，而與 0RF3-1，-4,-5蛋白不反應(yīng)（圖5)，依據(jù)5段蛋白重疊區(qū)域，鑒定0RF3蛋白C端區(qū)域74-87 個(gè)氨基酸為抗原區(qū)，其氨基酸序列為PTLSPRQVLARYQM(SEQ IDN〇:l)。然后以純化的0RF3-2 和0RF3-3蛋白為抗原，SDS-PAGE后利用半干法轉(zhuǎn)膜，2. 5%的脫脂奶粉37°C封閉2小時(shí)后， 將膜與臨床雞血清室溫孵育lh，PBST洗膜后，與HRP標(biāo)記的羊抗雞二抗孵育，DAB顯色，發(fā) 現(xiàn)這兩段蛋白可以用于禽感染的血清學(xué)診斷。
[0032] 本發(fā)明利用上述表達(dá)的重組蛋白為檢測(cè)抗原，禽HEV抗體陽(yáng)性雞血清為一抗，HRP 標(biāo)記的羊抗雞為二抗，間接ELISA和Western blot鑒定禽HEV 0RF3蛋白的一個(gè)抗原區(qū)，其 位于0RF3蛋白78-84氨基酸之間，氨基酸序列為PTLSPRQVLARYQM(SEQ ID No: 1)。同時(shí)利 用Western blot方法分析了包含該抗原區(qū)的兩段蛋白0RF3-2和0RF3-3在臨床禽HEV感 染血清學(xué)診斷中的應(yīng)用。
[0033] 有益效果：
[0034] (1)本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)禽戊型肝炎病毒ORF3蛋白的抗原區(qū)，該抗原區(qū)可以與禽 戊型肝炎病毒陽(yáng)性雞血清發(fā)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，從而可以利用該抗原區(qū)血清學(xué)診斷雞是否 感染禽戊型肝炎病毒。
[0035] (2)本發(fā)明利用包含上述抗原區(qū)重組截短的ORF3蛋白ORF3-2和ORF3-3為抗原， SDS-PAGE后轉(zhuǎn)膜，與臨床雞血清孵育，能夠檢測(cè)雞血清中的禽HEV抗體；提示該兩段蛋白可 以用于禽抗體的檢測(cè)，佐證以禽HEVORF2蛋白為包被抗原血清檢測(cè)結(jié)果，在禽戊型肝炎 病毒的血清學(xué)診斷方面具有良好的應(yīng)用前景。
【附圖說(shuō)明】
[0036]圖1利用DNAStar軟件Protean程序的Kyte - Doolittle and Jameson - Wolf方 法分析禽0RF3蛋白的親疏水性和抗原性；依據(jù)分析結(jié)果設(shè)計(jì)了5段截短的相互重疊的 包含預(yù)測(cè)不同抗原區(qū)的0RF3蛋白；
[0037] 圖2構(gòu)建包含5段片段基因重組質(zhì)粒的酶切鑒定；
[0038] 圖3SDS-PAGE鑒定5段截短相互重疊重組蛋白的表達(dá)和純化；
[0039] 圖4Westernblot鑒定5段重組蛋白的表達(dá)；
[0040] 圖5Westernblot分析禽HEV陽(yáng)性雞血清與5段重組0RF3蛋白的免疫學(xué)反應(yīng)。
【具體實(shí)施方式】
[0041] 下面結(jié)合附圖進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施例。
[0042] 下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，如《分子克?。簩?shí) 驗(yàn)室手冊(cè)》（NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的條件或廠 商提供的條件進(jìn)行。需要說(shuō)明的是，本實(shí)施例中所提供的圖示僅以示意方式說(shuō)明本發(fā)明的 基本構(gòu)想，遂圖式中僅顯示與本發(fā)明中有關(guān)的組件而非按照實(shí)際實(shí)施時(shí)的組件數(shù)目、形狀 及尺寸繪制，其實(shí)際實(shí)施時(shí)各組件的型態(tài)、數(shù)量及比例可為一種隨意的改變，且其組件布局 型態(tài)也可能更為復(fù)雜。
[0043] 實(shí)施例1
[0044] 禽HEV0RF3蛋白抗原區(qū)的預(yù)測(cè)及包含不同預(yù)測(cè)抗原區(qū)重組截短蛋白的設(shè)計(jì)
