的時間；
S5.顯色:棄去板孔中的液體、洗板，每孔加入底物溶液100μ L，室溫避光作用15 min ；
S6.終止及測定:每孔加入2mol/LH2S04 50 μ L終止反應(yīng)，測定0D490nm值，記錄結(jié)果如表1。
[0026]表1抗原包被濃度優(yōu)化結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種戊型肝炎病毒抗體檢驗(yàn)通用ELISA法，其特征在于，所述通用ELISA法為單抗阻斷ELISA法，所述單抗阻斷ELISA法中使用豬戊型肝炎病毒的0RF3重組蛋白作為包被抗原。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的戊型肝炎病毒抗體檢驗(yàn)通用ELISA法，其特征在于，包括以下步驟: S1.包被抗原:用包被液將0RF3重組蛋白稀釋加入酶標(biāo)板孔中，靜置； S2.封閉:將步驟SI的酶標(biāo)板用PBST洗板，加入封閉液，在35~39°C封閉； S3.加樣:將步驟S2所的酶標(biāo)板棄液清洗，將待檢血清稀釋并加入到清洗后的酶標(biāo)板中，反應(yīng)； S4.加入酶標(biāo)抗體:將HRP標(biāo)記的0RF3單克隆抗體稀釋加入到步驟S3所得的酶標(biāo)板中，反應(yīng)； S5.顯色:將底物加入到步驟S4所得酶標(biāo)板中，顯色反應(yīng)； S6.終止及測定:在步驟S5所得的酶標(biāo)板中加入終止液，測定0D490nm值。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的戊型肝炎病毒抗體檢驗(yàn)通用ELISA法，其特征在于，包括以下步驟: S1.包被抗原:用包被液將0RF3重組蛋白稀釋至0.5^10 μ g/1OOmL,以每孔100 μ L的量加入酶標(biāo)板孔中，4°C靜置12h ;同時設(shè)置抗原空白對照孔； S2.封閉:棄去板孔中的液體，PBST洗板5次，每次3min，每孔加入封閉液200μ L，37°C作用1~4h ； S3.加樣:棄去板孔中的液體、洗板，事先將待檢血清與PBST按1:f 1:200的體積比例進(jìn)行稀釋，然后向酶標(biāo)板每孔中加入稀釋后的待檢血清100μ L，37°C作用60 min ； S4.加入酶標(biāo)抗體:棄去板孔中的液體、洗板，每孔加入HRP標(biāo)記的0RF3單克隆抗體100 μ L，HRP標(biāo)記的0RF3單克隆抗體事先用PBST稀釋至濃度為10-7~l(r3mg/mL，37°C作用60 min ； S5.顯色:棄去板孔中的液體、洗板，每孔加入底物溶液lOOyL，室溫避光作用10-25min ； S6.終止及測定:每孔加入2mol/LH2S04 50 μ L終止反應(yīng)，測定0D490nm值，記錄結(jié)果。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的戊型肝炎病毒抗體檢驗(yàn)通用ELISA法，其特征在于，SI中包被液為PH=9.6,0.05mol/L碳酸鹽緩沖液，0RF3重組蛋白被包被液稀釋至I μ g/100 μ L。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的戊型肝炎病毒抗體檢驗(yàn)通用ELISA法，其特征在于，S2中封閉液為2%BSA，封閉的作用時間為2h。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的戊型肝炎病毒抗體檢驗(yàn)通用ELISA法，其特征在于，S3中待檢血清事先將待檢血清與PBST按1:10的體積比例進(jìn)行稀釋，S4中HRP標(biāo)記的0RF3單克隆抗體事先用PBST將其濃度稀釋至10_5mg/mL。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的戊型肝炎病毒抗體檢驗(yàn)通用ELISA法，其特征在于，S5中底物溶液為TMB底物溶液，顯色的作用時間為20min。
8.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的戊型肝炎病毒抗體檢驗(yàn)通用ELISA法，其特征在于，還包括步驟S7: S7.根據(jù)步驟S6測定的0D490nm值，將計算阻斷率，當(dāng)阻斷率(53.1時，判斷為陽性；當(dāng)阻斷率≥58.3，判斷為陰性；當(dāng)53.1＜阻斷率＜58.3時，判定為疑似，需要重新檢查一次。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項所述的戊型肝炎病毒抗體檢驗(yàn)通用ELISA法在人或動物戊型肝炎病毒抗體檢驗(yàn)試劑中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項所述的戊型肝炎病毒抗體檢驗(yàn)通用ELISA法的應(yīng)用，其特征在于，用于人、豬戊型肝炎病毒抗體的檢驗(yàn)。
【文檔編號】G01N33/577GK103837681SQ201310556500
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2013年11月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月11日
【發(fā)明者】張桂紅, 王衡, 梁煥斌, 寧章勇, 古洪浪, 紀(jì)方曉 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)