專利名稱：：丙型肝炎病毒包膜抗原夾心法試劑盒及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于丙型肝炎檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
。更具體涉及一種與丙型肝炎病毒包膜抗原夾心法試劑盒，同時，本發(fā)明還涉及一種丙型肝炎病毒包膜抗原夾心法試劑盒檢測丙型肝炎病毒的方法，以及多肽和包括生物素等標(biāo)記的多肽在作為檢測丙型肝炎病毒表面包膜抗原夾心法試劑盒中的應(yīng)用，可廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：丙型病毒性肝炎(簡稱丙型肝炎)是由丙型肝炎病毒(HepatitisCVirus,HCV)引起的肝臟炎癥性疾病。HCV感染呈全球性分布，主要通過血液傳播。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球HCV感染率約為3%，估計有l(wèi).7億人感染HCV，每年新發(fā)丙型肝炎病例約3.5萬。我國血清流行病學(xué)調(diào)查資料顯示，一般人群抗HCV陽性率為3.2%,各地區(qū)感染率有一定差異。急性HCV感染者約80o/。發(fā)展為慢性丙型肝炎(CHC)，在20年間約20%可發(fā)展為肝硬化，每年約有1%4%肝硬化患者發(fā)展為肝癌。CHC已成為不可忽視的重要疾病，及早發(fā)現(xiàn)和治療CHC患者已受到重視。CHC治療目的包括根除或長期抑制病毒復(fù)制，減輕肝內(nèi)炎癥和纖維化，最終阻止進(jìn)展為肝硬化、肝癌和肝功能衰竭，并提高患者的生活質(zhì)量。HCV病毒顆粒直徑3060nm，含類脂外膜，屬于黃病毒科，是一種單股正鏈RNA病毒，全長約9500bp，HCV整個基因組只有一個可讀框(ORF)，位于基因組中央。在基因組的5'和3'末端各有一段非編碼序列。5'末端有一個長度和序列非常穩(wěn)定的非編碼區(qū)(URT)，可以說是整個基因組最為保守的區(qū)域，長度是341個核苷酸。3'末端非編碼區(qū)由三部分組成，從編碼病毒前體蛋白的可讀框的第一個終止密碼之后是3040個核苷酸的非編碼變異序列，然后是polyU(或polyA)結(jié)構(gòu)，最后面有98個核苷酸的高保守序列。中間是幾乎跨越了整個基因組的大的ORF，由9033個核苷酸組成，能編碼約30103033aa的病毒前體多聚肽，經(jīng)過蛋白酶切割修飾后，前體多肽產(chǎn)生2種結(jié)構(gòu)蛋白，即核心蛋白(C區(qū))和膜蛋白(E區(qū))，5種非結(jié)構(gòu)區(qū)蛋白NS!、NS2、NS3、NS4和NSs。HCV的復(fù)制是利用RNA指導(dǎo)的RNA多聚酶，又稱RDRP，并無閱讀保護(hù)酶來修正復(fù)制中的錯誤，因而HCV的變異較大，尤其在結(jié)構(gòu)基因的E區(qū)的3'末端和非結(jié)構(gòu)基因的NS1區(qū)的5'末端之間是一個高度可變區(qū)，在結(jié)構(gòu)基因的C區(qū)和非結(jié)構(gòu)基因的NS3、NS4和NSs區(qū)則保守性較高。目前，臨床上檢測HCV感染的方法大致包括(1)ELISA法檢測抗-HCV抗體，包括重組免疫印跡(RIBA);(2)PCR檢測HCV的RNA，包括熒光PCR、免疫PCR法(PCR-ELISA)、及用于定量的bDNA和NASBA技術(shù)；(3)基因型芯片檢測技術(shù)。酶聯(lián)免疫吸附法檢測抗HCV的特異性好，靈敏度高，操作簡便，目前已成為采供血機構(gòu)檢測抗-HCV的常規(guī)方法。然而抗-HCV樣本的濃度介于試劑盒臨界范圍時，由于受到各種不確定因素如試劑盒的敏感度、操作人員技術(shù)熟練程度及其責(zé)任心、實驗室溫度、加樣器等影響，很可能造成假陽性或假陰性的結(jié)果。文獻(xiàn)曾報道用ELISA法檢測抗-HCV灰?guī)^(qū)血樣經(jīng)重復(fù)檢測有12.6%(11/87)的假陰性率。對落在灰區(qū)范圍內(nèi)的隨機抽樣樣本進(jìn)行的PCR檢測中，HCVRNA的陽性率為18%(3/17)，表明灰區(qū)內(nèi)樣本確實存在著病毒復(fù)制。如果沒有設(shè)置灰區(qū)，一年之內(nèi)就可能有5份抗-HCV陽性的樣本輸入到無辜的患者體內(nèi)。為提高抗-HCV的檢出率，最大限度地防止漏檢，提高輸血的安全性，筆者認(rèn)為灰區(qū)的設(shè)置有著重要的意義。至于灰區(qū)的范圍應(yīng)該多大才合適，還須做進(jìn)一步的研究。對于落在灰區(qū)內(nèi)的樣本應(yīng)進(jìn)行重復(fù)檢驗。有條件的單位應(yīng)予行PCR檢測，以提高檢驗的準(zhǔn)確性。PCR檢測HCV的RNA，特別是支鏈DNA(bDNA)技術(shù)的最大特點是不經(jīng)過呈指數(shù)增長的擴增過程，放大倍數(shù)確定，不利因素少，因此穩(wěn)定性、重復(fù)性高，用于HCVRNA的動態(tài)水平研究結(jié)果準(zhǔn)確。但bDNA技術(shù)的局限性也顯而易見，即放大倍數(shù)少、敏感性低、檢測范圍窄、不適用于HCVRNA的低水平檢測?；蛐酒夹g(shù)適用于研究HCV的流行病學(xué)、變異趨勢、傳播途徑，對丙型肝炎患者判斷病情、指導(dǎo)治療、預(yù)測療效及預(yù)后有重要意義，但其成本高，易出現(xiàn)假陽性。由于現(xiàn)有的臨床檢測HCV感染的方法的各種局限性，臨床工作者迫切希望出現(xiàn)一種新型的臨床檢測HCV的方法，該方法應(yīng)具有特異性高，成本低廉，操作簡便，診斷迅速的特點。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是在于提供一種丙型肝炎病毒包膜抗原夾心法試劑盒，能快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測丙型肝炎病毒。本發(fā)明另一個目的是在于提供了一種丙型肝炎病毒包膜抗原夾心法試劑盒的檢測方法，該方法特異性高，成本低廉，檢測速度快，操作方便，省時效率高。本發(fā)明的丙型肝炎病毒包膜抗原夾心法試劑盒在快速檢測HCV感染中可廣泛應(yīng)用。