專(zhuān)利名稱(chēng)：禽流感病毒抗原檢測(cè)方法及其金標(biāo)快速診斷試劑盒和制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于診斷、檢測(cè)禽流感病毒抗原的方法，以及用于該方法的禽流感病毒抗原金標(biāo)快速診斷試劑盒和制備方法。
背景技術(shù)：
禽流感是由A型流感病毒引起的家禽或野禽的一種從呼吸病到嚴(yán)重?cái)⊙Y等多種癥狀的傳染性疾病綜合征，被國(guó)際獸醫(yī)局定為A類(lèi)傳染病，又稱(chēng)真性雞瘟或歐洲雞瘟，。除了禽類(lèi)，A型流感病毒還感染其它種屬的動(dòng)物，如馬、豬、等，1997年首次發(fā)現(xiàn)高致病性禽流感H5N1可感染人類(lèi)。自禽流感于1878年在意大利發(fā)現(xiàn)以來(lái)，以在世界大多數(shù)國(guó)家和地區(qū)流行，給養(yǎng)雞業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，歷史上危害最大，經(jīng)濟(jì)損失最嚴(yán)重的一次禽流感(H5N1)爆發(fā)于1983年美國(guó)濱州等地區(qū)，美國(guó)政府為此共花費(fèi)了6000多萬(wàn)美元，間接經(jīng)濟(jì)損失估計(jì)達(dá)3.49億美元。我國(guó)香港地區(qū)近期爆發(fā)的禽流感，據(jù)估計(jì)損失約達(dá)8000萬(wàn)港幣。
近年來(lái)高致病性的禽流感在全球范圍的頻繁爆發(fā)，使得禽流感不僅僅是一種單純的禽類(lèi)普通傳染病，而成為世界各國(guó)的政治經(jīng)濟(jì)事件，尤其是1997年首次發(fā)現(xiàn)高致病性禽流感H5N1可感染人類(lèi)以來(lái)，高致病性禽流感已對(duì)人類(lèi)的公共衛(wèi)生安全構(gòu)成了威脅。1997年及2003年在香港H5N1禽流感已感染18人，4人死亡，2003年年底開(kāi)始至今尚在亞洲國(guó)家流行的已有上百人感染，幾十人死亡。在經(jīng)歷去年SARS之后，人們已認(rèn)識(shí)到了高致病性禽流感潛在的危害性。
禽流感被發(fā)現(xiàn)100多年來(lái)，各國(guó)政府都十分重視禽流感的防治研究，我國(guó)也有專(zhuān)門(mén)的機(jī)構(gòu)研究禽流感。但A型流感病毒本身比較復(fù)雜，按照血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)表面抗原來(lái)區(qū)分，目前已發(fā)現(xiàn)了15種HA亞型和9種NA亞型，兩者組來(lái)共有數(shù)千種屬于許多不同抗原亞型的病毒，H5和H7各亞型主要應(yīng)起高致病性禽流感，另外，A型流感病毒還存在抗原性轉(zhuǎn)變和抗原性漂移的特點(diǎn)，這就使得禽流感的防治包括疫苗防治和檢測(cè)診斷有一定的難度。首先是疫苗的研制生產(chǎn)有時(shí)很難跟上病毒型的變化，其次是病毒型抗原比較復(fù)雜，檢測(cè)診斷優(yōu)其定型技術(shù)難度大、周期長(zhǎng)，難適應(yīng)目前高致病性禽流感防治要求。
本發(fā)明采用禽流感全病毒抗原免疫家兔或羊制備多表位抗體，免疫BALB/C小鼠制備單克隆抗體，研制一種可適用于現(xiàn)場(chǎng)操作的金標(biāo)快速診斷試劑盒，本試劑盒可特異性的檢測(cè)流感病毒抗原，而切快速(5-20分鐘出結(jié)果)，可用于發(fā)病現(xiàn)場(chǎng)快速診斷，在疫情控制中可幫助確定感染的范圍，用于口岸和市場(chǎng)檢疫可控制疫情的傳播。同時(shí)也可用于禽流感病毒感染人的檢測(cè)。
