專利名稱：戊型肝炎血清IgM抗體快速診斷試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)和生物學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，涉及用膠體金免疫層析法制備的戊型肝炎血清IgM抗體快速診斷試劑盒。
現(xiàn)有技術(shù)
戊型病毒性肝炎是發(fā)展中國家的一種主要急性散發(fā)型肝炎，全球分布，危害嚴(yán)重。其病原體戊型肝炎病毒(HEV)主要經(jīng)消化道傳播，是大小約27-34nm的單股正鏈無包膜的RNA病毒，基因組全長約7. 5kb，含3個(gè)開放讀碼框架(0RF1、 0RF2、 0RF3)，其中0RF2為編碼660個(gè)氨基酸的多肽，是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白。
隨著戊型肝炎病毒分子克隆技術(shù)的成功建立，HEV分子生物學(xué)的研究取得了極大進(jìn)展，與之相關(guān)的HEV檢測方法也正在不斷完善。該方法包括兩個(gè)方面，即采用基因工程重組抗原建立的抗體診斷方法和采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)建立的基因診斷方法，分別檢測抗HEV抗體和HEV RNA。
利用體外表達(dá)的各種HEV重組蛋白，已建立了多種抗HEV檢測方法，包括酶聯(lián)免疫方法ELISA (enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)禾口蛋白印跡技術(shù)WB (westernbloting， WB)等用于HEV感染的臨床診斷和實(shí)驗(yàn)研究。
采用WB法檢測血清抗HEV，其特異性要比ELISA法高，可用來作為戊型肝炎的確診手段。該法是用HEV重組多肽電泳后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用于檢測血清中的抗HEV抗體。但WB法操作技術(shù)相對較為復(fù)雜，檢測所需時(shí)間較長，主要用于戊型肝炎的實(shí)驗(yàn)室研究。
早期的ELISA檢測試劑只用了0RF3抗原，靈敏度低，不久被包被了0RF3、 0RF2融合抗原的EIA試劑所取代，靈敏度和特異性均較好。該方法雖在一定程度上彌補(bǔ)了過去HEV血清抗體檢測方法的缺陷，但仍存在一些出于該方法本身的缺陷而無法解決的問題，如檢測時(shí)間長(2 — 3小時(shí))，步驟多(2 — 3步)，需特殊儀器(酶聯(lián)檢測儀)，須同時(shí)操作多人份血清，病人獲得檢測結(jié)果時(shí)間長等。
采用膠體金法，檢測戊型肝炎結(jié)果直觀(肉眼觀察)、快速(10 — 20分鐘出結(jié)果)、操作簡便、無需專用儀器和設(shè)備、可用于床旁檢驗(yàn)，復(fù)檢極為方便。本發(fā)明旨在為臨床診斷HEV感染以及HEV感染的流行病學(xué)調(diào)査提供一種快速、特異的診斷試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
為克服現(xiàn)有戊型肝炎抗體檢測技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種快速檢測戊型肝炎血清IgM抗體的試紙條。不需要任何儀器設(shè)備輔助的快速檢測試劑。本發(fā)明根據(jù)膠體金免疫層析技術(shù)特點(diǎn)和戊型肝炎0RF2/0RF3基因重組抗原系統(tǒng)特點(diǎn)，設(shè)計(jì)新的原材料，試劑和工藝流程，應(yīng)用本發(fā)明提供的試紙條檢測戊型肝炎血清IgM抗體水平，具有簡單，快速，靈敏和特異性好等特點(diǎn)，30分鐘以內(nèi)出結(jié)果，并且價(jià)格低，適用于基層檢測和臨床初篩。