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施一種丙型肝炎病毒表膜抗原夾心法試劑盒，它包括-a、酶標(biāo)板(CdlStar詠購自武漢大風(fēng)生物科技有限公司)；b、生物素標(biāo)記的能與HCVE2蛋白特異性結(jié)合的12肽；c、多肽為SEQIDNO:l、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4所示的序列；d、辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素；e、辣根過氧化物酶的底物；f、酶聯(lián)免疫檢測儀(購自南京華東電子集團醫(yī)療裝備有限公司)；g、E2蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)陽性孔。核糖體文庫篩選技術(shù)是將編碼隨機肽的DNA文庫在體外轉(zhuǎn)錄、翻譯，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA由于缺乏終止子，不能從核糖體上釋放，而與新生多肽、核糖體以共價鍵結(jié)合，形成mRNA—核糖體一蛋白質(zhì)三聚體結(jié)構(gòu)，此三聚體形式將蛋白和mRNA信息連接在一起，使基因型和表型得到統(tǒng)一。利用固相化抗原或受體的特異性的單克隆抗體親和篩選核糖體表面的隨機多肽，分離特異性結(jié)合的mRNA—核糖體一多肽復(fù)合物，通過降低Mg^濃度，核糖體解離，釋放mRNA，回收核糖體富集庫中的mRNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,PCR擴增，其產(chǎn)物可作為下一輪體外合成的模板，經(jīng)過幾輪篩選，能找到與抗體特異性結(jié)合的多肽。近年來，應(yīng)用核糖體展示技術(shù)已進(jìn)行了許多研究，如篩選配體或受體，篩選抗體或確定抗原表位，開發(fā)新的蛋白酶抑制物和新的藥物。5一種與丙肝病毒包膜抗原高度特異結(jié)合的多肽具體制備步驟如下一、制備E2-GST融合蛋白的步驟如下A.挑取含有pGEX-KG-E2(見參考文獻(xiàn)Li，etal.，EngineeringofiV-glycosylationofHepatitisCVirusEnvelopeProteinE2EnhancesTcellresponsesforDNAimmunization,2007.25:1544隱1551.)的大腸桿菌BL21DE3(購自美國invitrogen公司)接種于3ml含有氨節(jié)青霉素(5Q嗎/ml)的LB培養(yǎng)基中，對照組別接種含有pGEX-KG(GST蛋白的原核表達(dá)載體，購自AmershamBiosciences公司)的大腸桿菌BL21DE3,37。C培養(yǎng)12~16小時。B.將小試管中的菌液分別轉(zhuǎn)移到200ml含有氨芐青霉素(50pg/ml)的LB液體培養(yǎng)基(LB液體培養(yǎng)基為10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化鈉，溶解至1000ml雙蒸水)中，37'C培養(yǎng)到OD600為12。C.加入100mM異丙基-(3-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，使其終濃度為0.1mM，3(TC誘導(dǎo)45小時。D.將誘導(dǎo)以后的菌液分裝到250ml的離心管中，4t:,7700g,5min離心，棄上清。E.沉淀物用磷酸鹽緩沖液PBS(140mM氯化鈉，2.7mM氯化鉀，10mM磷酸氫二鈉，1.8mM磷酸二氫鉀)洗滌1次，4°C，7700g,5min離心，棄上清。F.將沉淀重懸于8ml含1mM苯甲基磺酰氟(PMSF:17.42mgPMSF溶于lml異丙醇中，-20'C保存)的PBS中。G.將菌液放置冰中，超聲碎菌，加入20。/。曲通X-100(TritonX-100:1mlTritonX-100溶于4ml無菌雙蒸水中)，使其終濃度1%,4°C,輕混30分鐘。H.每EP管中加入lml超聲降解的菌液，4°C,12000g,10min離心，取上清。I.4°C,12000g,離心10min,再取上清。J.各EP管加入20pi瓊脂糖凝膠4B(Sepharose4B:購自AmershamBiosciences公司，美國)，混勻，室溫2025。C孵育30min。4。C，5000rpm,5min，離心，棄上清。K.每個EP管中各加入1000.01MPBS洗滌，離心洗滌后將含有Separose4B的懸濁液收集于一管，4'C,5000rpm,5min，離心，棄上清，共洗滌3次。L.加入與Sepharose4B等量的谷光苷肽洗脫緩沖液(GlutathioneElutionBuffer:0.0154g谷光苷肽溶解于0.25mlpH8.0的1M過濾除菌，分裝，4'C保存)，室溫2025。C輕輕混勻10min，4°C，5000rpm，5min，取上清。M.重復(fù)步驟L兩次。收集的上清則為E2-GST融合蛋白。二、制備隨機DNA文庫的步驟如下A.寡核昔酸為3，-CCTCTATATAGGTACCGATCG(NNM)"AGGCCGGTAGTAGTAGTAGTAGTACTTMGGCCA-5'(卯bp)(劃線部分分別為SD序列、啟始密碼子、HisTag、斜體部分為Saw/ZI酶切位點)(N代表A,C,T或G,M代表A或C)B.第一輪PCR的上游引物Ul為5'-GCTCGTATAATGTGTGGCCACAACGGA4GATATATCCATG-3'(43bp)(劃線部分為5'端莖環(huán)和斜體部分為核糖體結(jié)合位點:RBS)，下游引物Dl為3'-GTAGTACCTQ-5'(52bp)(劃線部分分別為5麵ffl酶切位點、Gly-Ser序列和3，端莖環(huán))C.第二輪PCR的上游引物U2為5'-GCGCTGCAGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTG-3'(42bp)，(劃線部分分別為尸M酶切位點和Tac啟動子)。下游引物為Dl。隨機ssDNA文庫和引物由上海博亞生物有限公司合成。隨機DNA文庫的構(gòu)建示意圖見圖1。D.以寡核普酸為模板，用引物U1和D1進(jìn)行第一輪PCR，反應(yīng)體系為10XTagDNAPolymerasebuffer(含Mg2+)5n1dNTPmix(10mM)引物Ul(20nM).1fil引物Dl(20pM)1.Hi寡核苷酸(0.05嗎7(al).1^雙蒸水40plTagDNA聚合酶1.pi總體積50|al反應(yīng)程序a.95°C，2分鐘b.95°C，36秒；63°C，36秒；72°C，84秒；共25個循環(huán)。