一種禽流感和新城疫病毒同步檢測試劑盒及檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于病毒檢測技術領域，主要涉及禽流感H7亞型和新城疫病毒雙檢引物 的設計、檢測方法的建立及試劑盒組裝。
【背景技術】
[0002] 禽流感和新城疫是世界范圍內公認的對養(yǎng)殖業(yè)最具毀滅性打擊的兩種禽病毒病。 兩種病毒均可導致禽類嚴重的呼吸系統(tǒng)感染和死亡率。禽流感與新城疫病的暴發(fā)與野生禽 類傳播有關，能夠導致人類感染，例如結膜炎和流感樣綜合征等。
[0003] 禽流感（Avian influenza，Al)是由正粘病毒科A型流感病毒引起的一種禽類的 烈性傳染病。自1978年在意大利的雞群中首次發(fā)現(xiàn)本病以來，已在美洲、歐洲等世界上許 多國家和地區(qū)發(fā)現(xiàn)有本病流行。我國自1995年首次報道禽流感發(fā)生以來，每年都有禽流感 發(fā)生的報道，尤其是低致病性禽流感在我國的流行幾乎呈常態(tài)化。近幾十年，不斷有LPAIV 和HPAIV感染人的報道，均是由禽直接傳給了人，并沒有病毒能在人群中有效傳播的證據(jù)。 LPAIV H7感染人的臨床癥狀表現(xiàn)為輕微的呼吸道癥狀或是結膜炎，而人感染HPAI H7亞型 病毒可引起嚴重疾病甚至死亡（fouchier RA etal，2004，Arzey GG etal，2012)。早在1902 年造成雞瘟的高致病性病原，于1955年確定并更名為高致病性H7N7亞型禽流感。近幾年 來，H7亞型AIV已經(jīng)造成超過七千萬家禽的死亡，波及到巴基斯坦、澳大利亞、愛爾蘭、加拿 大、德國、智力、荷蘭、以及美國等地，暴發(fā)亞型較多，包括LPAI H7N1、H7N3、H7N4、H7N7、以及 LPAI H7Nl、H7N2、H7N3、H7N8、H7N9(Peiris M etal，1998;Chan PK etal，2002;Puzelli S etal，2005 ;Malik JS etal，2012)。不同譜系的病毒均出現(xiàn)過感染人的時間，2013年3月中 國出現(xiàn)了 H7N9感染人并致人死亡事件。H7N9亞型禽流感最早在西班牙野鳥（綠翅鴨）中 分離，試驗證明這是一中低致病性的亞型，毒株為A/Anascrecca/Spain/1460/2008 (H7N9)。 2002年哈獸研的陳化蘭等在中國北部河北省家禽屠宰場雞常規(guī)口咽部拭子中分離檢測到 H7N2 禽流感病毒，A/chicken/Hebei/l/2002(CK/HB/l/02)。
[0004] 新城疫病毒的基因組不分節(jié)段，編碼6種結構蛋白：核衣殼蛋白NP、磷酸化蛋白 P、基質蛋白M、融合蛋白F、血凝-神經(jīng)氨酸酶蛋白HN以及具有RNA依賴性的RNA聚合酶 蛋白L。以往普遍認為該裂解位點的氨基酸序列及裂解能力是NDV毒力的惟一決定性因素 (Dortmans J C etal，2009)。不過近年來的研宄表明F蛋白的裂解能力并不是NDV毒力的 惟一決定性因素。經(jīng)NDV結構蛋白多肽指紋圖譜分析發(fā)現(xiàn)，有NDV毒株NP、P和L蛋白分 子結構基本一致，而F和HN蛋白氨基酸在不同毒株間卻存在較大差異，并且毒力差異越大， 其F和HN蛋白氨基酸差異也越明顯[Palmieris SM etal，1988]。國內外對F基因和HN基 因研宄較多，并測定出了多個NDV強、弱毒株F基因和HN基因的核苷酸序列.NDVHN蛋白能 特異識別宿主細胞表面靶受體，與靶受體結合并能水解病毒粒子囊膜表面糖鏈末端的唾液 酸。HN蛋白具有抗原性、HA活性和NA活性，并且與F蛋白具有協(xié)同作用，因此HN蛋白是 NDV毒力和特性的重要蛋白（曹殿軍等，1998)。HN蛋白是一種既有血凝素（HA)活性又有 神經(jīng)氨酸酶（NA)活性的糖蛋白，是NDV重要的毒力蛋白和保護性抗原。HA活性能夠使病毒 吸附到對應靶細胞的受體上，NA活性則破壞細胞受體，從感染細胞表面釋放病毒粒子。同 時HN蛋白還能夠促進膜融合，吸引F蛋白充分接近該位點，繼而啟動病毒與細胞膜融合。
