一種汞離子快速檢測(cè)金標(biāo)試紙條或卡的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種用于快速檢測(cè)汞離子的金標(biāo)試紙條／卡，包括底層支撐板(1)、樣品墊(2)、金標(biāo)抗體結(jié)合墊(3)、纖維素膜(4)、吸水墊(5)。本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)對(duì)環(huán)境、土壤、水、食品、藥物、化妝品中鉛離子污染殘留的快速檢測(cè)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種汞離子快速檢測(cè)金標(biāo)試紙條或卡【技術(shù)領(lǐng)域】:[0001]本發(fā)明涉及的是一種用于快速檢測(cè)汞離子的金標(biāo)試紙條/卡及其制備方法與應(yīng)用，屬于免疫學(xué)和衛(wèi)生檢驗(yàn)學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】?！颈尘凹夹g(shù)】:[0002]汞，俗稱(chēng)水銀，是在常溫、常壓下唯一以液態(tài)存在的金屬，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，汞常溫下即可蒸發(fā)，汞蒸氣和汞的化合物多有劇毒。汞使用的歷史悠久，在殷商時(shí)期古代人民就使用天然的硫化汞。汞的用途廣泛，常用于制造科學(xué)測(cè)量?jī)x器、藥物、催化劑、汞蒸氣燈、電極、雷汞、化妝品等。汞在自然界中普遍存在，一般動(dòng)物植物中都含有微量的汞。我國(guó)是汞的生產(chǎn)、 使用和排放大國(guó)，汞污染防治形勢(shì)十分嚴(yán)峻。重金屬汞是環(huán)境污染持久的劇毒物質(zhì)，毒性高，損害人類(lèi)健康，汞污染已成為全球性重大環(huán)境問(wèn)題，亦引起了我國(guó)政府的高度重視，汞污染防治已被列為“十二五規(guī)劃”重大專(zhuān)項(xiàng)。汞中毒以慢性為多見(jiàn)，主要在生產(chǎn)或使用活動(dòng)中，長(zhǎng)期吸入汞蒸氣和汞化合物粉塵所致。汞蒸氣較易透過(guò)肺泡壁細(xì)胞膜，與血液中的脂質(zhì)結(jié)合，很快分布到全身各組織。汞在紅細(xì)胞和其它組織中被氧化成Hg2+，并與蛋白質(zhì)結(jié)合而蓄積。金屬汞在胃腸道幾乎不吸收。慢性汞中毒主要癥狀表現(xiàn)為精神異常、齒齦炎、震顫、 腎炎等。急性汞中毒主要表現(xiàn)為急性腐蝕性口腔炎和胃腸炎，嚴(yán)重時(shí)可發(fā)生急性腎功能衰竭、肝臟損害。皮膚接觸汞及其化合物可引起接觸性皮炎，具有變態(tài)反應(yīng)性質(zhì)。皮疹為紅斑丘疹，可融合成片或形成水皰，愈后遺有色素沉著。[0003]由于汞的污染和危害性較大，我國(guó)制定了土壤、食品、水體、化妝品等涉汞領(lǐng)域中的國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn)，食品中牛乳萊允許量標(biāo)準(zhǔn)(GB2762-94)為< 0.01mg / kg,地下水質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(GB7468-2012)中規(guī)定，主要適用于集中式生活飲用水水源及農(nóng)田灌溉水的汞離子限量 ^ 0.0Olmg / L0[0004]目前，檢測(cè)環(huán)境汞離子的方法主要有:[0005](I)物理和化學(xué)分析方法:包括分光光度法、原子吸收光譜法(AAS)、電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(ICP-AES)、原子熒光光譜法 (AFS)等。這些方法各有自己優(yōu)缺點(diǎn)，分光光度法操作簡(jiǎn)單，快速，干擾小，但其靈敏度不高； 原子吸收光譜法、電感耦合等離子體質(zhì)譜法、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法、原子熒光光譜法具有選擇性好、測(cè)定精度高、簡(jiǎn)單、快速等優(yōu)點(diǎn)，但所用儀器比較昂貴，只能在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)，且對(duì)操作人員技術(shù)要求較為嚴(yán)格，限制了其廣泛使用。[0006](2)免疫學(xué)分析方法:包括酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，和膠體金免疫層析法。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)以競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫反應(yīng)為檢測(cè)原理，反應(yīng)顯色后用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光值 (OD)值進(jìn)行結(jié)果判定?？