本發(fā)明所述試紙條是由PVC底板(1)上依次接合吸水墊(2)、特定包被的硝酸纖維膜(3)、涂覆膠體金標(biāo)記戊型肝炎ORF2/ORF3基因重組抗原的玻璃纖維膠體金結(jié)合墊(6)、樣品墊(7)而組成的條形物。檢測樣品經(jīng)過樣品墊和結(jié)合墊再經(jīng)層析作用在NC膜上出現(xiàn)檢測線和質(zhì)控線，用肉眼判斷結(jié)果。在NC膜上僅僅出現(xiàn)一條質(zhì)控線，結(jié)果為陰性，在NC膜上同時(shí)出現(xiàn)檢測線和質(zhì)控線，結(jié)果為陽性性，不出現(xiàn)線條表示試紙條或測試卡失效。30分鐘內(nèi)出結(jié)果。
本發(fā)明所述試紙條吸水墊為一種濾紙，包括吸水紙和濾油紙，切成要求大小直接使用。貼在底板的末端，起吸水作用。
本發(fā)明所述試紙條上特定包被的NC膜是一種專門用于膠體金試紙條的材料，由一層濾膜和膠膜組成，成巻筒裝，NC膜上噴2條線，分別為檢測線和質(zhì)控線，檢測線噴涂的是鼠抗人-IgM(y鏈)，質(zhì)控線噴涂的是兔抗戊型肝炎ORF2/ORF3抗體；NC膜貼在底板的中間，兩端分別與結(jié)合墊和吸水墊連接。
本發(fā)明所述試紙條上結(jié)合墊為玻璃纖維紙，噴涂上膠體金標(biāo)記戊型肝炎基因重組ORF2/ORF3抗原，再37。C干燥，結(jié)合墊上與樣品墊銜接，下與NC膜銜接。
本發(fā)明所述試紙條樣品墊為玻璃纖維紙，用硼酸緩沖液浸泡處理，緩沖液PH為7.2，浸泡處理后，37。C干燥過夜，在試劑條中起過濾樣品的作用，位于結(jié)合墊上，貼在底板上。
本發(fā)明還提供上述試紙條在制備戊型肝炎血清IgM抗體診斷試紙條中的應(yīng)用，診斷試紙條還包括標(biāo)識條，此標(biāo)識條為兩個(gè)帶有標(biāo)識的不干膠紙，分別粘貼在試紙條的兩端，帶有箭頭端是貼在樣品墊和結(jié)合墊上，由此端浸入待測樣品，靠另一端的吸水墊的吸水作用，使樣品經(jīng)過NC膜。
本發(fā)明還提供上述試紙條在制備戊型肝炎ORF2/ORF3血清IgM抗體測試卡中的應(yīng)用，測試卡還包括塑料卡，此塑料卡是一個(gè)用塑料特制的卡，由上下2片組成，上下片可嵌合在一起，下片主要有一個(gè)放試紙條的槽和與上片結(jié)合的卡齒，上片主要包括一個(gè)檢測孔、 一個(gè)樣品孔以及與下片結(jié)合的卡齒，檢測孔旁邊分別印有T和C字樣，T表示檢測線的位置，C表示質(zhì)控線的位置，檢測孔是觀察結(jié)果的窗口，樣品孔是滴加樣品的位置。此塑料卡起保護(hù)試紙條的作用，并且更美觀，減少污染和保護(hù)操作者的安全。本發(fā)明所述試紙條的制備方法，包括如下步驟
1) 戊型肝炎基因重組0RF2/0RF3抗原自制或購買，分子量35kDa，純度10ug上樣SDS-PAGE—條帶。
2) 鼠抗人-IgM(y鏈)自制或購買。
3) 兔抗戊型肝炎ORF2/ORF3抗體通過戊型肝炎ORF2/ORF3免疫家兔，提取、純化兔血清制備。
4) 膠體金的制備
a量取一定量的洗液于潔凈的燒瓶中，煮沸5分鐘；b量取一定量的超純水于該燒瓶中，煮沸5分鐘；
c棄去超純水，稱取適量三蒸水于該燒瓶中，加熱至沸騰，加入適量1%氯金酸，加熱至沸騰；
