專利名稱：一種藻毒素金標(biāo)檢測(cè)試紙盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種藻毒素金標(biāo)檢測(cè)試紙盒及其制備方法，屬于生物工程產(chǎn)品技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
藻毒素(Microcystins，簡(jiǎn)稱MCYST或MC)已成為環(huán)境水體中被普遍關(guān)注的污染物之一，中國(guó)科學(xué)院《2002年科學(xué)發(fā)展報(bào)告》中專門論述了淡水中“水華”造成的最大危害是飲用水源受到威脅。藻毒素通過(guò)食物鏈影響人類的健康，藍(lán)藻“水華”的次生代謝產(chǎn)物MC能損害肝臟，具有促癌效應(yīng)，直接威脅人類的健康和生存。100多年來(lái)，藻毒素引起的人畜中毒事件引起了世界范圍內(nèi)的關(guān)注，加拿大，英國(guó)，美國(guó)，澳大利亞，南非等國(guó)都有報(bào)道。我國(guó)環(huán)境白皮書公布的《環(huán)境問(wèn)題的現(xiàn)狀資料》中資料十達(dá)賚湖“禍水”揭秘，指出近30年來(lái)達(dá)賚湖地區(qū)的人畜中毒死亡事件都是“微囊藻毒素”引起的。國(guó)內(nèi)外許多文獻(xiàn)都報(bào)道了藻毒素與原發(fā)性肝癌的相關(guān)性。
由于目前缺乏防止藻類“水華”發(fā)生的有效措施，因此要預(yù)防和消除藻毒素對(duì)人畜的危害，監(jiān)測(cè)和控制藻毒素在飲用水中的限量是行之有效的方法，國(guó)家《生活飲用水水質(zhì)衛(wèi)生規(guī)范》中規(guī)定MC-LR的限值為0.001(mg/L)，而要保證飲用水中藻毒素的限值，建立快速，靈敏的藻毒素分析方法至關(guān)重要。
藻毒素是一種七肽，為單環(huán)結(jié)構(gòu)，1位是D-丙氨酸，2，4位是可變的左旋氨基酸基團(tuán)，6位是γ連接的D-氨基酸，3位是特殊的氨基酸β連接的D-紅細(xì)胞-β-甲基天門冬氨酸(MeAsp)，5位是(2S，3S，8S，9S)-3-氨基-9-甲氧基-2，6，8-三甲基-10-苯基-4，6-二烯酸(Adda)，7位是N-甲基脫氫丙氨酸(Mdha)，整個(gè)結(jié)構(gòu)可寫作(-D-Ala-L-D-MeAsp-L-Z-Adda-D-Glu-Mdha)。不同種類的MC的化學(xué)組成主要區(qū)別在于2，4位的2種左旋氨基酸的不同和MeAsp、Mdha基團(tuán)的甲基化或去甲基化。2，4位氨基酸也是不同亞型的藻毒素的命名依據(jù)，最常見的MC-LR，其中L代表亮氨酸、R代表精氨酸，因此，分析方法的研究也主要針對(duì)MC-LR來(lái)建立的。
目前，國(guó)內(nèi)外檢測(cè)MC的方法有以下幾類。(一)化學(xué)分析法包括薄層色譜法(TLC)，液相色譜法(LC)，液-質(zhì)聯(lián)用法(HPLC-MS)，毛細(xì)管電泳法(CE)以及示差脈沖極譜法。(二)生物法包括生物鑒定法、微毒素檢測(cè)法和蛋白磷酸(PP1/PP2)抑制法。(三)免疫化學(xué)法，包括放射免疫法(RIA)，間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法(idc-ELISA)，直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法(dc-ELISA)，夾心免疫法(Sandwich-ELISA)。在國(guó)內(nèi)應(yīng)用較廣泛的是高效液相色譜法，最低檢測(cè)濃度為0.01μg/mL。這些方法存在樣品前處理繁瑣、需要檢測(cè)儀器配合、檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)和檢驗(yàn)人員需要較高的素質(zhì)以及受過(guò)良好的培訓(xùn)、不適合野外操作等缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種藻毒素金標(biāo)檢測(cè)試紙盒及其制備方法，藻毒素金標(biāo)檢測(cè)試紙條屬于生物工程產(chǎn)品，用于環(huán)境資源中水資源保護(hù)。實(shí)際應(yīng)用中，主要用于檢測(cè)自然環(huán)境中水體、飲用水和藻類制品中藻毒素(MC-LR)的含量。