s短了檢測(cè)時(shí)間，可以對(duì)重金屬進(jìn)行定性定量檢測(cè)。但ELISA方法需要配套的酶標(biāo)儀和配套試劑，操作過(guò)程仍較復(fù)雜，而且國(guó)內(nèi)現(xiàn)處在研發(fā)階段，進(jìn)口國(guó)外產(chǎn)品價(jià)格昂貴，因而ELISA方法的應(yīng)用受到了較大限制。膠體金免疫層析法(GICA)，其檢測(cè)原理是當(dāng)待檢樣本與吸附在在膜上的膠體金標(biāo)記物(抗體或單克隆抗體)結(jié)合后，通過(guò)層析，與固定在膜上的特異性的抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合而被截留，`聚集在檢測(cè)帶上，可通過(guò)肉眼觀察到膠體金標(biāo)記物的顯色結(jié)果。膠體金免疫層析技術(shù)因具有攜帶方便、操作簡(jiǎn)便、 快速、特異性強(qiáng)、敏感性高、影響因素少、無(wú)需特殊儀器和標(biāo)本不易污染等優(yōu)點(diǎn)，適合對(duì)大批 量樣品進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)初篩，從而被廣泛用于免疫學(xué)、組織學(xué)、病理學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等眾多領(lǐng)域。[0007]目前成熟的汞檢測(cè)技術(shù)多是借助大型分析儀器，無(wú)法滿(mǎn)足廉價(jià)、快速的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè) 需求。而商品化的快速檢測(cè)儀器和汞試紙條，其靈敏度低(檢測(cè)下限為0.1mg / L)，達(dá)不到 國(guó)標(biāo)規(guī)定的限值(污水0.05mg / L，飲用水0.0Olmg / L)，且選擇性差，無(wú)法滿(mǎn)足靈敏、準(zhǔn) 確的檢測(cè)要求。因此，研究一種新型汞離子快速檢測(cè)金標(biāo)試紙產(chǎn)品，可以快速、簡(jiǎn)便、敏感、 特異、經(jīng)濟(jì)、篩檢量大的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)重金屬Hg2+，是當(dāng)前的迫切需要的，對(duì)于減少環(huán)境污染、提 高食品質(zhì)量、保障食品安全具有重要意義。
【發(fā)明內(nèi)容】
:[0008]本發(fā)明的目的提供一種能夠快速、簡(jiǎn)便、敏感、特異的檢測(cè)汞離子污染殘留的快速 檢測(cè)汞離子金標(biāo)試紙條和試紙卡。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，擬采用如下技術(shù)方案:[0009]本發(fā)明一方面涉及一種用于快速檢測(cè)汞離子的試紙條，所述包括底層支撐板(I)、 樣品墊(2)、金標(biāo)抗體結(jié)合墊(3)、纖維素膜(4)、吸水墊(5)、包被膜(6)和外卡(7)，其特 征在于:所述試紙條是以底層支撐板為底部支撐，將樣品墊、金標(biāo)抗體結(jié)合墊、纖維素膜、吸 水墊和包被膜依次粘貼于底層支撐板上。所述試紙卡是以試紙條為基礎(chǔ)，加上外卡制成。 所述底層支撐板和外卡均由硬質(zhì)塑料制成，所述樣品墊與金標(biāo)抗體結(jié)合墊由玻璃纖維棉制 成；所述金標(biāo)抗體結(jié)合墊包被有膠體金標(biāo)記的能識(shí)別汞離子的單克隆抗體；所述纖維素膜 中部依次平行排列有隱形檢測(cè)線(T線)和質(zhì)控線(C線)，檢測(cè)線包被有汞離子與載體蛋白 形成的偶聯(lián)物，質(zhì)控線包被有兔抗鼠IgG(RaMIgG)(或羊抗鼠IgG(GaMIgG))。[0010]所述的汞離子金標(biāo)試紙條/卡，所述的螯合劑包括異硫氰酸芐基乙二胺四乙酸 (ITCBE)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、還原谷胱甘肽(GSH);所述載體 蛋白包括雞卵清白蛋白(OVA)、牛血清白蛋白BSA、匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)。[0011]所述的汞離子金標(biāo)試紙條/卡，其特征是:所述的檢測(cè)抗原汞離子-螯合劑-載體 蛋白，以Hg2+-1TCBE-OVA為例，其制備步驟如下:[0012](I)稱(chēng)取 20mg OVA 溶于 ImL ρΗ9.0 的 HEPES 緩沖液(IOmM / L)中形成 20mg / mL的載體蛋白溶液。[0013](2)稱(chēng)取IOmg ITCBE溶于ImL 二甲基亞砜(DMSO)中形成金屬螯合劑溶液；[0014](3)將0.5mL金屬螯合劑溶液逐滴加到OVA載體蛋白溶液中，混勻后，加入IOOul 三正丁胺(1.5M)，搖床室溫反應(yīng)24h，制成0VA-1TCBE溶液。