本發(fā)明的公開(kāi)本發(fā)明的第一目的是為了提供一種禽流感病毒抗原的檢測(cè)方法，該方法為一步法檢測(cè)方法，靈敏度高、特異性強(qiáng)而且速度快、操作簡(jiǎn)便，無(wú)需專(zhuān)門(mén)設(shè)備，適用于臨床檢測(cè)、流行病學(xué)調(diào)查和場(chǎng)地檢疫等多種場(chǎng)合。
本發(fā)明的第二目的是為了提供一種禽流感病毒抗原金標(biāo)快速診斷試劑盒，該試劑盒針對(duì)禽流感病毒抗原檢測(cè)提供一種簡(jiǎn)便而且直接的一步法檢測(cè)盒，利用該試劑盒檢測(cè)禽流感病毒抗原的靈敏度高、特異性強(qiáng)，而且速度快、操作簡(jiǎn)便，無(wú)需專(zhuān)門(mén)設(shè)施。
本發(fā)明的第三目的是為提供一種禽流感病毒抗原金標(biāo)快速診斷試劑盒的制備方法，該方法簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性好、重復(fù)性好。
本發(fā)明的第一目的可通過(guò)如下措施來(lái)實(shí)現(xiàn)一種禽流感病毒抗原檢測(cè)方法包括下述步驟(1)將膠體金標(biāo)記的抗禽流感病毒抗體載于玻璃纖維或無(wú)紡部布載體上并在與膠體金標(biāo)記抗體栽體相連的檢測(cè)栽體上包被抗禽流感病毒抗體形成的檢測(cè)線和由抗抗羊、兔或鼠IgG抗體形成的控制線(2)取雞氣管或肛門(mén)分泌物溶解液、血清或全血、肝脾等臟器提取液滴于膠體金標(biāo)記抗體的栽體上，如上述分泌物、血清、全血或臟器含有禽流感病毒抗原則在檢測(cè)載體上形成檢測(cè)線、控制線雙線為陽(yáng)性，否則為陰性。
本發(fā)明的第二目的可通過(guò)如下措施來(lái)實(shí)現(xiàn)一種禽流感病毒抗原金標(biāo)快速診斷試劑盒內(nèi)設(shè)禽流感病毒抗原金標(biāo)檢測(cè)板。
所述的禽流感病毒抗原金標(biāo)檢測(cè)板是在襯板上設(shè)有加樣端吸水層、檢測(cè)層和吸水端吸水層，在檢測(cè)層和吸水端吸水層之間設(shè)有金標(biāo)抗禽流感病毒抗體層在檢測(cè)層上包被有檢測(cè)線和控制線。
本發(fā)明的第三目的可通過(guò)如下措施來(lái)實(shí)現(xiàn)一種禽流感病毒抗原金標(biāo)快速診斷試劑盒的制備方法主要包括制備金標(biāo)抗體層和檢測(cè)層的控制線和檢測(cè)線的包被，然后在襯板上組合禽流感病毒抗原金標(biāo)測(cè)試條和檢測(cè)板。
所述的金標(biāo)抗體層的制備方法包括下述步驟i膠體金的制備在濃度為0.004-0.012％的氯金酸中加入其體積的1.3-2％、濃度為1-3％的擰檬酸三鈉，煮沸10-20分鐘，可得到15-50納米的膠體金溶液ii膠體金標(biāo)記抗禽流感病毒抗體，在膠體金溶液中用0.2m碳酸鉀溶液調(diào)pH8.0-8.4，按4-12mg/100ml加入禽流感病毒抗體，交拌后，再在溶液中按0.1-0.6g/100ml加入動(dòng)物血清蛋白，4℃靜置2-4小時(shí)iii將上述膠體金溶液經(jīng)2000轉(zhuǎn)/分鐘離心10-15分鐘，去沉淀物，得上清液iv將上清液經(jīng)10000轉(zhuǎn)/分鐘離心60-80分鐘離心得沉淀物v將沉淀物按4-10ml0ml溶于0.02M Ph7.4Tris-Hcl緩沖液得膠體金溶液該緩沖液中含0.2-0.6％的動(dòng)物血清蛋白和0.01-0.06％疊氮鈉vi將膠體金溶液浸入玻璃纖維或無(wú)紡步至液體開(kāi)始滲出為止而形成金標(biāo)抗體層。
所述膠體金標(biāo)記抗體為羊或兔抗禽流感病毒抗體、禽流感病毒單克隆抗體。
所述的檢測(cè)層是在纖維素膜上設(shè)有禽流感病毒抗體構(gòu)成的檢測(cè)線和有抗羊、兔或鼠IgG抗體形成的控制線。其制備方法是濃度為0.8-2.4mg/ml的抗體溶液中加入1-3％的固定劑，再利用噴膜機(jī)將抗體噴在纖維素膜上，噴膜后37℃干燥，再用0.01ml pH7.0含10％小牛血清的PBS，在37℃下封閉30分鐘，0.01ml pH7.0的PBS漂洗，37℃干燥。