c.72°C，5分鐘E.PCR產(chǎn)物經(jīng)2M的瓊脂糖凝膠(0.4g瓊脂糖粉末溶解于20mUXTAE溶液)電泳，然后用回收試劑盒(QIAEXIIgelExtractionKit,美國promega公司)回收。F.經(jīng)步驟E回收所得的PCR產(chǎn)物作為模板，進(jìn)行第二輪PCR擴增，反應(yīng)體系為10XTagDNAPolymerasebuffer(含Mg2+)5pidNTPmix(10mM)J1^1引物Ul(20|aM)Jpl引物Dl(20nM)Jul第一輪PCR產(chǎn)物4^1雙蒸水37^1TagDNA聚合酶總體積反應(yīng)程序a.95°C，2分鐘b.95°C，36秒；62°C，36秒；72°C，84秒；共25個循環(huán)。c.72°C，5分鐘G.步驟F所得得PCR產(chǎn)物經(jīng)2。/。的瓊脂糖凝膠電泳，然后用回收試劑盒回收，回收所得片段即可用于體外轉(zhuǎn)錄翻譯三、制備核糖體文庫的步驟如下A.核糖體文庫構(gòu)建及篩選流程如圖2所示:將編碼1014個隨機12肽的DNA庫在體外進(jìn)行偶聯(lián)的轉(zhuǎn)錄/翻譯，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA由于缺乏終止子，不能從核糖體上釋放，從而形成一個穩(wěn)定的mRNA-核糖體-新生多肽復(fù)合體結(jié)構(gòu)。利用連接有Sepharose4B(sigma公司)的E2-GST融合蛋白(E2-GST-Sepha薦e4B)親和篩選核糖體表面的隨機多肽，分離特異性結(jié)合的mRNA—核糖體一多肽復(fù)合物，通過降低Mg^濃度，核糖體解離，釋放mRNA,回收核糖體富集庫中的mRNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA.PCR擴增，其產(chǎn)物可作為下一輪體外合成的模板，經(jīng)過六輪篩選，能找到與E2蛋白特異性結(jié)合的多肽。B.反應(yīng)體系DNA模板(0.3mg/ml)10(^1S30PremixwithoutAminoAcids20|al氨基酸混合液(無甲硫氨酸)2.5pi氨基酸混合液(無亮氨酸)2.5|nlS30Extract,linear15(jl總體積50pi輕輕混勻EP管中各混合物，5000rpm，離心30秒，讓混合物沉積于EP管底部。C.30'C孵育2.5小時。D.EP管冰上放置5分鐘中止反應(yīng)，EP管中物質(zhì)即為核糖體展示文庫。四、核糖體展示文庫篩選與丙肝病毒E2糖蛋白結(jié)合的多肽的步驟如下A.在100pi體外轉(zhuǎn)錄翻譯混合物中加入6單位的無RNA酶的DNase(Promega公司，美國)，10XDNaseI緩沖液(Promega公司，美國)637i:溫育30min。然后加中止緩沖液，65°C，10min滅活DNase。B.取60piE2陽GST-Sepharose4B,4。C，5000rpm，5min離心，棄上清。C.沉淀用500^1洗脫緩沖液(washingbuffer:50mMpH7,5的Tris-醋酸，150mM氯化鈉NaCl,0.1%Tween-20,50mM醋酸鎂)洗滌3次。D.將100pi體外轉(zhuǎn)錄/翻譯混合物加入到洗滌過的E2-GST-Sepharose4B中，4'C搖動1小時。E.4。C，5000rpm，5min離心，棄上清，沉淀用washingbuffer洗滌3次。F.沉淀中加入100pielutionbuffer,4。C搖動10min使mRNA與核糖體解離，4°C，5000rpm，5min離心，取上清。G.用RNaidKit(購自biol01公司，美國)回收mRNA，具體方法如下a.上清中加入3倍體積的RNABindingSalt(RNaidKit成份)混勻。b.再加入lp(alRNAMATRIX(RNaidKit成份)，室溫放置5min。c.13000rpm，lmin離心，棄上清。d.用RNAwash(RNaidKit成份)洗滌2次，(RNAwash:乙醇-l:l)。e.加入lPpl無RNase的H20,4555。C溫育5min。f.13000rpm，2min離心，取上清，上清即是RNA模板，可用于RT-PCR。H.RT-PCR,其反應(yīng)體系為AMV/Tfl5XReactionbuffer10dNTPmix混合物1^引物U1(20mM)1引物D1(20mM)1|lUMgS04(25mM)2piAMVReverseTranscription1(JiTflDNAPolymerase1nlRNA模板1pi無酶水29^總體積50^反應(yīng)程序為48°C，45分鐘；94°C,2分鐘；94°C，30秒；63°C，l分鐘，72°C，2分鐘；共31個循環(huán)；72°C，7分鐘I.2%瓊脂糖瓊脂糖凝膠電泳。J.回收分子量大小為155bp的RTPCR產(chǎn)物。K.以回收產(chǎn)物為模板，再行第二輪PCR擴增，回收分子量大小為181bp的PCR產(chǎn)物。L.將回收的第二輪PCR產(chǎn)物連接至載體pUC19(購自美國Invitrogen公司)上，具體步驟為a.將PCR產(chǎn)物及載體pUC19酶切，反應(yīng)體系為10XY十Buffer2jnl5awHI1(ji尸M1plddH2017(il總體積20(al37'C水浴2小時M.分別回收分子量大小為128bp的DNA片段以及分子量大小為2.668kb的pUC19目的片斷，然后用回收試劑盒(QIAEXIIgelExtractionKit,美國promega公司)回收。a.用DNA連接酶將步驟b所的DNA和載體pUC19連接，反應(yīng)體系為DNA4plpUC192pi10XBuffer2T4連接酶2pl雙蒸水10m1總體積2016'C孵育20小時b.將步驟c所得的連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a。取連接產(chǎn)物10|xl，加入100plDH5a感受肽細(xì)胞，冰浴30分鐘，42°C90秒，再冰浴5分鐘，加入800^1LB液體培養(yǎng)基(LB液體培養(yǎng)基為10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化鈉，溶解至1000ml雙蒸水)，37'C,225rpm振搖4050分鐘。