[0015](4)取11.25mg硝酸萊(Hg (NO3) 2)溶于IOOul蒸懼水中，形成均勻的Hg2+溶液；[0016](5)將Hg2+溶液加入到0VA-1TCBE溶液中，調(diào)節(jié)pH值至7.4，在室溫下，搖床孵育 4h，然后移入透析袋中PBS透析10d，即形成Hg2+-1TCBE-OVA,收集分裝，_20°C凍存。[0017]所述的重金屬汞離子金標(biāo)試紙條/卡，其特征是:所述的金標(biāo)試紙由以下步驟制 備:[0018](I)膠體金溶液制備:采用檸檬酸鹽還原法制備，取IOOOmL三角燒瓶，加入975mL 雙蒸水煮沸，加入15mL朽1檬酸三鈉繼續(xù)加熱5min,加入IOmLl %氯金酸,繼續(xù)加熱至溶液呈 現(xiàn)橘紅色，冷卻至室溫后，4°C保存?zhèn)溆?。[0019](2)單克隆抗體制備:用汞離子-螯合劑-載體蛋白免疫小鼠，以Hg2+-1TCBE-OVA 為例，說(shuō)明如下:用Hg2+-1TCBE-OVA免疫6周雌性BALB / C小鼠5只，劑量為50 μ g /0.2mL /只，背部皮下分點(diǎn)注射。選擇細(xì)胞融合備用小鼠，間接ELISA檢測(cè)抗血清中Hg2+ 螯合物PAb效價(jià)，阻斷ELISA檢測(cè)Hg2+-1TCBE pAb對(duì)Hg2+-1TCBE的IC5(I，挑選效價(jià)最高、 IC5tl最低的小鼠，超免用于細(xì)胞融合。采用細(xì)胞融合技術(shù)無(wú)菌取脾臟制備脾細(xì)胞，在50% PEG (pH8.0)作用下與NSO骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合；用間接ELISA和阻斷ELISA進(jìn)行陽(yáng)性雜交 瘤細(xì)胞株的篩選，選擇強(qiáng)陽(yáng)性、抑制率高、細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛的孔進(jìn)行3次有限稀釋克隆化。分 別于凍存15d、30d和60d后復(fù)蘇雜交瘤細(xì)胞，培養(yǎng)后取上清液，間接ELISA測(cè)定抗體效價(jià)， 考察雜交瘤細(xì)胞分泌單克隆抗體的穩(wěn)定性，獲得一株雜交瘤細(xì)胞株；之后采用體內(nèi)誘生腹 水法制備Hg2+-1TCBE-OVA mAb，取8周齡健康Balb / c雌性小鼠，腹腔注射FIA0.5mL / 只，10?15天后使用。將培養(yǎng)的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞IOOOrpm離心IOmin棄上清，收集細(xì)胞沉 淀。用滅菌的PBS將細(xì)胞沉淀懸浮、混勻，將細(xì)胞數(shù)調(diào)至IO6 / mL，腹腔注射Balb / C小 鼠0.5mL /只。接種細(xì)胞7-10天后產(chǎn)生腹水，進(jìn)行收集，于37°C水浴30min，4°C放置過(guò)夜， 12000rpm離心5min,棄去上層的脂肪、IFA和下層的沉淀,飽和硫酸銨鹽析法提純后測(cè)定 IgG含量和效價(jià)，_20°C保存?zhèn)溆?。[0020](3)金標(biāo)抗體制備:將待標(biāo)單克隆抗體溶液IOOOOr / min離心30min,用0.1mol / L K2CO3溶液調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH值至8.2 ;根據(jù)聚沉現(xiàn)象，確定汞離子-螯合劑-載體蛋 白mAb與膠體金溶液最適標(biāo)記濃度，Hg2+-1TCBE-OVAmAb為0.175mg / mL。取膠體金溶液 10mL，用0.1mol / L K2CO3溶液調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH值至8.2。取等量的濃度為0.175mg / mL單克隆抗體溶液,磁力攪拌下混合,室溫孵育15min, IOOOOr / min離心30min,棄上清， 沉淀物用0.02mOl / LNa2B4O7溶液(含IOg / L OVA,0.5g / L疊氮鈉)稀釋?zhuān)?°C保存?zhèn)?用。[0021](4)金標(biāo)抗體結(jié)合墊制備:裁取規(guī)格為20X4mm的玻璃纖維棉，將金標(biāo)抗體用 X-only單向噴點(diǎn)儀均勻噴灑于玻璃纖維棉上，37°C干燥lh，密封，4°C保存?zhèn)溆?。[0022](5)硝酸纖維素膜上檢測(cè)線、質(zhì)控線制備:將濃度為Img / ml的汞離子-螯合 劑-載體蛋白放于X-only單向噴點(diǎn)儀忙存池A,濃度為Img / ml的RaMIgG(GaMIgG)放于 貯存池B，開(kāi)機(jī)分別點(diǎn)射于膜中央，形成間距0.5cm的檢測(cè)線和質(zhì)控線，自然干燥，密封，4°C 保存?zhèn)溆?。