所述禽流感病毒抗體為羊或兔抗禽流感病毒抗體、禽流感病毒單克隆抗體。
本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有如下優(yōu)點(diǎn)1、本發(fā)明檢測(cè)、診斷禽流感病毒抗原的方法為一步法，具有較高的特異性和靈敏性，且操作簡(jiǎn)便，無(wú)需專(zhuān)門(mén)設(shè)施。
2、本發(fā)明的診斷試劑盒檢測(cè)禽流感病毒抗原時(shí)具有較高的特異性和靈敏性，檢測(cè)過(guò)程操作訊速、快捷、方便，適用于臨床檢驗(yàn)、流行病學(xué)調(diào)查和場(chǎng)地檢疫等多種場(chǎng)合，3、本發(fā)明的診斷試劑盒的制備方法簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性好、重復(fù)性好。
圖面說(shuō)明

圖1是發(fā)明檢測(cè)板的外觀結(jié)構(gòu)示意圖1-檢測(cè)板2-加樣孔3-觀察孔圖2是本發(fā)明檢測(cè)板的內(nèi)部結(jié)構(gòu)示意圖4-加樣端吸水層5-金標(biāo)抗體層6-控制線7-檢測(cè)線8-檢測(cè)層9-吸水端吸水層10-襯板本發(fā)明的實(shí)施方式本發(fā)明還將結(jié)合實(shí)施例作進(jìn)一步詳述實(shí)施例一一種禽流感病毒抗原檢測(cè)方法包括下述步驟(1)將膠體金標(biāo)記的抗禽流感病毒抗體載于玻璃纖維或無(wú)紡布載體上并在與膠體金標(biāo)記抗體栽體相連的檢測(cè)栽體上包被禽流感病毒抗體形成的檢測(cè)線和由兔、羊抗羊、兔IgG抗體形成的控制線(2)取雞氣管或肛門(mén)分泌物溶解液、血清或全血、肝脾等臟器提取液滴于膠體金標(biāo)記抗體的栽體上，如上述分泌物、血清、全血或臟器含有禽流感病毒抗原則在檢測(cè)載體上形成檢測(cè)線、控制線雙線為陽(yáng)性，否則為陰性。
參照?qǐng)D1，一種禽流感病毒抗原金標(biāo)快速診斷試劑盒內(nèi)設(shè)禽流感病毒抗原金標(biāo)檢測(cè)板1。
參照?qǐng)D2，所述的禽流感病毒抗原金標(biāo)檢測(cè)板1是在襯板10上設(shè)有加樣端吸水層4、檢測(cè)層8和吸水端吸水層9，在檢測(cè)層和吸水端吸水層9之間設(shè)有金標(biāo)禽流感病毒抗體層5在檢測(cè)層8上包被有檢測(cè)線7和控制線6。其中加樣端吸水層4和吸水端吸水層9由多層濾紙制成；檢測(cè)層8為纖維素膜，該纖維素膜可為硝酸纖維素膜、醋酸纖維素膜；金標(biāo)抗體層為玻璃纖維或無(wú)紡布浸取膠體金標(biāo)記抗體制成。
一種禽流感病毒抗原金標(biāo)快速診斷試劑盒的制備方法主要包括制備金標(biāo)抗體層(5)和檢測(cè)層(8)的控制線(6)和檢測(cè)線(7)的包被，然后在襯板(10)上組合禽流感病毒抗原金標(biāo)測(cè)試條和檢測(cè)板(1)。在塑料墊板10的兩端分別粘貼加樣端吸水紙層4和吸水端吸水層9；在其中段粘貼包被抗體的纖維素膜層8，在加樣端吸水紙層4于纖維素膜層8的交接部位，夾貼含金標(biāo)抗體5的玻璃纖維，玻璃纖維的4/5部分在加樣端吸水紙層4中間，1/5部分在纖維素膜層8上。然后按4毫米寬、8厘米長(zhǎng)規(guī)格切條，再組裝在塑料盒內(nèi)。盒蓋上加樣孔2正對(duì)測(cè)試條的加樣端吸水紙層4，觀察孔3正對(duì)纖維素膜的檢測(cè)層8。