本發(fā)明的技術(shù)方案檢測(cè)原理是樣品中的藻毒素(MC-LR)首先與膠體金顆粒表面的抗MC-LR單克隆抗體反應(yīng)，如果樣品中藻毒素的含量超過(guò)限值，膠體金的抗體位點(diǎn)將不再有剩余，當(dāng)膠體金顆粒層析經(jīng)過(guò)檢測(cè)線時(shí)，膠體金顆粒將不會(huì)停留在該線的所在位置，繼續(xù)上行時(shí)與控制線上噴涂的羊抗鼠IgG反應(yīng)，呈現(xiàn)出膠體金的紅色。如果樣品中不含藻毒素，或藻毒素含量低于限值，膠體金表面的抗體將與檢測(cè)線上的化合物反應(yīng)呈現(xiàn)出紅色，質(zhì)控線也呈現(xiàn)紅色。
藻毒素金標(biāo)檢測(cè)試紙盒的結(jié)構(gòu)是由盒殼體和試紙條所組成，試紙條被封裝在盒殼體內(nèi)，試紙條用聚氯乙烯或聚乙烯作背襯，在試紙條一端的注樣區(qū)粘貼吸附膠體金-抗藻毒素單克隆抗體結(jié)合物的玻璃纖維膜；在試紙條中間的測(cè)試區(qū)粘貼硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜和玻璃纖維膜連接處有一小段重疊區(qū)，玻璃纖維膜的一小段重疊在硝酸纖維素膜上，在試紙條另一端吸水區(qū)粘貼吸水紙；在硝酸纖維素膜上從注樣區(qū)到吸水區(qū)的方向，依次噴涂藻毒素-牛血清白蛋白作檢測(cè)線，噴涂羊抗鼠IgG作質(zhì)控線，然后，再用1％牛血清白蛋白封閉硝酸纖維素膜；盒殼體上面開有注樣孔，觀測(cè)孔，注樣孔的位置對(duì)應(yīng)于試紙條注樣區(qū)的玻璃纖維膜，觀測(cè)孔的位置對(duì)應(yīng)于試紙條的測(cè)試區(qū)，使能觀察到檢測(cè)線和質(zhì)控線的變色。
吸附膠體金-抗藻毒素單克隆抗體結(jié)合物的玻璃纖維膜的制備將膠體金-抗藻毒素單克隆抗體結(jié)合物稀釋至0.5-2μg/mL，放入10mm×300mm玻璃纖維膜，浸泡10-20分鐘，37℃烘干，4-8℃保存，粘貼在背襯一端的注樣區(qū)；在背襯中間檢測(cè)區(qū)粘貼硝酸纖維素膜，在硝酸纖維素膜上噴涂濃度為100-500μ/mL藻毒素-牛血清白蛋白做檢測(cè)線，噴涂濃度為50-200μg/mL羊抗鼠IgG作質(zhì)控線，再用1％牛血清白蛋白封閉硝酸纖維素膜；在背襯另一端吸水區(qū)粘貼吸水紙；所得藻毒素金標(biāo)檢測(cè)試紙條包封在上面開有注樣孔和觀測(cè)孔的盒殼體內(nèi)。硝酸纖維素膜厚度為120μm，蛋白質(zhì)負(fù)載量5-20μg/m2。聚氯乙烯或聚乙烯背襯厚度為100μm。試紙條的尺寸約為(55-65)mm×(3-5)mm，檢測(cè)線和質(zhì)控線的寬度為0.5-1mm。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明采用金標(biāo)檢測(cè)法，用于檢測(cè)自然環(huán)境中水體、飲用水和藻類制品中藻毒素的含量。檢測(cè)時(shí)只需將檢測(cè)樣品滴入注樣孔中，稍許，即可在觀測(cè)區(qū)中觀察檢測(cè)線和質(zhì)控線的變色情況，確定樣品中藻毒素含量是否達(dá)標(biāo)。如果檢測(cè)線和質(zhì)控線均呈紅色，則樣品中藻毒素含量達(dá)標(biāo)，如果檢測(cè)線不變色，僅質(zhì)控線變色，則樣品中藻毒素含量超標(biāo)。與現(xiàn)有測(cè)試方法相比，不需要大型檢測(cè)儀器，樣品不需要前期處理，試紙盒制作方便，檢測(cè)快速、準(zhǔn)確、明顯、靈敏度高。


圖1藻毒素金標(biāo)檢測(cè)試紙盒檢測(cè)示意圖。
圖2藻毒素金標(biāo)檢測(cè)試紙條結(jié)構(gòu)圖。
1、盒殼體，2、試紙條，3、玻璃纖維膜，4、硝酸纖維素膜，5、檢測(cè)線，6、質(zhì)控線，7、吸水紙，8、注樣孔，9、觀測(cè)孔。
具體實(shí)施例方式