[0023](6)金標(biāo)試紙條組裝:將樣品墊、金標(biāo)抗體結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊按順序 依次粘貼于支撐板上，并在樣品墊與金標(biāo)抗體結(jié)合墊表面粘貼MAX線，在切槽機(jī)上切割成 寬度4_的金標(biāo)試紙。[0024](7)金標(biāo)試紙卡組裝:將制備好的金標(biāo)試紙條加上外卡制成。[0025]所述的汞離子金標(biāo)試紙條/卡檢測(cè)線上汞離子-螯合劑-載體蛋白的包被量為 IuL / cm，載體蛋白濃度為Img / mL。所述質(zhì)控線上RaMIgG (或GaMIgG)的包被量為 IyL/ cm, RaMIgG (或 GaMIgG)的濃度為 Img / mL。[0026]一種快速檢測(cè)汞離子的金標(biāo)試紙條/卡，其檢測(cè)步驟:[0027](I)樣品預(yù)處理方法:樣品包括土壤、水、食品、飼料、動(dòng)物組織、血液、尿液、化妝 品、藥物。待檢物采用壓力消解罐消解預(yù)處理。取1.000-3.0OOg樣品(固體待檢物研磨搗 碎)或3ml液體樣品放入聚四氟乙烯內(nèi)罐，加硝酸3ml浸泡過(guò)夜。加30%過(guò)氧化氫3ml，蓋好內(nèi)蓋，旋緊不銹鋼外套，放入恒溫干燥箱，120-140°C，3h，自然冷卻至室溫，過(guò)濾消化液， 轉(zhuǎn)入IOml容量瓶中待用。按照1:1體積將樣品消化液與10%螯合劑(ITCBE、EDTA、DTPA、 GSH)混勻，使汞離子與螯合劑充分螯合，形成樣品待測(cè)液。[0028](2)檢測(cè)步驟:取100μ L待測(cè)樣品，將所述的汞離子金標(biāo)試紙條插入待測(cè)樣品中， 室溫反應(yīng)5min,水平放置,觀察結(jié)果，IOmin以后結(jié)果無(wú)效?；蛴玫喂芪〈郎y(cè)樣品100 μ L, 滴加于試紙卡的樣品孔上，反應(yīng)5min,觀察結(jié)果，IOmin以后結(jié)果無(wú)效。[0029](3)分析檢測(cè)結(jié)果:T線、C線均顯色，判為陰性，表示樣品中汞離子濃度小于 2ng / mL或樣品中不含汞離子；僅C線顯色，而T線不顯色，判為陽(yáng)性，表示樣品中汞離子 濃度大于Ing / mL ;若C線不顯色，無(wú)論T線是否顯色，均判為金標(biāo)試紙失效。[0030]所述的汞離子金標(biāo)試紙的檢測(cè)靈敏度為Ing / mL ;所述的汞離子金標(biāo)試紙可應(yīng)用 于環(huán)境、土壤、水、食品、化妝品、藥物中汞離子污染殘留快速檢測(cè)中?！緦?zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】:[0031]圖1為汞離子快速檢測(cè)金標(biāo)試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖:其中1、樣品墊，2、金標(biāo)抗體結(jié) 合墊，3、質(zhì)控線(C線)，4、檢測(cè)線(T線)，5、吸水墊，6、硝酸纖維素膜，7、支撐板，8、包被膜；[0032]圖2為汞離子快速檢測(cè)金標(biāo)試紙的顯色結(jié)果示意圖；[0033]圖3為汞離子快速檢測(cè)金標(biāo)試紙卡結(jié)構(gòu)示意圖:其中1、手柄，2、質(zhì)控線，3、檢測(cè) 線，4、上樣端。【具體實(shí)施方式】:[0034]實(shí)施例一、汞離子人工免疫抗原制備[0035]采用制備人工免疫抗原汞離子-螯合劑-載體蛋白，以Hg2+-1TCBE-OVA為例，稱(chēng) 取20mg卵清蛋白(OVA)溶于ImL pH9.0的HEPES緩沖液(IOmM / L)中形成20mg/mL的 載體蛋白溶液。稱(chēng)取IOmgl-(4-異硫氰根苯基)-乙二胺四乙酸(ITCBE)溶于ImL 二甲基 亞砜(DMSO)中形成金屬螯合劑溶液；將0.5mL金屬螯合劑溶液逐滴加到OVA載體蛋白溶 液中，混勻后，加入IOOul三正丁胺(1.5M)，搖床室溫反應(yīng)24h，制成0VA-1TCBE溶液。取11.25mg硝酸汞(Hg(NO3)2)溶于IOOul蒸餾水中，形成均勻的Hg2+溶液；將Hg2+溶液加入到 0VA-1TCBE溶液中，調(diào)節(jié)pH值至7.4，在室溫下，搖床孵育4h，然后移入透析袋中PBS透析 IOd,即形成Hg2+-1TCBE-OVA,收集分裝，_20°C凍存。制備出人工免疫抗原Hg2+-1TCBE-OVA。[0036]紫外分光光度法掃描可見(jiàn)OVA的最大吸收峰在280nm處，偶聯(lián)物在濃度與OVA濃 度相同的情況下的紫外掃描光譜中表現(xiàn)出了各自光譜圖的迭加性質(zhì)；SDS-PAGE電泳法結(jié) 果可見(jiàn)OVA的泳動(dòng)速度大于偶聯(lián)物，說(shuō)明偶聯(lián)物Hg2+-1TCBE-OVA的分子量大于0VA，證明偶 聯(lián)成功。[0037]所以SM水溶液在紫外波長(zhǎng)下沒(méi)有特征吸收峰，[0038]實(shí)施例二、汞離子人工免疫抗原鑒定[0039]采用二喹啉甲酸法測(cè)定Hg2+-1TCBE-OVA中載體蛋白OVA濃度。