取200|_d菌液均勻涂在有氨芐青霉素(Ampf)抗性的LB固體培養(yǎng)基(LB固體培養(yǎng)基為10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化鈉，15g瓊脂粉溶解至1000ml雙蒸水)上(氨芐青霉素濃度為50嗎/ml)，37'C培養(yǎng)過夜。c.挑取單個克隆菌落，置于3mlLB液體培養(yǎng)基(含氨芐青霉50^g/ml)培養(yǎng)過夜。d.提取步驟e獲得的菌液的質(zhì)粒DNA。e.PCR鑒定步驟f所得的DNA，反應(yīng)體系為:10XTaqDNApolymerasebuffer5(oldNTPmix混合物(10mM)1m1引物U2(20mM)1(il引物D1(20mM)1|ul質(zhì)粒DNA1|_U雙蒸水40piTaqDNAPolymerase1(xl總體積50^反應(yīng)程序為95°C，2分鐘；95°C，30秒；62°C，1分鐘，72°C，l分鐘24秒；共25個循環(huán)；72°C，5分鐘f.將步驟g所得產(chǎn)物經(jīng)SawHI和鑒定，正確的克隆送至上海華諾公司測序。根據(jù)測序結(jié)果，請西安美聯(lián)公司合成的，得到了4條一種分離的多肽，其氨基酸序列分別為PE2A(SEQIDNO:l):GFGRYRRHGSPWPE2B(SEQIDNO:2):MAIGPYPACGSGPE2C(SEQIDNO:3):LSVLVISMFNAVPE2D(SEQIDNO:4):MARHRNWPLVMV五、利用丙型肝炎病毒包膜抗原夾心法試劑盒檢測丙肝病毒顆粒的步驟如下A.96孔酶標(biāo)板在紫外燈下照射2小時。每孔加入100^10.05%戊二醛，室溫(26°C)孵育1小時。每孔加入100|il20~50mg/L的多肽'室溫(26°C)孵育1小時,或4。C過夜。PBS洗滌3遍，甩干。B.每孔加入lOOpl封閉液乙醇胺封閉過夜，4°C孵育過夜。C.洗滌液洗滌五次次后，分別加入？)Lig^g的生物素標(biāo)記的多肽(包括bio-PE2D，bio-PE2A,bio-PE2B等不同組合)到96孔板中，每孔體積為100^1，37°C孵育lh。D.洗滌五次后，加入10ppl稀釋度為1:1000的辣根過養(yǎng)化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素(HRP-advin，購自晶美公司)。E.加入鄰苯二氨顯色，酶標(biāo)儀OD450nm下讀取OD值。顯示生物素標(biāo)記的多肽能與丙肝病毒顆粒直接結(jié)合。結(jié)果顯示分離得到的多肽能特異性結(jié)合丙肝病毒E2糖蛋白，并能與丙肝病人血清里的病毒直接結(jié)合，其OD值大于與正常人血清結(jié)合的OD值的23倍以上?？蛇_(dá)到直接檢測病人血樣里病毒含量的效果。六、利用丙型肝炎病毒包膜抗原試劑盒檢測丙肝病毒顆粒的步驟如下-F.96孔板里每孔加入13^丙肝病毒顆粒(3xl()S個病毒)和162碳酸氫鈉緩沖液(0.05MpH9.6)，混合，4'C孵育7小時。G.洗滌液(0.P/。Tween-20的PBS磷酸鹽緩沖液)洗滌五次。H.每孔加入100pl封閉液(1。/。BSA的PBS磷酸鹽緩沖液)，4'C孵育過夜。I.洗滌液洗滌五次次后，分別加入2iagWg的生物素標(biāo)記的多肽到96孔板中，每孔體積為10(^1，37°C孵育lh。J.洗滌五次后，加入IO(VI稀釋度為1:1000的辣根過養(yǎng)化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素(HRP-advin，購自晶美公司)。K.加入鄰苯二氨顯色，酶標(biāo)儀OD450nm下讀取OD值。顯示生物素標(biāo)記的多肽能與丙肝病毒顆粒直接結(jié)合。該實驗證明分離得到的生物素標(biāo)記的多肽能特異性結(jié)合丙肝病毒顆粒(HCVcc)的E2糖蛋白，結(jié)合能力呈劑量依賴性。本發(fā)明的優(yōu)點本實驗首次應(yīng)用核糖體文庫篩選了與丙肝病毒包膜E2蛋白結(jié)合的多肽。篩選到的三種多肽(ZD,ZA,ZB)與丙肝病毒表面包膜E2蛋白蛋白具有高親和力，本實驗首次用多肽和生物素標(biāo)記的多肽，雙夾心法檢測丙肝病人血清中的丙肝病毒包膜抗原，本發(fā)明所提供的針對丙肝病毒E2糖蛋白的小分子多肽(12肽)分子量小，易于合成。與同類產(chǎn)品相比靈敏度高于傳統(tǒng)檢測HCV抗體方法，接近傳統(tǒng)HCVRNA檢測方法，成本較傳統(tǒng)檢測HCVRNA檢測方法低，不需要PCR儀。圖l.隨機DNA文庫的構(gòu)建流程圖。RBS表示核糖體結(jié)合位點，N代表A,C，T或G,M代表A或C圖2.核糖體展示文庫篩選與丙肝病毒E2糖蛋白結(jié)合的多肽的構(gòu)建流程圖。圖3.SPR檢測多肽PE2A、多肽PE2B、多肽PE2C、多肽PE2D與E2蛋白的親和力，它們結(jié)合的親合力大小是多肽PE2D〉多肽PE2B〉多肽PE2A〉多肽PE2C。圖4A多肽抑制HCVE2蛋白與人肝細(xì)胞Huh7.5細(xì)胞結(jié)合圖4B多肽抑制HCVE2蛋白與DC-SIGN+靶細(xì)胞結(jié)合(A)流式細(xì)胞儀檢測多肽A、多肽B、多肽D分別抑制HCVE2蛋白結(jié)合人肝癌細(xì)胞Huh7.5的能力(圖4A);多肽分別抑制HCVE2蛋白結(jié)合人肝癌細(xì)胞Huh7.5的能力的劑量依賴性(圖4A)。(B)流式細(xì)胞儀檢測多肽A、多肽B、多肽D分別抑制62蛋白結(jié)合00810^^1113丁3細(xì)胞的能力(圖4B);多肽分別抑制E2蛋白結(jié)合人肝癌細(xì)胞DC-SIGN+-NIH3T3的能力的劑量依賴性(圖4B)。圖5.多肽PE2D能競爭性抑制E2與HCV的受體CD81,和肝素的結(jié)合。圖6.多肽PE2D能特異性抑制丙肝假病毒(HCVpp)感染靶細(xì)胞，且多肽PE2D抑制能力呈劑量的依賴性。圖4A是假病毒的構(gòu)建步驟，圖4B是假病毒在293細(xì)胞里表達(dá)E1、E2蛋白，圖4C是PE2D(SEQIDNO:4)阻止假病毒感染Huh7.5細(xì)胞，并呈劑量依賴性。圖7.ELISA檢測不同濃度PE2D與HCV病毒顆粒(HCVcc)結(jié)合的能力呈劑量依賴性。圖8.ELISA檢測不同濃度的PE2D能抑制HCVcc與Huh7.5結(jié)合的能力不同，劑量越大，抑制能力越強。