1、抗原MC-KLH的合成將1mg MC-LR溶解于1mL 0.01M碳酸鹽緩沖液中(pH9.6)，將6mg血藍(lán)蛋白(KLH)溶解于6mL0.01M碳酸鹽緩沖液中，將兩種溶液混合均勻，再加入碳化二亞胺(EDC)溶液1mL(1.5mgEDC溶解于1mL0.01M碳酸鹽緩沖液中)，混合均勻，室溫反應(yīng)2小時(shí)。將溶液移入透析帶中，4℃，0.01M磷酸鹽緩沖液(PBS)透析液內(nèi)透析，透析好的溶液分裝，-20℃保存。
2、MC-LR單克隆抗體的制備1)免疫動(dòng)物對(duì)6-8周的雌性小鼠，首次免疫用0.1mg MC-KLH與等量的完全福氏佐劑混合均勻，腹腔注射。4周后，再用0.05mg MC-KLH與不完全福氏佐劑混勻，腹腔注射。此后，間隔兩周加強(qiáng)免疫一次，方法同前。12周后，0.05mgMC-KLH脾內(nèi)加強(qiáng)免疫。72小時(shí)后，殺死小鼠，取脾制備脾細(xì)胞懸液。
2)細(xì)胞融合免疫小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞(Sp2/0)以10∶1混合，用含20％胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液清洗細(xì)胞，4000kD聚乙二醇(PEG)為融合劑融合。離心，移去上清液。融合細(xì)胞懸浮于含20％胎牛血清的黃嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷(HAT)培養(yǎng)液中，稀釋至適當(dāng)濃度(2×106脾細(xì)胞/mL)，加入預(yù)先制備的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Balb/c小鼠腹腔巨噬細(xì)胞為飼養(yǎng)細(xì)胞，2×104個(gè)/孔)，放入CO2孵育箱中37℃培養(yǎng)，當(dāng)鏡檢雜交瘤克隆生長(zhǎng)達(dá)1/2視野時(shí)，取上清液用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法進(jìn)行篩選得到適合的雜交瘤細(xì)胞。
3)克隆化采用準(zhǔn)確計(jì)數(shù)稀釋法，得到雜交瘤細(xì)胞株。凍存。
4)單克隆抗體的制備將培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞離心，棄去上清液，用生理鹽水將雜交瘤細(xì)胞懸浮，并將細(xì)胞數(shù)調(diào)至2×106個(gè)/mL，每只Balb/c小鼠腹腔注射1mL，對(duì)側(cè)腹腔注射1mL降植烷和不完全福氏佐劑，12天后收集腹水。將腹水離心(3000rpm，20分鐘)收集上清液。用33％飽和硫酸銨和50％飽和硫酸銨分級(jí)沉淀，得到抗MC-LR單克隆抗體。
3、抗體與膠體金結(jié)合原液的制備1)膠體金的制備取0.01％的氯金酸100mL，加熱煮沸，然后快速加入1％的枸櫞酸三鈉1.0mL，繼續(xù)煮沸5分鐘。用0.1mol/L K2CO3和0.1mol/L HCl調(diào)整pH至8.0-8.6。
2)抗體準(zhǔn)備抗MC-LR單克隆抗體用葡聚糖凝膠(Sephadex)G-25脫鹽。
3)抗體與膠體金結(jié)合原液的制備取純化好的抗MC-LR單克隆抗體加入膠體金液中，體積比為1∶50，終濃度為30-45μg/mL，室溫?cái)嚢杈鶆?。加?0％牛血清白蛋白(BSA)，終濃度為0.4％，再加入10％PEG(MW20000)，終濃度為0.2％，室溫?cái)嚢杈鶆?。加入與膠體金-抗體結(jié)合物液同體積的10％NaCl，靜置1小時(shí)。12000rpm離心60分鐘，沉淀溶解于適量0.01M PBS液中，用0.45μm濾膜過(guò)濾，終濃度為20-25μg/mL。用0.01M PBS稀釋到所需濃度0.5-2μg/mL，用于浸泡玻璃纖維膜使之吸附。
4、抗原MC-BSA的合成將1mg MC-LR溶解于1mL 0.01M碳酸鹽緩沖液中(pH9.6)，將3mg牛血清白蛋白(BSA)溶解于5mL0.01M碳酸鹽緩沖液中，將兩種溶液混合均勻，再加入20mg碳化二亞胺(EDC)，混合均勻，室溫反應(yīng)2小時(shí)。將溶液移入透析帶中，4℃，0.01M磷酸鹽緩沖液(PBS)透析液內(nèi)透析，透析好的溶液分裝，-20℃保存。用0.01M PBS稀釋到所需濃度100-500μg/mL，用于噴涂檢測(cè)線。
