包含禽戊型肝炎病毒orf3蛋白抗原區(qū)的重組蛋白及其制備和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于禽戊型肝炎病毒抗體檢測領(lǐng)域，具體涉及一種禽戊型肝炎病毒ORF3 蛋白一個抗原區(qū)的氨基酸序列，及包含該抗原區(qū)的原核表達的兩段重組截短禽ORF3蛋 白，還涉及上述兩段重組蛋白在體外血清學(xué)檢測禽HEV抗體的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 禽戊型肝炎病毒（HepatitisEvirus,HEV)是雞大肝大脾?。˙igliverand spleendisease，BLS)和肝炎脾大（Hepatitis-Splenomegaly，HS)綜合癥的主要病原。雞 BLS主要導(dǎo)致30?72周齡的蛋雞和肉種雞死淘率升高1?4%、產(chǎn)蛋率下降20?40%以 及種蛋孵化率降低10?30%。此外，禽HEV感染會使雞群處于亞健康狀態(tài)，當氣候和飼料 等外界環(huán)境改變或與其它病原混合感染時，極有可能導(dǎo)致雞群爆發(fā)HS綜合癥或BLS。禽HEV 感染在許多國家或地區(qū)雞群中的感染率達到30%以上，而且曾給澳大利亞的養(yǎng)禽業(yè)造成了 嚴重的經(jīng)濟損失。因此，禽HEV是危害養(yǎng)禽業(yè)，尤其是蛋雞和種禽養(yǎng)殖業(yè)的重要疾病之一。 在我國，由于禽的分離報道較晚，所以該病毒感染對我國養(yǎng)禽業(yè)造成的危害還沒有系 統(tǒng)的評價。
[0003] 禽HEV的基因組全長約為6. 6kb，比哺乳動物HEV基因組少600bp左右，除包含5' 帽子和3'PolyA結(jié)構(gòu)，還含有3個開放閱讀框（Openreadingframe，0RF)，分別為0RF1、 0RF2和0RF3,并且0RF3與0RF2部分重疊。其中ORFl最大，編碼病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白，包括甲 基化轉(zhuǎn)移酶、解螺旋酶和RNA依賴的RNA聚合酶等幾個功能區(qū)域；0RF2編碼病毒的主要結(jié) 構(gòu)蛋白--衣殼蛋白，含有病毒主要的抗原表位；最小的0RF3編碼一個小的磷酸化蛋白， 禽HEV感染雞只后能夠產(chǎn)生針對0RF3蛋白強烈的免疫應(yīng)答反應(yīng)，此外0RF3蛋白在病毒的 復(fù)制與感染過程中可能起著非常關(guān)鍵的作用。
[0004] 目前，禽HEV仍沒有合適高效的體外培養(yǎng)系統(tǒng)，對禽HEV感染的診斷更多的是通 過病毒核酸和抗體的檢測。迄今，已利用禽0RF2蛋白C端268個氨基酸建立了禽HEV 的抗體檢測的ELISA實驗室診斷方法。但是目前仍沒有一個其它的方法去佐證該方法的正 確性。此外，對人HEV不同的血清學(xué)診斷方法比較發(fā)現(xiàn)，人HEV不同抗原（0RF2和0RF3蛋 白）對HEV抗體的檢測存在較大的偏差，結(jié)果一致性差。因此，分析禽HEV0RF3蛋白的抗 原性以及利用該蛋白建立禽抗體檢測的方法就顯得非常必要，但是目前仍沒有關(guān)于禽 HEV0RF3蛋白抗原區(qū)的分析以及利用該抗原區(qū)檢測血清中禽HEV抗體的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供包含禽戊型肝炎病毒0RF3蛋白抗原區(qū)的重組 蛋白及其制備和應(yīng)用，提示重組蛋白可以用于禽抗體的檢測，佐證以禽HEV0RF2蛋白為 包被抗原血清檢測結(jié)果，在禽戊型肝炎病毒的血清學(xué)診斷方面具有良好的應(yīng)用前景。
[0006] 本發(fā)明所需要解決的技術(shù)問題，可以通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：