圖9.HCV包膜抗原診斷夾心法試劑盒檢測方法:包被多肽，加樣品，再加生物素表記的多肽,以及辣根過養(yǎng)化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素檢測HCV抗體陽性或HCVRNA檢測陽性的丙肝病人血清中的病毒。正常人血清作為對照。具體實施例方式實施例1丙型肝炎病毒包膜抗原夾心法試劑盒的配置-a、酶標(biāo)板(CdlStar@,購自武漢大風(fēng)生物科技有限公司；b、生物素標(biāo)記的能與HCVE2蛋白特異性結(jié)合的12肽；c、多肽為SEQIDNO:l、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4所示的序列；d、辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素；e、辣根過氧化物酶；f、酶聯(lián)免疫檢測儀(購自南京華東電子集團醫(yī)療裝備有限公司)；g、E2蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)陽性對照。一、制備E2-GST融合蛋白的步驟如下A.挑取含有pGEX-KG-E2(見參考文獻(xiàn)EngineeringofN-glycosylationofHepatitisCVirusEnvelopeProteinE2EnhancesTcellresponsesforDNAimmunization,Vaccine.2007.25:1544-1551,)的大腸桿菌BL21DE3(購自美國invitrogen公司)培養(yǎng)于3ml含有氨芐青霉素(50g/ml)的LB培養(yǎng)基中，對照組別接種含有pGEX-KG(GST蛋白的原核表達(dá)載體，購自AmershamBiosciences公司)，37。C培養(yǎng)12-16小時。B.將小試管中的菌液分別轉(zhuǎn)移到200ml含有氨芐青霉素(50g/ml)的LB液體培養(yǎng)基(LB液體培養(yǎng)基為10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化鈉，溶解至1000ml雙蒸水)中，37'C培養(yǎng)到OD600為12。C.加入100mM異丙基-(5-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，使其終濃度為0.1mM,3(TC誘導(dǎo)45小時。D.將誘導(dǎo)以后的菌液分裝到250ml的離心管中，4。C,7700g，5min離心，棄上清。E.沉淀用磷酸鹽緩沖液PBS(140mM氯化鈉，2.7mM氯化鉀，10mM磷酸氫二鈉，1.8mM磷酸二氫鉀)洗滌1次,4。C，7700g,5min離心，棄上清。F.將沉淀重懸于8ml含1mM苯甲基磺酰氟(PMSF:17.42mgPMSF溶于lml異丙醇中，-20。C保存)的PBS中。G.將菌液放置冰中，超聲碎菌后加入20。/。曲通X-100(20%TritonX-100:1mlTritonX-100溶于4ml無菌雙蒸水中)，使其終濃度1%,4°C,輕混30分鐘。H.每EP管中加入lml超聲降解的菌液，4°C，12000g，10min離心，取上清。I.上清再次離心，4°C,12000g,10min，再取上清。J.各EP管加入20pi瓊脂糖凝膠4B(Sepharose4B:購自AmershamBiosciences公司)，室溫(20-25°C,以下相同)輕混30min。4°C，5000rpm,5min，離心，棄上清。K.每個EP管各加入100pi0.01MPBS洗滌，離心洗滌后將含有Separose4B的懸濁液收集于一管，4°C,5000卬m,5min，離心，棄上清，共洗滌3次。L.加入與Sepharose4B等量的GlutathioneEIutionBuffer(0.0154g谷光苷肽溶解于0.25mlpH8.0的1MPBS過濾除菌，分裝，4'C保存)，室溫輕混10min,4°C,5000rpm，5min，取上清。M.重復(fù)步驟L兩次。收集的上清則為所需E2-GST融合蛋白。二、制備隨機DNA文庫的步驟如下(見圖1):A.寡核昔酸為3，-CCTCTATATAGGTACCGATCG(NNM)i2AGGCCGGTAGTAGTAGTAGTAGTACCT4GGCCA-5'(90bp)(劃線部分分別為SD序列、啟始密碼子、HisTag、斜體部分為B"w//1酶切位點)(N代表A,C，T或G,M代表A或C)B.第一輪PCR的上游引物Ul為5'-GCTCGTATAATGTGTGGCCACAACGGA4GATATATCCATG-3'(43bp)(劃線部分為5'端莖環(huán)和斜體部分為核糖體結(jié)合位點:RBS)，下游引物Dl為3'-GTAGTA￡￡IQ-5，(52bp)(劃線部分分別為S麵HI酶切位點、Gly-Ser序列和3，端莖環(huán))C.第二輪PCR的上游引物U2為5'-GCGCTGCAGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTG-3'(42bp),(劃線部分分別為尸Wl酶切位點和Tac啟動子)。下游引物為D1。隨機ssDNA文庫和引物由上海博亞生物有限公司合成。隨機DNA文庫的構(gòu)建示意圖見圖1。D.以寡核普酸為模板，用引物U1和D1進(jìn)行第一輪PCR，反應(yīng)體系為:10XTagDNAPolymerasebuffer(含Mg2+)5|ul緒Pmix(10mM)引物Ul(20pM)"I引物Dl(20nM)寡核苷酸(0.05嗎1)"I雙蒸水40|alTagDNA聚合酶Jul總體積反應(yīng)程序a.95°C，2分鐘b.95°C，36秒；63°C，36秒；72°C，84秒；共25個循環(huán)。c.72°C，5分鐘E.PCR產(chǎn)物經(jīng)2。/。的瓊脂糖凝膠(0.4g瓊脂糖粉末溶解于20mllXTAE溶液)電泳，然后用回收試劑盒(QIAEXIIgelExtractionKit,美國promega公司)回收。F.經(jīng)步驟E回收所得的PCR產(chǎn)物作為模板，進(jìn)行第二輪PCR擴增，反應(yīng)體系為-10XTagDNAPolymerasebuffer(含Mg2+)5^1dNTPmix(10mM)1^1引物Ul(20pM).M引物Dl(20pM)第一輪PCR產(chǎn)物4|xl雙蒸水37plTagDNA聚合酶總體積50|al反應(yīng)程序a.95°C，2分鐘b.95°C，36秒；62°C，36秒；72°C，84秒；共25個循環(huán)。