5、羊抗鼠IgG購(gòu)買于上海華美試劑公司。羊抗鼠IgG用0.01M PBS稀釋到所需濃度50-200μg/mL，用于噴涂質(zhì)控線。
權(quán)利要求
1.一種藻毒素金標(biāo)檢測(cè)試紙盒，其特征是由盒殼體(1)和試紙條(2)所組成，試紙條被封裝在盒殼體內(nèi)，試紙條用聚氯乙烯或聚乙烯作背襯，在試紙條一端的注樣區(qū)粘貼吸附膠體金-抗藻毒素單克隆抗體結(jié)合物的玻璃纖維膜(3)；在試紙條中間的測(cè)試區(qū)粘貼硝酸纖維素膜(4)，硝酸纖維素膜和玻璃纖維膜連接處有一小段重疊區(qū)，玻璃纖維膜的一小段重疊在硝酸纖維素膜上，在試紙條另一端吸水區(qū)粘貼吸水紙(7)；在硝酸纖維素膜上從注樣區(qū)到吸水區(qū)的方向，依次噴涂藻毒素-牛血清白蛋白作檢測(cè)線(5)，噴涂羊抗鼠Ig G作質(zhì)控線(6)，然后，再用1％牛血清白蛋白封閉硝酸纖維素膜；盒殼體上面開有注樣孔(8)，觀測(cè)孔(9)，注樣孔的位置對(duì)應(yīng)于試紙條注樣區(qū)的玻璃纖維膜，觀測(cè)孔的位置對(duì)應(yīng)于試紙條的測(cè)試區(qū)，使能觀察到檢測(cè)線和質(zhì)控線的變色。
2.一種權(quán)利要求1所述的檢測(cè)試紙盒的制備方法，其特征是所述吸附膠體金-抗藻毒素單克隆抗體結(jié)合物的玻璃纖維膜的制備將膠體金-抗藻毒素單克隆抗體結(jié)合物稀釋至0.5-2μg/mL，放入10mm×300mm玻璃纖維膜，浸泡10-20分鐘，37℃烘干，4-8℃保存，粘貼在背襯一端的注樣區(qū)；在背襯中間檢測(cè)區(qū)粘貼硝酸纖維素膜，在硝酸纖維素膜上噴涂濃度為100-500μg/mL藻毒素-牛血清白蛋白做檢測(cè)線，噴涂濃度為50-200μg/mL羊抗鼠Ig G作質(zhì)控線，再用1％牛血清白蛋白封閉硝酸纖維素膜；在背襯另一端吸水區(qū)粘貼吸水紙；所得藻毒素金標(biāo)檢測(cè)試紙條包封在上面開有注樣孔和觀測(cè)孔的盒殼體內(nèi)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)試紙盒的制備方法，其特征是硝酸纖維素膜厚度為120μm，蛋白質(zhì)負(fù)載量5-20μg/cm2。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)試紙盒的制備方法，其特征是聚氯乙烯或聚乙烯背襯厚度為100μm。
全文摘要
一種藻毒素金標(biāo)檢測(cè)試紙盒及其制備方法，屬于生物工程產(chǎn)品技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明試紙條用聚氯乙烯或聚乙烯作背襯，在試紙條一端注樣區(qū)粘貼吸附膠體金－抗MC－LR單克隆抗體結(jié)合物的玻璃纖維膜；在中間測(cè)試區(qū)粘貼硝酸纖維素膜，在膜上噴涂MC－BSA作檢測(cè)線，噴涂羊抗鼠IgG作質(zhì)控線，再用1％BSA封閉硝酸纖維素膜；在另一端吸水區(qū)粘貼吸水紙。試紙條被包裝在對(duì)應(yīng)設(shè)有注樣孔和觀察孔的盒殼體內(nèi)。將被測(cè)試樣滴入注樣孔后，根據(jù)檢測(cè)線的變色情況，檢測(cè)試樣中藻毒素含量達(dá)標(biāo)與否。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)是不需大型檢測(cè)儀器，樣品不需前期處理，試紙盒制作方便，檢測(cè)快速、準(zhǔn)確、明顯、靈敏度高。
文檔編號(hào)G01N33/531GK1570642SQ200410014840
公開日2005年1月26日 申請(qǐng)日期2004年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月29日
發(fā)明者趙曉聯(lián), 孫蔚榕, 陸茂林, 趙春城, 龔燕, 蔡建榮, 張東升, 蔡正森 申請(qǐng)人:江蘇省微生物研究所有限責(zé)任公司