以O(shè)VA作為 標(biāo)準(zhǔn)蛋白，配成 Oug / mL、10 μ g/mL、20 μ g/mL、40 μ g/mL、60 μ g/mL、80 μ g / mL 的 濃度梯度，用二喹啉甲酸法構(gòu)建濃度檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。OVA濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程為: y=0.0035x+0.0065, R2=0.9981，其中y為樣品在波長(zhǎng)為562nm處吸光度，x為樣品蛋白濃度。[0040]采用ICP-AES 法測(cè)定 Hg2+-1TCBE-OVA Hg2+ 中的濃度。將 100 μ g / mL 的 Hg2+-1TCBE-OVA 中 Hg2+標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用 2% 的硝酸稀釋成 Oyg / mL、0.Iyg / mL、0.2 μ g / mL>0.4μ g / mL>0.6 μ g / mL>0.8 μ g / mL的濃度梯度,儀器軟件自動(dòng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得 出線性回歸方程Y=0.0174X+0.0019，相關(guān)系數(shù)0.9989 ;在253.7nm波長(zhǎng)的最佳優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條 件下進(jìn)行測(cè)定，儀器軟件自動(dòng)分析結(jié)果。[0041]實(shí)施例三、抗汞離子單克隆抗體制備[0042]用Hg2+-1TCBE-OVA 免疫 6 周雌性 BALB / C 小鼠 5 只，劑量為 50 μ g / 0.2mL / 只， 背部皮下分點(diǎn)注射。選擇細(xì)胞融合備用小鼠，間接ELISA檢測(cè)抗血清中Hg2+螯合物pAb效 價(jià)，阻斷ELISA檢測(cè)Hg2+-1TCBE pAb對(duì)Hg2+-1TCBE的IC5tl，挑選效價(jià)最高、IC5tl最低的小鼠，超 免用于細(xì)胞融合。采用細(xì)胞融合技術(shù)無(wú)菌取脾臟制備脾細(xì)胞，在50% PEG (pH8.0)作用下與 NSO骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合；用間接ELISA和阻斷ELISA進(jìn)行陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株的篩選，選擇 強(qiáng)陽(yáng)性、抑制率高、細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛的孔進(jìn)行3次有限稀釋克隆化。分別于凍存15d、30d和60d 后復(fù)蘇雜交瘤細(xì)胞，培養(yǎng)后取上清液，間接ELISA測(cè)定抗體效價(jià)，考察雜交瘤細(xì)胞分泌單克 隆抗體的穩(wěn)定性，獲得一株雜交瘤細(xì)胞株；之后采用體內(nèi)誘生腹水法制備Hg2+-1TCBE-OVA mAb，取8周齡健康Balb / c雌性小鼠，腹腔注射FIA0.5mL /只，10?15天后使用。將培 養(yǎng)的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞IOOOrpm離心IOmin棄上清，收集細(xì)胞沉淀。用滅菌的PBS將細(xì)胞沉淀 懸浮、混勻，將細(xì)胞數(shù)調(diào)至IO6 / mL，腹腔注射Balb / C小鼠0.5mL /只。接種細(xì)胞7_10天 后產(chǎn)生腹水，進(jìn)行收集，于37°C水浴30min，4°C放置過(guò)夜，12000rpm離心5min，棄去上層的 脂肪、IFA和下層的沉淀，飽和硫酸銨鹽析法提純后測(cè)定IgG含量和效價(jià)，_20°C保存?zhèn)溆谩0043]實(shí)施例四、抗汞離子單克隆抗體鑒定[0044]腹水效價(jià)測(cè)定。給腹腔注射液體石蠟IOd后的小鼠腹腔注射克隆化細(xì)胞株IO7個(gè) 細(xì)胞，7d后抽取腹水，飽和硫酸銨鹽析法提純，間接ELISA測(cè)定效價(jià)。測(cè)定結(jié)果，單克隆抗體 腹水效價(jià)為1:6.9Χ105。[0045]親和力鑒定。飽和ELISA測(cè)定親和常數(shù)(Ka)，用濃度分別為3.4 μ g / mL和 1.7μ g / mL 的 Hg2+-1TCBE-OVA 包被，加入倍比稀釋的 Hg2+-1TCBE mAb，再加入 GaMIgG-HRP， TMB顯色測(cè)A45tlnm值，以Hg2+-1TCBE mAb濃度為橫坐標(biāo)，以A45tlnm值為縱坐標(biāo)，繪出相應(yīng)的2條 反應(yīng)曲線，以每條曲線上部平坦段的A45tlnm值作為100%，在曲線上算出50% A45tlnm值時(shí)對(duì)應(yīng) 的 Hg2+-1TCBE mAb 濃度,按照公式 Kaff= (n-1) / 2(n[Ab' ]t_[Ab]t)計(jì)算 Ka。