c.72°C，5分鐘G.步驟F所得得PCR產(chǎn)物經(jīng)2y。的瓊脂糖凝膠電泳，然后用回收試劑盒回收，回收所得片段即可用于體外轉(zhuǎn)錄翻譯DNA模板。三、制備核糖體展示文庫的步驟如下A.核糖體文庫(見參考文獻(xiàn)Wu,etal"P印^fe2005，26(11):2057-2063.),構(gòu)建及篩選流程如圖2所示:將編碼1014個隨機12肽的DNA庫在體外進(jìn)行偶聯(lián)的轉(zhuǎn)錄/翻譯，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA由于缺乏終止子，不能從核糖體上釋放，而與新生多肽、核糖體以共價鍵結(jié)合，形成一個穩(wěn)定的復(fù)合體結(jié)構(gòu)。利用連接有Sepharose4B的E2-GST蛋白(E2-GST—Sepharose4B)親和篩選核糖體表面的隨機多肽，分離特異性結(jié)合的mRNA—核糖體一多肽復(fù)合物，通過降低Mg^濃度，核糖體解離，釋放mRNA，回收核糖體富集庫中的mRNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA.PCR擴增，其產(chǎn)物可作為下一輪體外合成的模板，經(jīng)連接有Sepharose4B的GST蛋白(GST—Sepharose4B)反篩以去除非特異性結(jié)合的多肽,E2-GST—Sepharose4B正篩，經(jīng)過六輪篩選，篩選到與E2蛋白特異性結(jié)合的多肽。B.反應(yīng)體系DNA模板(0.3mg/ml)10plS30PremixwithoutAminoAcids20氨基酸混合液(無甲硫氨酸)2.5^1氨基酸混合液(無亮氨酸)2.5WE.coliS30Extract15pi總體積50(al輕輕混勻步驟B中各混合物，5000rpm，離心30秒，讓混合物沉積于EP管底部。C.3(TC孵育2.5小時。D.EP管冰上放置5分鐘中止反應(yīng)。即得到核糖體展示文庫。四、核糖體展示文庫篩選與丙肝病毒E2糖蛋白結(jié)合的多肽的步驟如下(見圖2)A．在100“1體外轉(zhuǎn)錄翻譯混合物中加入6單位的無RNA酶的DNase(Promega公司，美國)，10XDNaseI緩沖液(Promega公司，美國)6gl，37℃溫育30min。然后加§¨l中止緩沖液，65~C，10rain滅活DNase。B．取60“1E2一GST-Sepharose4B，4℃，5000rpm，5min離心，棄上清。C．沉淀用500glwashingbuffer(50mMpH7．5的Tris一醋酸，150mMNaCl，0．1％Tween．20．50mM醋酸鎂)洗滌3次。D．將100ul體外轉(zhuǎn)錄／翻譯混合物加入到洗滌過的E2-GST-Sepharose4B中，4℃搖動I小時。E4℃，5000rpm，5min離心，棄上清，沉淀用洗脫緩沖液洗滌3次。F．沉淀中加入100¨lelutionbuffer，4℃搖動10rain使mRNA與核糖體解離，4"C，5000rpm，5rain離心，取上清。G．用RNaidK“(購自biol01公司，美國)回收mRNA，具體方法如下g．上清中加入3倍體積的RNABindingSalt(RNaidKit成份)混勻。h．再加入lOglRNAMATRIX(RNaidKit成份)，室溫放置5min。i．13000rpm，1rain離心，棄上清。i．用RNAwash(RNaidKit成份)洗滌2次，(RNAwash~gg。11)。k．加入1．Ogl無RNase的H20，55口C溫育5min。1．13000rpm，2min離心，取上清，上清即是RNA模板，可用于RT-PCR。H．RT-PCR，其反應(yīng)體系為AMV／Tfl5×Reactionbuffer10“l(fā)dNTPmix混合物1“1引物U1(20raM)lpl引物Dl(20mM)1肛1硫酸鎂(25mM)2plAMVReverseTranscription1LLlYflDNA聚合酶1“l(fā)RNA模板1pl無酶水29^總體積50pi反應(yīng)程序為48°C，45分鐘；94°C，2分鐘；94°C，30秒；63°C,l分鐘，72°C，2分鐘；共31個循環(huán)；72°C,7分鐘I.2%瓊脂糖瓊脂糖凝膠電泳。J.回收分子量大小為155bp的RTPCR產(chǎn)物。K.以回收產(chǎn)物為模板，再行第二輪PCR擴增，回收分子量大小為181bp的PCR產(chǎn)物。L.將回收的第二輪PCR產(chǎn)物連接至載體pUC19(購自美國invitrogen公司)上，具體步驟為a.將PCR產(chǎn)物及載體pUC19酶切，反應(yīng)體系為10XY+Buffer2pi5應(yīng)HI1pi尸M1(ilddH2017|ul總體積20(J37'C水浴2小時b.分別回收分子量大小為128bp的DNA片段以及分子量大小為2.668kb的pUC19目的片斷(回收方法同上)。c.用DNA連接酶將步驟b所的DNA和載體pUC19連接，反應(yīng)體系為DNA4|alpUC192pilOXBuffer2^1T4連接酶2pi雙蒸水10^總體積20^16。C孵育20小時d.將步驟c所得的連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a。取連接產(chǎn)物lOpl，加入100)ilDH5a感受肽細(xì)胞，冰浴30分鐘，42°C90秒，再冰浴5分鐘，加入800)alLB液體培養(yǎng)基(LB液體培養(yǎng)基為10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化鈉，溶解至1000ml雙蒸水)，37°C，225rpm振搖4050分鐘。取200|il菌液均勻涂在有氨芐青霉素(Amp"抗性的LB固體培養(yǎng)基(LB固體培養(yǎng)基為10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化鈉，15g瓊脂粉溶解至1000ml雙蒸水)上(氨芐青霉素濃度為50|ag/ml)，37。C培養(yǎng)過夜。e.挑取單個克隆菌落，置于3mlLB液體培養(yǎng)基(含氨芐青霉50pg/ml)培養(yǎng)過夜。f.提取步驟e獲得的菌液的質(zhì)粒DNA。