[0007] 本發(fā)明的一種包含禽戊型肝炎病毒ORF3蛋白抗原區(qū)的重組蛋白ORF3-2,其為禽 戊型肝炎病毒ORF3蛋白的28-87個氨基酸，其氨基酸序列如SEQIDNo: 2所示，具體為LL CAAGCQGAPKRSQPEAGAVNAAVITQPSGALNNAPKEPSAPPLLPTLSPRQVLARYQM;所述的含禽戊型肝炎 病毒0RF3蛋白抗原區(qū)，其位于0RF3蛋白C端區(qū)域74-87個氨基酸之間，氨基酸序列如SEQ IDNo: 1 所示，具體為PTLSPRQVLARYQM。
[0008] 本發(fā)明的一種包含禽戊型肝炎病毒0RF3蛋白抗原區(qū)的重組蛋白0RF3-3,其為 禽戊型肝炎病毒0RF3蛋白55-87個氨基酸，其氨基酸序列如SEQIDNo:3所示，具體為 QPSGALNNAPKEPSAPPLLPTLSPRQVLARYQM;所述的含禽戊型肝炎病毒0RF3蛋白抗原區(qū)，其 位于0RF3蛋白C端區(qū)域74-87個氨基酸之間，氨基酸序列如SEQIDNo: 1所示，具體為 PTLSPRQVLARYQM。
[0009] 本發(fā)明的上述重組蛋白的制備方法，包括：
[0010] (1)重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建：
[0011] 依據(jù)0RF3-2或0RF3-3蛋白氨基酸區(qū)域?qū)?yīng)的0RF3基因的核苷酸序列分別設(shè)計 引物，并在上下游引物的5'端引入BamHI和EcoRI酶切位點；
[0012] 采用Trizol法從CaHEV懸液中提取RNA，然后以RNA為模板，傳統(tǒng)的RT-PCR 方法得到基因目的序列，然后將擴增目的基因的PCR產(chǎn)物與pGEX-6p-l載體，同時用 BamHI和EcoRI進行雙酶切，T4連接酶連接，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pGEX-6p-0RF3-2或 pGEX-6p-0RF3-3；
[0013] (2)重組蛋白的原核表達與純化
[0014] 將重組表達質(zhì)粒pGEX-6p-0RF3-2或pGEX-6p-0RF3-3轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達宿主菌 BL21 (DE3)中，加入IPTG(異丙基-0-D-硫代吡喃半乳糖苷）誘導(dǎo)表達，最后收集菌液，超 聲裂解離心后，SDS-PAGE鑒定蛋白的表達。
[0015] 步驟⑴中所述的pGEX-6p-l載體中包含GST標簽，目的蛋白與GST蛋白融合表 達。
[0016] 步驟（1)中所述的引物為：
[0017] 0RF3-2-F CG GGATCC TTGCTATGTGCTGCGG，
[0018] 0RF3-2-R CG GAATTC CTACATCTGGTACCGTGCGA ；
[0019]或0RF3-3-F CG GGATCC CAGCCCAGTGGAGCG，
[0020] 0RF3-3-RCGGAATTCCTACATCTGGTACCGTGCGA。
[0021] 步驟⑵中所述的IPTG的用量為ImM。
[0022] 本發(fā)明的重組蛋白0RF3-2或0RF3-3應(yīng)用于檢測臨床雞血清中是否含有禽HEV 抗體，其具體操作采用Westernblot方法，包括：將表達純化的0RF3-2或0RF3-3蛋白，經(jīng) SDS-PAGE(12%聚丙烯酰胺凝膠）后，利用半干轉(zhuǎn)膜法將抗原轉(zhuǎn)至PVDF膜上，封閉過夜后洗 膜，然后SPF雞陰性血清與臨床雞血清（血清稀釋度為1:100)與膜室溫孵育lh，洗膜后，將 膜與HRP標記的兔抗雞二抗（1:5000)室溫孵育lh，最后用DAB顯色液避光顯色10min。