單克隆抗 體的 Ka 為 1.52 X IO10L / mol。[0046]敏感性鑒定。用阻斷ELISA測(cè)定Hg2+-1TCBE mAb對(duì)不同濃度Hg2+-1TCBE的抑制率， 以抑制率B / Btl為縱坐標(biāo)，以不同濃度Hg2+-1TCBE的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線， 進(jìn)行相關(guān)回歸分析，計(jì)算Hg2+-1TCBE mAb對(duì)Hg2+-1TCBE的IC5tl。鑒定結(jié)果，IC5tl為28.14yg / L0[0047]特異性鑒定。采用交叉反應(yīng)試驗(yàn)鑒定其特異性。交叉反應(yīng)試驗(yàn)選擇汞、鉻、鉛、鋅、 銅、銫、鈷、鑰、鐵與ITCBE的鰲合物(鰲合方法同上)和ITCBE溶液做為抑制劑，用阻斷 ELISA 測(cè)定各抑制物的 IC5Q，以 Hg2+-1TCBE mAb 對(duì) Hg2+-1TCBE 的 IC5tl 和 Hg2+-1TCBE mAb 對(duì) 各競(jìng)爭(zhēng)物的IC5tl之比的百分?jǐn)?shù)為其交叉反應(yīng)率(cross-reactivity, CR% )。鑒定結(jié)果,與 其它重金屬離子交叉反應(yīng)小于0.01 %。[0048]實(shí)施例五、汞離子金標(biāo)試紙條/卡制備[0049](I)膠體金溶液制備:采用檸檬酸鹽還原法制備，取1000mL三角燒瓶，加入975mL 雙蒸水煮沸，加入15mL檸檬酸三鈉繼續(xù)加熱5min,加入IOmLl %氯金酸,繼續(xù)加熱至溶液呈現(xiàn)橘紅色，冷卻至室溫后，4°C保存?zhèn)溆?。[0050](2)金標(biāo)抗體制備:將待標(biāo)單克隆抗體溶液1000Or / min離心30min,用0.1mol / L K2CO3溶液調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH值至8.2 ;根據(jù)聚沉現(xiàn)象，確定汞離子-螯合劑-載體蛋白mAb與膠體金溶液最適標(biāo)記濃度，Hg2+-1TCBE-OVAmAb為0.175mg / mL。取膠體金溶液 10mL，用0.1mol / L K2CO3溶液調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH值至8.2。取等量的濃度為0.175mg / mL單克隆抗體溶液,磁力攪拌下混合,室溫孵育15min, 1000Or / min離心30min,棄上清， 沉淀物用0.02mOl / LNa2B4O7溶液(含IOg / L 0VA、0.5g/L疊氮鈉)稀釋?zhuān)?°C保存?zhèn)溆?。[0051](3)金標(biāo)抗體結(jié)合墊制備:裁取規(guī)格為20X4mm的玻璃纖維棉，將金標(biāo)抗體用 X-only單向噴點(diǎn)儀均勻噴灑于玻璃纖維棉上，37°C干燥lh，密封，4°C保存?zhèn)溆谩0052](4)硝酸纖維素膜上檢測(cè)線、質(zhì)控線制備:將濃度為Img / ml的汞離子-螯合劑-載體蛋白放于X-only單向噴點(diǎn)儀忙存池A,濃度為lmg/ml的RaMIgG(GaMIgG)放于忙存池B，開(kāi)機(jī)分別點(diǎn)射于膜中央，形成間距0.5cm的檢測(cè)線和質(zhì)控線，自然干燥，密封，4°C保存?zhèn)溆?。[0053](5)金標(biāo)試紙條組裝:將樣品墊、金標(biāo)抗體結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊按順序依次粘貼于支撐板上，并在樣品墊與金標(biāo)抗體結(jié)合墊表面粘貼MAX線，在切槽機(jī)上切割成寬度4_的金標(biāo)試紙。[0054](6)金標(biāo)試紙卡組裝:將制備好的金標(biāo)試紙條加上外卡制成。[0055]實(shí)施例六、汞離子金標(biāo)試紙條/卡性能測(cè)定[0056](I)本發(fā)明汞離子金標(biāo)試紙條/卡的敏感度試驗(yàn)[0057]用汞離子金標(biāo)試紙測(cè)定濃度分別為0、l、2、4、8、16、32、64、128、256ng / mL的汞離子標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)重復(fù)，根據(jù)檢測(cè)線與對(duì)照線的顏色進(jìn)行肉眼判定或是用讀條儀進(jìn)行讀值。顯色區(qū)出現(xiàn)兩條線，且T線顏色明顯淺于C線顏色；或者顯色區(qū)只出現(xiàn)一條C 線，而T線不顯色，判為陽(yáng)性。陽(yáng)性結(jié)果表示含量汞離子≤Ing / mL ;顯色區(qū)出現(xiàn)檢測(cè)線(T 線)和對(duì)照線(C線)兩條線，且T線顏色不淺于C線顏色，判為陰性。無(wú)效:顯色區(qū)兩條線 (T線和C線)均不出現(xiàn)，表明操作有誤或試紙失效，判為無(wú)效。結(jié)果見(jiàn)表1，由表1可知，汞離子金標(biāo)試紙的目測(cè)檢測(cè)限為Ing / mL。[0058]表1測(cè)定金標(biāo)試紙敏感度試驗(yàn)(n=6)[0059]