g.PCR鑒定步驟f所得的DNA，反應(yīng)體系為10xTaqDNApolymerasebuffer5(jldNTPmix混合物(l0mM)1引物U2(20mM)1pl引物D1(20mM)1^質(zhì)粒DNA1pi雙蒸水40|alTaqDNAPolymerase1pi總體積50pi反應(yīng)程序為95°C，2分鐘；95°C，30秒；62°C，1分鐘，72°C，l分鐘24秒；共25個循環(huán)；72°C，5分鐘h.將步驟g所得產(chǎn)物經(jīng)^^/7I和/VI鑒定，正確的克隆送至上海華諾公司測序。M.根據(jù)測序結(jié)果，請西安美聯(lián)公司合成12肽，見表l。表l篩選出的與E2蛋白結(jié)合的多肽序列<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>實施例2表面等離子共振技術(shù)(SPR)檢測多肽與E2蛋白的親和力的歩驟如下A.讓測試儀器Biocore(美國)通過一段HBS緩沖液直至基線穩(wěn)定。B.注射40)iU氨基偶聯(lián)試劑(含0.02M的l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)禾B0.05M的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS))，活化CM5傳感片上的羧基。C.用pH值為5.0的醋酸緩沖液將E2蛋白稀釋至5mg/ml，注射該溶液40D.上機檢測，流速為20(al/min。E.將多肽PE2A、PE2B、PE2C、PE2D稀釋為不同濃度，以2pl/min上機與CM5傳感片上的E2蛋白作用7分鐘。F.以2pl/min的流速注射10pl的HC1再生液使基線恢復(fù)，實時采集響應(yīng)信號。G.用BIACORE的專用軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，我們發(fā)現(xiàn)分析PE2D與E2蛋白的親和力最高，結(jié)果見圖3，其親和力有關(guān)參數(shù)見表2。表2多肽與E2蛋白相互結(jié)合作用的動力學(xué)數(shù)據(jù)多肽ka/M-V1(x104)kd/s1(x103)WM1(x107)PE2A3.221.392.32PE2B2.561.222.10PE2CnononoPE2D7.511.455.18實施例3流式細(xì)胞儀檢測多肽與靶分子細(xì)胞結(jié)合的步驟如下A.培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞Huh7.5(見參考文獻(xiàn)Zhong,etal.,RobusthepatitisCvirusinfectioninvitro,2005,PNAS,102:9294-9299)和DC-SIGN+-NIH3T3(表面有DC-Sign分子的小鼠的成纖維細(xì)胞)細(xì)胞(見參考文獻(xiàn)Wu,etal.，F(xiàn)unctionalevaluationofDC-SIGNmonoclonalantibodiesrevealsDC-SIGNinteractionswithICAM-3donotpromotehumanimmunodeficiencyvirustypeItransmission.J.virol.2002,76:5卯5-5914)。培養(yǎng)條件均為10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司購買)，培養(yǎng)于37°C，含5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中。B.將多肽PE2A、PE2B、PE2D分別與E2-GST蛋白混合(對照管加入GST蛋白)，總體積為50pl，其中多肽的濃度均為500pM，E2-GST蛋白和GST蛋白的濃度均為20|ag/ml，37。C孵育30分鐘。C.將步驟B所得的多肽與蛋白的混合物分別與收獲的Huh7.5和DC-SIGN+^1113丁3細(xì)胞混合，總體積為100pl，其中細(xì)胞個數(shù)為2乂106個。37°C孵育30分鐘。D.每管加入1mlPBS洗滌，1000rpm，5min，棄上清，用80|11重懸細(xì)胞。E.加入20pl1:500的E2-GST抗體，37。C孵育30分鐘。F.重復(fù)D步驟一次。G.加入1|ilPE標(biāo)記的羊抗兔的二抗，37t:孵育30分鐘。H.每管加入1mlPBS洗滌，1000rpm，5min，棄上清，用500(al重懸細(xì)胞。I.經(jīng)上機檢測，申請人發(fā)現(xiàn)PE2A,安PE2B，PE2D分別與E2-GST蛋白作用后，能顯著抑制￡2蛋白結(jié)合至,11117.5細(xì)胞(圖4)及0(:-810^^1]^丁3細(xì)胞(圖5)，且成劑量依賴關(guān)系，多肽劑量愈大，其與E2的親合力愈強，抑制HCVE2侵襲靶細(xì)胞能力愈強(圖4A和圖4B)。實施例4多肽D能部分競爭性抑制E2與HCV的受體CD81,和肝素的結(jié)合(圖5)。實施例5PE2D能抑制HCVppv假病毒(圖6A,6B)侵襲人靶細(xì)胞(圖6C).HCVppv假病毒的構(gòu)建見6A,6B,PE2D抑制HCVppv假病毒侵襲人靶細(xì)胞的能力呈劑量依賴性，多肽D濃度愈大,其抑制能力愈強(圖6C)。實施例6檢測多肽PE2D與丙肝病毒顆粒(HCVcc)結(jié)合的步驟如下A.96孔板里每孔加入丙肝病毒顆粒(3xl0S個病毒)和162pl碳酸氫鈉緩沖液(0.05MpH9.6)，混合，4'C孵育7小時。B.洗滌液(0.1。/。Tween-20的PBS磷酸鹽緩沖液)洗滌五次。C.每孔加入100^1封閉液(1%BSA的PBS磷酸鹽緩沖液)，4°C孵育過夜。D.洗滌液洗滌五次次后，分別加入O嗎，2昭，4嗎，3嗎的bio-PE2D到96孔板中，每孔體積為10(Hil，37°C孵育lh。E.洗滌五次后，加入lOPpl稀釋度為1:1000的辣根過養(yǎng)化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素(HRP-advin，購自晶美公司)。F.加入鄰苯二氨顯色，酶標(biāo)儀OD492nm下讀取OD值。顯示bio-PE2D能與丙肝病毒顆粒直接結(jié)合。該實驗證明分離得到的多肽能特異性結(jié)合丙肝病毒顆粒(HCVcc)，結(jié)合能力呈劑量依賴性(圖7)。