[0045] 利用DNAStar軟件Protean程序分析禽戊型肝炎病毒中國(guó)分離株（HepatitisE virus,HEV,CaHEV,GenBanknumber⑶954430)全長(zhǎng)0RF3蛋白的抗原性和親疏水性。將 CaHEV0RF3蛋白的氨基酸序列（SEQIDNo:4)帶入Protean程序中，抗原性分析采用程序 中的Jameson-Wolf方法，而親疏水性分析采用Kyte-Doolittle方法。預(yù)測(cè)禽HEV0RF3蛋 白主要含有四個(gè)抗原區(qū)（圖1)。根據(jù)抗原區(qū)的分布，設(shè)計(jì)5段相互重疊包含不同預(yù)測(cè)抗原 區(qū)的0RF3蛋白0RF3-1，-2, -3, -4和-5。0RF3-1蛋白包含抗原I，II和III區(qū)，0RF3-2包 含抗原II，III和IV區(qū)，0RF3-3包含抗原III和IV區(qū)，0RF3-4包含抗原II區(qū)，0RF3-5包 含抗原III區(qū)（圖1)。
[0046] 實(shí)施例2
[0047] 5段截短的相互重疊禽HEV 0RF3蛋白（0RF3-l，-2，-3，-4和-5)的原核表達(dá)與純 化
[0048] (1)重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
[0049] 依據(jù)編碼上述5段蛋白的核苷酸序列，分別設(shè)計(jì)引物（表I)，并在上下游引物的 5'端引入BamHI和EcoRI酶切位點(diǎn)。Trizol法從CaHEV懸液中提取RNA，然后以RNA為模板， 傳統(tǒng)的RT-PCR方法得到5段基因目的序列，然后將擴(kuò)增目的基因的PCR產(chǎn)物與pGEX-6p-l 載體（包含GST標(biāo)簽，目的蛋白與GST蛋白融合表達(dá)）同時(shí)用BamHI和EcoRI進(jìn)行雙酶切， T4連接酶連接，構(gòu)建分別包含5段基因的重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6p-0RF3-l，-2,-3,-4,-5。將 重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定后分別得到了目的基因片段225bp，183bp，102bp，81bp和60bp和載體 片段4900bp(圖2)。重組陽(yáng)性質(zhì)粒測(cè)序后，其與GenBank上CaHEV0RF3核苷酸序列比對(duì)同 源性100%，說(shuō)明成功構(gòu)建了包含目的基因的重組原核表達(dá)載體。
[0050] 表1擴(kuò)增5段編碼截短相互重疊的禽HEV 0RF3蛋白基因序列的引物
[0051]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種包含禽戊型肝炎病毒0RF3蛋白抗原區(qū)的重組蛋白0RF3-2,其為禽戊型肝炎病 毒0RF3蛋白的28-87個(gè)氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID No:2所示，具體為L(zhǎng)LCAAGCQGAPK RSQPEAGAVNAAVTTQPSGALNNAPKEPSAPPLLPTLSPRQVLARYQM ； 所述的含禽戊型肝炎病毒0RF3蛋白抗原區(qū)，其位于0RF3蛋白C端區(qū)域74-87個(gè)氨基 酸之間，氨基酸序列如SEQ ID No: 1所示，具體為PTLSPRQVLARYQM。
2. -種包含禽戊型肝炎病毒0RF3蛋白抗原區(qū)的重組蛋白0RF3-3,其為禽戊型肝炎病 毒0RF3蛋白55-87個(gè)氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID No:3所示，具體為QPSGALNNAPKEPS APPLLPTLSPRQVLARYQM ； 所述的含禽戊型肝炎病毒0RF3蛋白抗原區(qū)，其位于0RF3蛋白C端區(qū)域74-87個(gè)氨基 酸之間，氨基酸序列如SEQ ID No: 1所示，具體為PTLSPRQVLARYQM。