【權(quán)利要求】
1.一種用于快速檢測(cè)汞離子的金標(biāo)試紙條，包括底層支撐板(1)、樣品墊(2)、金標(biāo)抗體結(jié)合墊(3)、纖維素膜(4)、吸水墊(5)，其特征在于:所述試紙條是以底層支撐板為底部支撐，將樣品墊、金標(biāo)抗體結(jié)合墊、纖維素膜、吸水墊和包被膜依次粘貼于底層支撐板上所述底層支撐板和外卡均由硬質(zhì)塑料制成，所述樣品墊與金標(biāo)抗體結(jié)合墊以玻璃纖維棉為基質(zhì)，所述金標(biāo)抗體結(jié)合墊包被有膠體金標(biāo)記的能識(shí)別汞離子的單克隆抗體；所述纖維素膜中部依次平行排列有隱形檢測(cè)線(T線)和質(zhì)控線(C線)，檢測(cè)線包被有汞離子與載體蛋白通過(guò)螯合劑形成的偶聯(lián)物，質(zhì)控線包被有兔抗鼠IgG(RaMIgG)或羊抗鼠IgG(GaMIgG))。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)汞離子金標(biāo)試紙條，其特征是:所述的螯合劑選自異硫氰酸芐基乙二胺四乙酸(ITCBE)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、還原谷胱甘肽(GSH)中的一種；所述載體蛋白選自雞卵清白蛋白(OVA)、牛血清白蛋白(BSA)、 匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)中的一種；優(yōu)選的，所述的偶聯(lián)物為Hg2+-1TCBE-OVA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的快速檢測(cè)汞離子金標(biāo)試紙條，其特征是所述的單克隆抗體是通過(guò)抗原汞離子與載體蛋白通過(guò)螯合劑形成的偶聯(lián)物采用單克隆抗體技術(shù)制備得到。
4.據(jù)權(quán)利要求3所述的快速檢測(cè)汞離子金標(biāo)試紙條，其特征在于所述的偶聯(lián)物為 Hg2+-1TCBEOVA,所述的金標(biāo)試紙條通過(guò)包括如下步驟在內(nèi)的方法制備得到:(1)稱(chēng)取20mg OVA 溶于 1mL PΗ9.0 的 HEPES 緩沖液(IOmM / L)中形成 20mg / mL 的載體蛋白溶液；(2)稱(chēng)取IOmg ITCBE溶于1mL 二甲基亞砜(DMSO)中形成金屬螯合劑溶液；(3)將0.5mL金屬螯合劑溶液逐滴加到OVA載體蛋白溶液中，混勻后，加入1OOul三正丁胺(1.5M)，搖床室溫反應(yīng)24h，制成0VA-ITCBE溶液；(4)取11.25mg硝酸汞(Hg(NO3)2)溶于1OOul蒸餾水中，形成均勻的Hg2+溶液；(5)將Hg2+溶液加入到0VA-ITCBE溶液中，調(diào)節(jié)pH值至7.4，在室溫下，搖床孵育4h， 然后移入透析袋中PBS透析10d，即形成Hg2+-1TCBE-OVA,收集分裝，_20°C凍存；(6)膠體金溶液制備:采用檸檬酸鹽還原法制備，取1000mL三角燒瓶，加入975mL雙蒸水煮沸，加入.15mL檸檬酸三鈉繼續(xù)加熱5min,加入1OmLl %氯金酸,繼續(xù)加熱至溶液呈現(xiàn)橘紅色，冷卻至室溫后，4°C保存?zhèn)溆谩?7)單克隆抗體制備:用汞離子-螯合劑-載體蛋白免疫小鼠，以Hg2+-1TCBE-OVA為例， 說(shuō)明如下:用Hg2+-1TCBE-OVA免疫6周雌性BALB / C小鼠5只，劑量為50 μ g / 0.2mL / 只，背部皮下分點(diǎn)注射。選擇細(xì)胞融合備用小鼠，間接ELISA檢測(cè)抗血清中Hg2+螯合物pAb 效價(jià)，阻斷ELISA檢測(cè)Hg2+-1TCBE pAb對(duì)Hg2+-1TCBE的IC5(I，挑選效價(jià)最高、IC50最低的小鼠，超免用于細(xì)胞融合。采用細(xì)胞融合技術(shù)無(wú)菌取脾臟制備脾細(xì)胞，在50% PEG(pH8.0)作用下與NSO骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合；用間接ELISA和阻斷ELISA進(jìn)行陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株的篩選，選擇強(qiáng)陽(yáng)性、抑制率高、細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛的孔進(jìn)行3次有限稀釋克隆化。