實施例7檢測多肽PE2D抑制丙肝病毒顆粒(HCVcc)感染人肝細(xì)胞Huh7.5細(xì)胞的步驟如下A.培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞Huh7.5于24孔板中，置于37'C，含5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件為10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，。B.每孔加入PE2D和3xl()S個丙肝病毒顆粒，PE2D的濃度分為200pM，40p(iM。C.37'C孵育5小時，洗滌細(xì)胞后，加入培養(yǎng)基培養(yǎng)3天。D.加入熒光標(biāo)記的HCV-E2抗體(購自上海巴斯德研究所)與細(xì)胞孵育30分鐘E.熒光顯微鏡下計數(shù)每孔紅色熒光點數(shù)(ffu/we11，58nm)。該實驗證明分離得到的多肽PE2D能特異性抑制丙肝病毒顆粒(HCVcc感染人肝細(xì)胞，且劑量越大，抑制能力越強，呈劑量依賴性(圖8)。實施例8一種夾心法試劑盒在制備檢測丙型肝炎病毒包膜抗原的方法，利用該試劑盒檢測150例丙型肝炎病人血清里的丙肝病毒(該病毒是從湖北.武漢有關(guān)醫(yī)院收集到丙型肝炎病毒人血清里的丙肝病毒)，150例正常人血清作為對照(體檢收集到正常人血清為參考物)，步驟如下A.96孔酶標(biāo)板在紫外燈下照射2小時。每孔加入100^10.05%戊二醛，室溫(26°C)孵育1小時。每孔加入100)il30mg/L的多肽，室溫(26°C)孵育1小時,或4°C過夜。PBS洗滌3遍，甩干。B.封被每孔加入100pl封閉液乙醇胺封閉過夜，4°C孵育過夜。C.重復(fù)B步驟一次。D.每孔加入lOO)il丙肝病人血清或健康人血清，37。C孵育l2小時。E.重復(fù)B步驟一次。F.每孔加入lOOjil10mg/L的生物素標(biāo)記的多肽(北京華大基因公司合成)37i:孵育12小時。G.重復(fù)B步驟一次。H.每孔加入100^1辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素(稀釋度為1:1000)，37。C孵育30分鐘。I.加入鄰苯二氨顯色，酶標(biāo)儀OD492nm下讀取OD值(見圖9)。結(jié)果顯示生物素標(biāo)記的多肽能特異性與丙肝病人血清里的病毒直接結(jié)合，其OD值大于與正常人血清結(jié)合的OD值的23倍以上?？蛇_(dá)到直接檢測病人血樣里病毒含量的效果SEQUENCELISTING<110>武漢大學(xué)<120>丙型肝炎病毒包膜抗原夾心法試劑盒及檢測方法<130〉丙型肝炎病毒包膜抗原夾心法試劑盒及檢測方法<160>4<170>Patentlnversion3.1<210>1<211>12<212〉PRT<213〉人工合成<400>1GlyPheGlyArgTyrArgArgHisGlySerProT卬1510<210>2<211〉12<212>PRT<213>人工合<400〉2MetAlaHeGlyProTyrProAlaCysGlySerGy1510<210>3<211>12<212>PRT<213>人工合成<400>3LeuSerValLeuValHeSerMetPheAsnAlaVal<formula>formulaseeoriginaldocumentpage27</formula>權(quán)利要求1、一種丙型肝炎病毒包膜抗原夾心法試劑盒，該試劑盒包括a.生物素等標(biāo)記的能與HCVE2蛋白特異性結(jié)合的多肽；b.多肽為SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4所示的序列；c.辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素；d.辣根過氧化物酶底物；e酶標(biāo)板，酶標(biāo)儀；f.酶聯(lián)免疫檢測儀；g.E2蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)陽性對照。2、利用權(quán)利要求1所述的一種夾心法試劑盒在制備檢測丙型肝炎病毒包膜抗原的方法，該檢測方法包括下列步驟-A.96孔酶標(biāo)板在紫外燈下照射2小時,每孔加入100pi0.05%戊二醛，室溫26。C孵育1小時,每孔加入100^30mg/L的多肽，室溫26'C孵育1小時,或4oC過夜,PBS洗滌3遍，甩干；B.洗滌液為0.1%Tween-20的PBS磷酸鹽緩沖液洗滌五次；C.封被每孔加入100pl封閉液乙醇胺封閉過夜，4°C孵育過夜；D.重復(fù)B步驟一次；E.每孔加入100^U丙肝病人血清或健康人血清，26。C-37。C孵育1~2小時；F.重復(fù)B步驟一次；G.每孔加入100)all0mg/L的生物素標(biāo)記的多肽，37'C孵育12小時；H.重復(fù)B步驟一次；I.每孔加入lOOpd辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素，稀釋度為1:1000，37。C孵育30分鐘，加入辣根過氧化物酶底物鄰苯二氨顯色，酶標(biāo)儀OD492nm下讀取OD值。全文摘要本發(fā)明公開了一種丙型肝炎病毒包膜抗原夾心法試劑盒及檢測方法，包括酶標(biāo)板，能與HCVE2蛋白特異性結(jié)合的三種多肽，生物素標(biāo)記的能與HCVE2蛋白特異性結(jié)合的三種多肽，辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素。一種夾心法試劑盒在制備檢測丙型肝炎病毒包膜抗原的方法，步驟是首先包被多肽，再加入待測病人血清，第三是加入生物素標(biāo)記的多肽，第四是加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素，第五是加入鄰苯二氨顯色，酶標(biāo)儀OD450nm下讀取OD值。多肽及其標(biāo)記物作為檢測丙型肝炎病毒包膜抗原的試劑盒中的應(yīng)用?？蓮V泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域。文檔編號G01N33/576GK101458255SQ200710168890公開日2009年6月17日申請日期2007年12月14日優(yōu)先權(quán)日2007年12月14日發(fā)明者章曉聯(lián)申請人:武漢大學(xué)