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的重組蛋白的制備方法，包括： (1) 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建： 依據(jù)0RF3-2或0RF3-3蛋白氨基酸區(qū)域?qū)?yīng)的0RF3基因的核苷酸序列分別設(shè)計(jì)引物， 并在上下游引物的5'端引入BamHI和EcoRI酶切位點(diǎn)； 采用Trizol法從禽戊型肝炎病毒中國(guó)分離株病毒CaHEV懸液中提取RNA，然后以 RNA為模板，傳統(tǒng)的RT-PCR方法得到基因目的序列，然后將擴(kuò)增目的基因的PCR產(chǎn)物與 pGEX-6p-l載體，同時(shí)用BamHI和EcoRI進(jìn)行雙酶切，T4連接酶連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒 pGEX-6p-0RF3-2 或 pGEX-6p-0RF3-3 ; (2) 重組蛋白的原核表達(dá)與純化 將重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6p-0RF3-2或pGEX-6p-0RF3-3轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達(dá)宿主菌 BL21中，加入異丙基-β -D-硫代啦喃半乳糖苷誘導(dǎo)表達(dá)，最后收集菌液，超聲裂解離心后， SDS-PAGE鑒定蛋白的表達(dá)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組蛋白的制備方法，其特征在于，步驟（1)中所述的 pGEX-6p-l載體中包含GST標(biāo)簽，目的蛋白與GST蛋白融合表達(dá)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組蛋白的制備方法，其特征在于，步驟（1)中所述的引物 為： 0RF3-2-F CG GGATCC TTGCTATGTGCTGCGG， 0RF3-2-R CG GAATTC CTACATCTGGTACCGTGCGA ； 或 0RF3-3-F CG GGATCC CAGCCCAGTGGAGCG， 0RF3-3-R CG GAATTC CTACATCTGGTACCGTGCGA。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組蛋白的制備方法，其特征在于，步驟（2)中所述的異丙 基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷的用量為ImM。
7. 權(quán)利要求1或2所述的重組蛋白應(yīng)用于檢測(cè)臨床雞血清中是否含有禽HEV抗體。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組蛋白應(yīng)用于檢測(cè)臨床雞血清中是否含有禽HEV抗體，其 特征在于，其具體操作方法，包括：將表達(dá)純化的0RF3-2或0RF3-3蛋白，經(jīng)SDS-PAGE后，利 用半干轉(zhuǎn)膜法將抗原轉(zhuǎn)至PVDF膜上，封閉過(guò)夜后洗膜，然后SPF雞陰性血清與臨床雞血清 與膜室溫孵育lh，洗膜后，將膜與HRP標(biāo)記的兔抗雞二抗室溫孵育lh，最后用DAB顯色液避 光顯色lOmin。
9. 權(quán)利要求1或2所述的重組蛋白應(yīng)用于制備檢測(cè)臨床雞血清中是否含有禽HEV抗體 的試劑或試劑盒。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了兩種包含禽戊型肝炎病毒ORF3蛋白抗原區(qū)的重組蛋白及其制備和應(yīng)用，所述的重組蛋白的氨基酸序列分別如SEQ ID No:2和SEQ ID No:3所示，所述的含禽戊型肝炎病毒ORF3蛋白抗原區(qū)，其位于ORF3蛋白C端區(qū)域74-87個(gè)氨基酸之間，氨基酸序列如SEQ ID No:1所示。本發(fā)明的兩種蛋白可以用于禽HEV抗體的檢測(cè)，佐證以禽HEVORF2蛋白為包被抗原血清檢測(cè)結(jié)果，在禽戊型肝炎病毒的血清學(xué)診斷方面具有良好的應(yīng)用前景。
【IPC分類】G01N33-68, G01N33-569, C12N15-70, C07K14-08
【公開(kāi)號(hào)】CN104610437
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410690742
【發(fā)明人】趙欽, 周恩民, 孫亞妮
【申請(qǐng)人】西北農(nóng)林科技大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年5月13日
【申請(qǐng)日】2014年11月26日