分別于凍存 15d、30d和60d后復(fù)蘇雜交瘤細(xì)胞，培養(yǎng)后取上清液，間接ELISA測(cè)定抗體效價(jià)，考察雜交瘤細(xì)胞分泌單克隆抗體的穩(wěn)定性，獲得一株雜交瘤細(xì)胞株；之后采用體內(nèi)誘生腹水法制備 Hg2+ITCBE-OVA mAb,取8周齡健康Balb / c雌性小鼠，腹腔注射FIA0.5mL /只，10～15 天后使用。將培養(yǎng)的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞1000rpm離心1Omin棄上清，收集細(xì)胞沉淀。用滅菌的PBS將細(xì)胞沉淀懸浮、混勻，將細(xì)胞數(shù)調(diào)至1O6 / mL，腹腔注射Balb / C小.0.5mL / 只；接種細(xì)胞7-10天后產(chǎn)生腹水，進(jìn)行收集，于37°C水浴30min，4°C放置過(guò)夜，12000rpm離心5min，棄去上層的脂肪、IFA和下層的沉淀，飽和硫酸銨鹽析法提純后測(cè)定IgG含量和效價(jià)，_20°C保存?zhèn)溆茫?8)金標(biāo)抗體制備:將待標(biāo)單克隆抗體溶液1000Or/ min離心30min,用0.1mol / L K2CO3溶液調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH值至8.2 ;根據(jù)聚沉現(xiàn)象，確定汞離子-螯合劑-載體蛋白 mAb與膠體金溶液最適標(biāo)記濃度，Hg2+-1TCBE-OVAmAb為0.175mg / mL。取膠體金溶液10mL， 用0.1mol / L K2CO3溶液調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH值至8.2。取等量的濃度為0.175mg / mL 單克隆抗體溶液，磁力攪拌下混合，室溫孵育15min, 1000Or / min離心30min,棄上清,沉淀物用0.02mol / LNa2B4O7溶液(含IOg / L OVA,0.5g / L疊氮鈉)稀釋?zhuān)?°C保存?zhèn)溆茫?9)金標(biāo)抗體結(jié)合墊制備:裁取規(guī)格為20X 4mm的玻璃纖維棉,將金標(biāo)抗體用X_only 單向噴點(diǎn)儀均勻噴灑于玻璃纖維棉上，37°C干燥lh，密封，4°C保存?zhèn)溆茫?10)硝酸纖維素膜上檢測(cè)線、質(zhì)控線制備:將濃度為Img/ ml的汞離子-螯合劑-載體蛋白放于X-only單向噴點(diǎn)儀忙存池A,濃度為Img / ml的RaMIgG(GaMIgG)放于忙存池 B，開(kāi)機(jī)分別點(diǎn)射于膜中央，形成間距0.5cm的檢測(cè)線和質(zhì)控線，自然干燥，密封，4°C保存?zhèn)溆茫?11)金標(biāo)試紙條組裝:將樣品墊、金標(biāo)抗體結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊按順序依次粘貼于支撐板上，并在樣品墊與金標(biāo)抗體結(jié)合墊表面粘貼MAX線，在切槽機(jī)上切割成寬度 4mm的金標(biāo)試紙。
5.根據(jù)權(quán)利要求1~4所述的快速檢測(cè)汞離子金標(biāo)試紙條，檢測(cè)線上汞離子-螯合劑-載體蛋白的包被量為IuL / cm，載體蛋白濃度為Img / mL。
6.根據(jù)權(quán)利要求1~4所述的快速檢測(cè)汞離子金標(biāo)試紙條，其特征是:所述質(zhì)控線上 RaMIgG (或 GaMIgG)的包被量為 IyL / cm，RaMIgG (或 GaMIgG)的濃度為 Img / mL。
7.根據(jù)權(quán)利要求1~4所述的快速檢測(cè)汞離子金標(biāo)試紙條，其特征是:所述的膠體金溶液中金顆粒的粒徑為30nm,標(biāo)記量為ImL膠體金:3ng單克隆抗體。
8.用于檢測(cè)汞離子的金標(biāo)試紙卡，其特征在于:所述試紙卡是以權(quán)利要求1-7任意一項(xiàng)所述的快速檢測(cè)汞離子金標(biāo)試紙條為基礎(chǔ)，加上外卡制成。
9.一種如權(quán)利要求1~7所述的快速 檢測(cè)汞離子金標(biāo)試紙條或權(quán)利要求8所述的用于檢測(cè)汞離子的金標(biāo)試紙卡在環(huán)境、土壤、水、食品、化妝產(chǎn)品或藥物中汞離子污染殘留快速檢測(cè)中的應(yīng)用，優(yōu)選的，所述的檢測(cè)用于檢測(cè)汞離子含量在IOng / mL的樣品。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征是:樣品預(yù)處理方法是樣品消解后，采用10% EDTA作為螯合劑處理溶液，離心取上清液用于檢測(cè)。
【文檔編號(hào)】G01N33/577GK103499688SQ201310445837
【公開(kāi)日】2014年1月8日 申請(qǐng)日期:2013年9月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月27日
【發(fā)明者】張海棠, 范國(guó)英, 王自良, 葛亞明, 張慧輝, 王淑云 申請(qǐng)人:河南科技學(xué)院