d攪拌下加入6 10毫升1%檸檬酸三鈉，沸騰5-10分鐘；4)膠體金探針標(biāo)記
取膠體金100毫升，調(diào)節(jié)膠體金溶液PH值8.0，攪拌加入l毫升戊型肝炎基因重組ORF2/ORF3抗原，再緩慢加入1毫升10。/。BSA充分混勻，攪拌，離心棄上清，加入工作液溶解；5 )制備檢測弓形蟲血清IgM抗體的膠體金免疫試紙條
用噴涂機(jī)將標(biāo)記戊型肝炎基因重組ORF2/ORF3抗原的膠體金溶液噴在玻璃纖維膜上，37'C干燥；將制備好的試劑條板上NC膜用噴膜機(jī)分別噴上鼠抗人-IgM(y鏈)和質(zhì)控抗體(兔抗戊型肝炎ORF2/ORF3抗體)，噴完后37。C干燥過夜；將吸水墊、已包被的硝酸纖維膜、玻璃纖維膠體金結(jié)合墊、樣品墊依次粘于底板上，裁成細(xì)條，即成一種檢測戊型肝炎血清IgM抗體的膠體金免疫試紙條。
上述膠體金制備過程中，優(yōu)選三蒸水200毫升，氯金酸10毫升，檸檬酸三鈉7.5毫升。本發(fā)明的有益效果應(yīng)用本發(fā)明提供的試紙條檢測人體內(nèi)戊型肝炎血清IgM抗體水平，成本低廉，操作簡單、快速、靈敏，且特異性好，不需要特殊檢測儀器設(shè)備，因此可廣泛應(yīng)用于各級醫(yī)療檢驗(yàn)場所，尤其是基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)，包括鄉(xiāng)鎮(zhèn)衛(wèi)生院等均可開展。本發(fā)明有益于戊型肝炎血清IgM抗體篩査的普及，對于戊型肝炎的預(yù)防和治療有極為重要的意義。


圖l為本發(fā)明的結(jié)構(gòu)示意圖
1: PVC底板；2:吸水墊；3:特定包被的硝酸纖維膜；4:檢測線；5:質(zhì)控線；6:結(jié)合墊；7:樣品墊。
圖2為本發(fā)明的檢測結(jié)果示意圖
a:陽性；b:陰性；C:無效；4:檢測線；5:質(zhì)控線。圖3為本發(fā)明的試紙條外觀示意圖
a:樣本墊；b:結(jié)合墊；C:檢測線；d:質(zhì)控線；e:試紙條名稱圖4為本發(fā)明的測試卡外觀示意圖
a:樣本孔；b:測試孔；T:檢測線；C:質(zhì)控線。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，凡依照本發(fā)明公開內(nèi)容所作出的本領(lǐng)域等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例l:
戊型肝炎血清IgM抗體膠體金免疫試紙條制備方法，它包括如下步驟
1、 膠體金的制備
量取一定量的洗液于潔凈的250ml三角燒瓶中，煮沸5分鐘；量取一定量的超純水于該燒瓶中，煮沸5分鐘；棄去超純水，稱取200ml超純水于該燒瓶中，加熱至沸騰，加入1%氯金酸10ml，邊煮邊攪拌，加熱至沸騰；攪拌下加入l。/。檸檬酸三鈉10ml，沸水下快速攪拌，直到氯金酸溶液的顏色慢慢穩(wěn)定，呈紅色后，繼續(xù)沸騰5分鐘，制成小顆粒膠體金。
2、 制備檢測戊型肝炎血清IgM抗體的膠體金免疫試紙條
用噴涂機(jī)將標(biāo)記戊型肝炎基因重組0RF2/0RF3抗原的膠體金溶液噴涂在玻璃纖維膜上，37'C干燥；將制備好的試劑條板上NC膜用噴膜機(jī)分別噴上鼠抗人-IgM(y鏈)和質(zhì)控抗體(兔抗戊型肝炎0RF2/0RF3抗體)。噴完后37。C干燥過夜。將吸水墊、已包被的硝酸纖維膜、玻璃纖維膠體金結(jié)合墊、樣品墊依次粘于底板上，裁成細(xì)條，即成一種檢測戊型肝炎血清IgM抗體的膠體金免疫試紙條。
實(shí)施例2:
戊型肝炎血清IgM抗體的膠體金免疫診斷試紙條制備方法，它包括如下步驟將兩個(gè)帶有標(biāo)識的不干膠紙(標(biāo)識條)分別粘貼在實(shí)施例2中所制備試紙條的兩端，帶有箭頭端是貼在樣品墊和結(jié)合墊上，由此端浸入待測樣品，靠另一端的吸水墊的吸水作用，使樣品經(jīng)過NC膜。即成一種檢測戊型肝炎血清IgM抗體的膠體金免疫診斷試紙條。
見圖3。
實(shí)施例3:
戊型肝炎血清IgM抗體的膠體金免疫診斷測試卡制備方法，它包括如下步驟將實(shí)施例2中所制備試紙條放入塑料卡下片試紙條槽中，與上片嵌合，即成一種檢測同型半胱氨酸的膠體金免疫診斷測試卡，見圖4。此塑料卡是一個(gè)用塑料特制的卡，由上下2片組成，上下片可嵌合在一起，下片主要有一個(gè)放試紙條的槽和與上片結(jié)合的卡齒，上片主要包括一個(gè)檢測孔(見圖4b)、 一個(gè)樣品孔(見圖4a)以及與下片結(jié)合的卡齒，檢測孔旁邊分別印有T和C字樣，T表示檢測線的位置，C表示質(zhì)控線的位置，檢測孔是觀察結(jié)果的窗口，樣品孔是滴加樣品的位置。實(shí)施例4:
戊型肝炎血清IgM抗體免疫膠體金診斷層析試紙條使用方法
如圖3所示，將試紙條樣品墊插入待測液中，浸潤后取出，水平放置，約30分鐘后，僅在質(zhì)控線C處出現(xiàn)一條線，結(jié)果為陰性；在檢測線T和質(zhì)控線C處分別出現(xiàn)一條線，結(jié)果為陽性；不出現(xiàn)線條表示測試條失效。
實(shí)施例5:
戊型肝炎血清IgM抗體免疫膠體金診斷層析測試卡使用方法
如圖4所示，將樣本加入樣本孔a，加樣量75微升 80微升，水平放置，約30分鐘后，僅在測試孔b的質(zhì)控線C處出現(xiàn)一條線，結(jié)果為陰性；在測試孔b的檢測線T和質(zhì)控線C處分別出現(xiàn)一條線，結(jié)果為陽性；不出現(xiàn)線條表示測試卡失效。
權(quán)利要求
1.一種檢測戊型肝炎血清IgM抗體的免疫膠體金層析試紙條，其特征在于所述試紙條是由PVC底板(1)上的依次接合吸水墊(2)、特定包被的硝酸纖維膜(NC膜)(3)、NC膜上有檢測線(4)和質(zhì)控線(5)，噴涂膠體金標(biāo)記戊型肝炎基因重組ORF2/ORF3抗原的玻璃纖維膠體金結(jié)合墊(6)、樣品墊(7)而組成的條形物。1、所述試紙條，其特征在于所述吸水墊(2)為一種濾紙，包括吸水紙和濾油紙；吸水墊貼在底板的末端。2、所述試紙條，其特征在于所述特定包被的NC膜(3)由一層濾膜和膠膜組成，NC膜上噴涂鼠抗人-IgM(μ鏈)和兔抗戊型肝炎基因重組ORF2/ORF3抗原；NC膜貼在底板的中間，兩端分別與結(jié)合墊和吸水墊連接。3、所述試紙條，其特征在于所述結(jié)合墊(6)為玻璃纖維紙，噴涂上膠體金標(biāo)記的戊型肝炎基因重組ORF2/ORF3抗原，再37℃干燥，結(jié)合墊上與樣品墊銜接，下與NC膜銜接。4、所述試紙條，其特征在于所述樣品墊(7)為玻璃纖維紙，用硼酸緩沖液浸泡，緩沖液PH為7.2，浸泡處理后，37℃干燥過夜；樣品墊位于結(jié)合墊上。5、所述，在制備戊型肝炎血清IgM抗體診斷試紙條中的應(yīng)用，其特征在于診斷試紙條還包括標(biāo)識條，此標(biāo)識條為兩個(gè)帶有標(biāo)識的不干膠紙，分別粘貼在試紙條的兩端，帶有箭頭端是貼在樣品墊和結(jié)合墊上，由此端浸入待測樣品，靠另一端的吸水墊的吸水作用，使樣品經(jīng)過NC膜。6、所述，在制備戊型肝炎血清IgM抗體測試卡中的應(yīng)用，其特征在于測試卡還包括塑料卡，此塑料卡是一個(gè)用塑料特制的卡，由上下2片組成，上下片可嵌合在一起，下片主要有一個(gè)放試紙條的槽和與上片結(jié)合的卡齒，上片主要包括一個(gè)檢測孔、一個(gè)樣品孔以及與下片結(jié)合的卡齒，檢測孔旁邊分別印有T和C字樣，T表示檢測線的位置，C表示質(zhì)控線的位置，檢測孔是觀察結(jié)果的窗口，樣品孔是滴加樣品的位置。