所述的金標(biāo)抗體層5的制備方法包括下述步驟i膠體金的制備，取100mg氯金酸溶于1000ml三蒸水中，加入15ml、濃度為1％的擰檬酸三鈉，煮沸15分鐘，冷卻后得到15-50納米的膠體金溶液；ii膠體金標(biāo)記禽流感病毒抗體，取100ml膠體金溶液，用0.2m碳酸鉀溶液調(diào)pH8.4，加入6mg禽流感病毒抗體，攪拌20分鐘，再加入240mg牛血清白蛋白，繼續(xù)攪拌5分鐘，4℃靜置2-4小時(shí)iii將上述膠體金溶液經(jīng)2000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，去沉淀物，得上清液iv將上清液經(jīng)10000轉(zhuǎn)/分鐘離心60分鐘離心得沉淀物v將沉淀物按4ml0ml溶于0.02M Ph7.4 Tris-Hcl緩沖液得膠體金溶液該緩沖液中含0.25％的牛血清白蛋白和0.02％疊氮鈉vi將膠體金溶液浸入玻璃纖維或無(wú)紡步至液體開(kāi)始滲出為止，在37℃下2小時(shí)干燥而形成金標(biāo)抗體層5。
所述膠體金標(biāo)記抗體為羊、兔抗禽流感病毒抗體。
所述的檢測(cè)層8是在纖維素膜上設(shè)有禽流感病毒抗體構(gòu)成的檢測(cè)線和有羊兔抗兔、羊IgG抗體形成的控制線6。其制備方法是取抗禽流感病毒抗體，調(diào)濃度為1mg/ml，加入2％的甲醛，用噴膜機(jī)在纖維素膜中段噴檢測(cè)線7；再取羊、兔抗兔、羊IgG調(diào)濃度為2mg/ml，加入2％的甲醛，用噴膜機(jī)在纖維素膜中段，距檢測(cè)線0.5cm處，噴控制線6，按20ul/10cm設(shè)置噴膜量，噴膜37℃干燥，2小時(shí)，再用0.01m pH7.0含10％小牛血清的PBS，在37℃下封閉30分鐘，0.01ml pH7.0的PBS漂洗，37℃干燥。
實(shí)施例二禽流感病毒抗原檢測(cè)方法及其金標(biāo)快速診斷試劑盒與例一同。
該試劑盒的制備方法除制備膠體金標(biāo)記的抗體為抗禽流感病毒單克隆抗體外，其他條件與例一同。
權(quán)利要求
1.一種禽流感病毒抗原檢測(cè)方法，其特征在于(1)將膠體金標(biāo)記的禽流感病毒抗體載于玻璃纖維或無(wú)紡部布載體上并在與膠體金標(biāo)記抗體栽體相連的檢測(cè)栽體上包被抗禽流感病毒抗體形成的檢測(cè)線和由抗羊、兔或鼠IgG抗體形成的控制線(2)取雞氣管或肛門(mén)分泌物溶解液、血清或全血、肝脾等臟器提取液滴于膠體金標(biāo)記抗體的栽體上，如上述分泌物、血清、全血或臟器含有禽流感病毒抗原則在檢測(cè)載體上形成檢測(cè)線、控制線雙線為陽(yáng)性，否則為陰性。
2.如權(quán)利1所述的禽流感病毒抗原檢測(cè)方法，其特征在于所述膠體金標(biāo)記的禽流感病毒抗體為羊或兔抗禽流感病毒抗體或禽流感病毒單克隆抗體。
3.如權(quán)利1所述的禽流感病毒抗原檢測(cè)方法，其特征在于所述的檢測(cè)栽體上包被抗禽流感病毒抗體為羊或兔抗禽流感病毒抗體或禽流感病毒單克隆抗體。
4.一種禽流感病毒抗原金標(biāo)快速診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒內(nèi)設(shè)禽流感病毒抗原金標(biāo)檢測(cè)板(1)。
5.如權(quán)利要求4所述的禽流感病毒抗原金標(biāo)快速診斷試劑盒，其特征在于所述的禽流感病毒抗原金標(biāo)檢測(cè)板(1)是在襯板(10)上設(shè)有加樣端吸水層(4)、檢測(cè)層(8)和吸水端吸水層(9)，在檢測(cè)層(8)和吸水端吸水層(9)之間設(shè)有金標(biāo)禽流感病毒抗體層(5)在檢測(cè)層(8)上包被有檢測(cè)線(7)和控制線(6)。
6.一種權(quán)利要求4所述的禽流感病毒抗原金標(biāo)快速診斷試劑盒的制備方法，其特征在于主要包括制備金標(biāo)抗體層(5)和檢測(cè)層(8)的控制線(6)和檢測(cè)線(7)的包被，然后在襯板(10)上組合禽流感病毒抗原金標(biāo)測(cè)試條和檢測(cè)板(1)。