[0005] 兩種病毒的同時檢測已有大量科研人員進行了研宄，RT-PCR是最常用的一種快速 檢測方法（梁成珠等，專利號200510042527. 1，孫濤等，專利號201010128875. 1，劉永生等， 專利號200810081497. 9,謝芝勛等，2008,劉海鵬等，2003,于洋等，2006,楊旭芹，2005)，其 次是高通量的基因芯片方法（薄清如等，專利號201110078639.8,田麗娜等，2008,吳時友 等，2005) 〇
[0006] 80年代中期，人們建立了聚合酶鏈式反應技術（polymerase chain reaction， PCR)，將DNA擴增過程縮短到了 2h?3h，使得分子克隆技術得到了突破性的改進。2000年 Notomi等建立了一種新的體外擴增特異DNA片段的分子生物學技術：環(huán)介導的等溫擴增技 術（loop-mediated isothermal amplification，LAMP)。該技術依賴于自動循環(huán)的鏈置換 反應，在等溫條件下，不到Ih就能擴增出IO9靶序列拷貝。LAMP法具有許多迄今為止的擴 增方法所無法比擬的優(yōu)點。（1)只需一恒定溫度就能擴增反應。不需要特殊試劑，不需要 預先進行雙鏈DNA的變性；（2)高特異性：應用6個區(qū)段、4種引物，并且這6個區(qū)段的順序 也有規(guī)定。因此，LAMP法擴增的特異性很高，可以根據(jù)是否擴增就能判斷目標基因的存在 與否，對疾病定性檢測；(3)快速、高效擴增：整個擴增在不到60min即可完成，且產(chǎn)率可達 到0. 5mg/ml。若在引物上再進一步改進，可大大提高其擴增效率，擴增時間在原來的基礎 上減少1/3?1/2 ;⑷靈敏度高：擴增模板可達1?10拷貝；(5)步驟簡單：擴增RNA只 要在DNA基因擴增試劑的基礎上加上逆轉錄酶，就能夠完全像DNA基因擴增那樣，一步實現(xiàn) RNA擴增；(6)鑒定簡便：對PCR產(chǎn)物進行熒光標記，在核酸大量合成時，只要用肉眼觀察即 可獲得結果，也可利用現(xiàn)有的熒光定量PCR儀作熒光檢測。諸多試驗結果表明，該方法靈敏 度是普通PCR方法的100倍，根據(jù)鑒定體系的不同，可通過肉眼觀察有無熒光或沉淀直接判 定結果（pham HM etal，2005;Dukes JP etal，2006;孔令辰等，2007;趙彥宗等，200%楊睿 等，2011)。
[0007] 自從LAMP檢測方法建立以來，研宄人員利用其檢測了 RNA、DNA病毒，如犬瘟 熱（Cho HS etal，2005)、新城疫病毒（孔令辰等，2007;pham HM etal，2005;Imai etal， 2006;)、重急性呼吸綜合癥冠狀病毒（SARS) (Poon LL etal，2004)，人類皰瘆病毒的檢測 (Okamoto S etal，2004)、禽流感病毒（Imai M etal，2006,李靖等，2005，P oon LL etal， 2005)、口蹄疫病毒（Dukes JP etal，2006)、藍耳病病毒（趙彥宗等，2009)、豬瘟病毒（劉中 勇等，2010)、圓環(huán)病毒（何選民等，2009)、偽狂犬病毒（楊睿等，2011)、細小病毒（尚毅等， 2011)等，細菌病原體（Ihir