2.一種檢測戊型肝炎血清IgM抗體的免疫膠體金層析試紙條的制備方法，包括如下步驟，1、 戊型肝炎基因重組0RF2/0RF3抗原自制或購買，分子量約52kDa，純度10ug上 樣SDS-PAGE—條帶。，2、 鼠抗人-IgM(y鏈)自制或購買。，3、 兔抗戊型肝炎基因重組ORF2/ORF3抗體制備通過免疫家兔戊型肝炎基因重組 ORF2/ORF3抗原，提取兔抗血清，純化后得到兔抗戊型肝炎基因重組ORF2/ORF3抗體。，4、 膠體金的制備a量取一定量的洗液于潔凈的燒瓶中，煮沸5分鐘； b量取一定量的超純水于該燒瓶中，煮沸5分鐘；c棄去超純水，稱取適量三蒸水于該燒瓶中，加熱至沸騰，加入適量1%氯金酸，加熱 至沸騰；d攪拌下加入6 10毫升1%檸檬酸三鈉，沸騰5-10分鐘；，5、 膠體金探針標(biāo)記取膠體金100毫升，調(diào)節(jié)膠體金溶液PH值8.0，攪拌加入l毫升戊型 肝炎基因重組ORF2/ORF3抗原，再緩慢加入1毫升10。/。BSA充分混勻，攪拌，離心棄上清，加入 工作液溶解；，6、 制備檢測弓形蟲血清IgM抗體的膠體金免疫試紙條用噴涂機(jī)將標(biāo)記戊型肝炎基因重 組ORF2/ORF3抗原的膠體金溶液噴涂在玻璃纖維膜上，37。C干燥；將制備好的試劑條板上NC 膜用噴膜機(jī)分別噴上鼠抗人-IgM(y鏈)和質(zhì)控抗體(兔抗戊型肝炎基因重組ORF2/ORF3抗體)，噴完后37'C干燥過夜；將吸水墊、已包被的硝酸纖維膜、玻璃纖維膠體金結(jié)合墊、樣品 墊依次粘于底板上，裁成細(xì)條，即成一種檢測戊型肝炎血清IgM抗體的膠體金免疫試紙條。第4項(xiàng)所述制備方法，其特征在于4)步中所述三蒸水為200毫升，所述1%氯金酸為10 毫升，所述檸檬酸三鈉為7.5毫升。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)和生物學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，涉及用膠體金免疫層析法制備的戊型肝炎血清IgM抗體快速診斷試劑盒。檢測戊型肝炎血清IgM抗體免疫膠體金檢測試紙條及其制備方法。該試紙條是由PVC底板(1)上的依次接合吸水墊(2)、特定包被的硝酸纖維膜(NC膜)(3)、NC膜上有檢測線(4)和質(zhì)控線(5)，噴涂膠體金標(biāo)記戊型肝炎病毒基因重組ORF2/ORF3抗原的玻璃纖維膠體金結(jié)合墊(6)、樣品墊(7)而組成的條形物。應(yīng)用本發(fā)明所提供的試紙條檢測人血清中弓形蟲IgM抗體水平，具有操作簡單、快速、靈敏和特異性好等特點(diǎn)，操作人員無需專業(yè)培訓(xùn)，按說明書即可完成操作，具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號G01N33/576GK101650367SQ200910304169
公開日2010年2月17日 申請日期2009年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月9日
發(fā)明者呂傳臣, 晟 周, 馬運(yùn)國 申請人:北京現(xiàn)代高達(dá)生物技術(shù)有限責(zé)任公司