[0023] 本發(fā)明的重組蛋白0RF3-2或0RF3-3應(yīng)用于制備檢測臨床雞血清中是否含有禽 HEV抗體的試劑或試劑盒。
[0024] 本發(fā)明提供一個禽HEV 0RF3蛋白抗原區(qū)的氨基酸序列，提供兩段包含上述抗原 區(qū)的重組截短禽HEV 0RF3蛋白的原核表達方法，以上述包含抗原區(qū)的兩段蛋白為抗原， Westernblot方法檢測臨床雞血清中的禽HEV抗體。
[0025] (1)-個禽戊型肝炎病毒0RF3蛋白的抗原區(qū)，其位于蛋白的C端區(qū)域74-87個氨 基酸之間，氨基酸序列為PTLSPRQVLARYQM(SEQ IDNo:l)。
[0026] (2)兩段重組截短的包含上述抗原區(qū)的重組0RF3蛋白，分別命名為0RF3-2和 0RF3-3。其中0RF3-2包含的區(qū)域為0RF3蛋白的28-87個氨基酸之間，其氨基酸序列為LLC AAGCQGAPKRSQPEAGAVNAAVTTQPSGALNNAPKEPSAPPLLPTLSPRQVLARYQM(SEQIDNo:2) ；0RF3-3 蛋白包含的區(qū)域為0RF3蛋白55-87個氨基酸之間，其氨基酸序列為QPSGALNNAPKEPSAPPLL PTLSPRQVLARYQM(SEQIDNo:3)〇
[0027] (3)利用上述表達純化的兩種重組蛋白為抗原，Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，上述兩 種蛋白可以與臨床上禽戊型肝炎病毒抗體陽性雞血清發(fā)生強烈反應(yīng)，而與陰性雞血清不反 應(yīng)。
[0028] 本發(fā)明技術(shù)方案的詳細描述：
[0029] 利用DNAStar軟件程序包（Lasergene7. 0)的Protean程序分析禽戊型肝炎病毒 中國分離株（HepatitisEvirus,HEV,CaHEV,GenBanknumberGU954430)0RF3 蛋白氨基酸 序列（SEQIDN〇:4)的抗原性和親疏水性（圖1)。依據(jù)其分析結(jié)果，將0RF3蛋白設(shè)計成5 段相互重疊包含預(yù)測的不同抗原區(qū)或不同抗原區(qū)組合的蛋白，分別命名為0RF3-l，0RF3-2， 0RF3-3, 0RF3-4和0RF3-5,其所包含的0RF3蛋白的氨基酸區(qū)域見圖1。
[0030] 依據(jù)5段蛋白氨基酸區(qū)域?qū)?yīng)的0RF3基因的核苷酸序列（SEQIDN〇:5)分別設(shè) 計引物，引物序列見表1(SEQIDNo:6-15)，同時在上下游引物的5'端引入BamHI和EcoRI 酶切位點。RT-PCR擴增得到目的基因后，將其與原核表達載體pGEX-6p-l(GEHealthcare) 同時進行BamHI和EcoRI雙酶切，然后T4連接酶連接，構(gòu)建重組原核表達質(zhì)粒。酶切鑒定的 陽性重組質(zhì)粒PGEX-0RF3-1，-2, -3, -4, -5 (圖2)轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達宿主菌BL21 (DE3)。挑 取單個菌落接種5mlLB培養(yǎng)基，OD6tltlmi達到0.4-0. 6時，加入ImMIPTG誘導(dǎo)表達，225rpm， 25°C，誘導(dǎo)6小時，收集菌液，超聲裂解離心后，沉淀和上清分別進行SDS-PAGE鑒定蛋白的 表達。大量表達后利用GST填料純化表達的蛋白（圖3)。利用抗GST單抗為一抗，Western blot鑒定重組融合蛋白的正確表達（圖4)。
[0031] 利用禽HEV抗體陽性雞血清，間接ELISA和Western blot檢測陽性雞血清與 5段蛋白的反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)禽HEV陽性雞血清與0RF3-2, -3蛋白發(fā)生強烈的免疫反應(yīng)