7.如權(quán)利要求6所述的禽流感病毒抗原金標(biāo)快速診斷試劑盒的制備方法，其特征在于所述的金標(biāo)抗體層(5)的制備方法包括下述步驟i膠體金的制備，采用公知的膠體金制備工藝制備膠體金ii膠體金標(biāo)記禽流感病毒抗體，在膠體金溶液中按4-12mg/100ml加入禽流感病毒抗體，經(jīng)交拌后再在溶液中按0.1-0.6g/100ml加入動(dòng)物血清蛋白，4℃靜置2-4小時(shí)iii將上述膠體金溶液經(jīng)離心去沉淀物，得上清液iv將上清液離心得沉淀物v將沉淀物按4-10ml0ml溶于0.02M Ph7.4 Tris-Hcl緩沖液得膠體金溶液該緩沖液中含0.2-0.6％的動(dòng)物血清蛋白和0.01-0.06％疊氮鈉vi將膠體金溶液浸入玻璃纖維或無(wú)紡步至液體開(kāi)始滲出為止而形成金標(biāo)抗體層(5)。
8.如權(quán)利要求6或7所述的禽流感病毒抗原金標(biāo)快速診斷試劑盒的制備方法，其特征在于所述膠體金標(biāo)記抗體為羊或兔抗禽流感病毒抗體或禽流感病毒單克隆抗體。
9.如權(quán)利要求6所述的禽流感病毒抗原金標(biāo)快速診斷試劑盒的制備方法，其特征在于所述的檢測(cè)層(8)是在纖維素膜上設(shè)有羊或兔抗禽流感病毒抗體或禽流感病毒單克隆抗體構(gòu)成的檢測(cè)線(7)和有羊、兔抗兔、羊IgG抗體或羊、兔抗鼠抗體形成的控制線(6)，其制備方法是取抗禽流感病毒抗體，調(diào)濃度為0.8-1.2mg/ml，加入2％的固定劑，用噴膜機(jī)在纖維素膜中段噴檢測(cè)線(7)；再取抗兔、羊或鼠IgG調(diào)濃度為1.8-2.4mg/ml，加入2％的固定劑，用噴膜機(jī)在纖維素膜中段，距檢測(cè)線0.5cm處，噴控制線(6)，按1.8-2ul/1cm設(shè)置噴膜量，噴膜37℃干燥，2小時(shí)，再用0.01m pH7.0含8-12％小牛血清的PBS，在37℃下封閉25-35分鐘，0.01ml pH7.0的PBS漂洗，37℃干燥。
10.如權(quán)利要求9所述禽流感病毒抗原金標(biāo)快速診斷試劑盒的制備方法，其特征在于所述的固定劑為甲醛。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種禽流感病毒抗原檢測(cè)方法及其金標(biāo)快速診斷試劑盒和制備方法，其檢測(cè)方法包括(1)將膠體金標(biāo)記的羊或兔禽流感病毒抗體或單克隆抗體載于玻璃纖維或無(wú)紡布載體上；并在與膠體金標(biāo)記抗體載體相連的檢測(cè)載體上包被羊或兔抗禽流感病毒抗體或禽流感病毒單克隆抗體形成的檢測(cè)線和由抗羊、兔或鼠IgG抗體形成的控制線；(2)取雞氣管或肛門(mén)分泌物溶解液、血清、全血、肝脾等臟器提取液滴于膠體金標(biāo)記抗體的載體上，如上述分泌物、血清、全血或臟器含有禽流感病毒抗原則在檢測(cè)載體上形成檢測(cè)線、控制線雙線為陽(yáng)性，否則為陰性；該診斷試劑盒包括禽流感病毒抗原金標(biāo)檢測(cè)板；該檢測(cè)板包括加樣端吸水層、檢測(cè)層和吸水端吸水層，在檢測(cè)層和加樣端吸水層之間設(shè)有金標(biāo)羊或兔抗禽流感抗體或禽流感病毒單克隆抗體層；檢測(cè)層上包被有由羊或兔禽流感病毒抗體或禽流感病毒抗體形成的檢測(cè)線和由抗羊、兔或鼠IgG抗體形成的控制線；本發(fā)明的方法為一步檢測(cè)方法，靈敏度高、特異性強(qiáng)；而且速度快、簡(jiǎn)便，無(wú)需專(zhuān)門(mén)設(shè)備。
文檔編號(hào)G01N33/552GK1725012SQ20051004263
公開(kāi)日2006年1月25日 申請(qǐng)日期2005年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月20日
發(fā)明者李克生, 杜惠芬 申請(qǐng)人:李克生