一種抗膝溝藻毒素gtx2,3單克隆抗體的免疫膠體金標(biāo)記試紙條及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種抗膝溝藻毒素 GTX2,3單克隆抗體的免疫膠體金標(biāo)記試紙條及其 制備方法，屬于貝類毒素單克隆抗體快速檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來(lái)，由于水體富營(yíng)養(yǎng)化致使藻類異常增殖，并釋放藻毒素 (Algae Toxin)，運(yùn) 些次級(jí)代謝產(chǎn)物嚴(yán)重危害了人類的用水安全和其他水生生物的安全，其中W膝溝藻 (gonyautoxin，GTX)產(chǎn)生的麻搏性貝類毒素引起了更多的重視。膝溝藻毒素 GTX2,3為已經(jīng) 發(fā)現(xiàn)的60多種膝溝藻毒素異構(gòu)體的其中一種，是我國(guó)南方沿海染毒貝類和有毒赤潮藻的麻 搏性貝類毒素的主要成分之一，其特點(diǎn)是相對(duì)分子小、毒性大，對(duì)人體危害嚴(yán)重，不具備完 全抗原特性。
[000引隨著對(duì)膝溝藻毒素 GTX2,3的研究越來(lái)越多，專利CN201210325168.0和專利 CN201310279284.8分別公開(kāi)一種膝溝藻毒素 GTX2,3人工抗原制備的新方法和一種膝溝藻 毒素 GTX2，3完全抗原的制備方法，其在人工完全抗原制備技術(shù)上得到了發(fā)展。
[0004]在麻搏性貝類毒素的檢測(cè)技術(shù)方面，小鼠生物測(cè)試法是常用的檢測(cè)麻搏性貝類毒 素的方法。但此種方法不能確知毒素的組成及含量，且重復(fù)性差，靈敏度不高。近兒年發(fā)展 起來(lái)的HPLC法具有靈敏、高效的特點(diǎn)，但成本高，費(fèi)時(shí)，需要較高的儀器設(shè)備及分析技術(shù)。酶 聯(lián)免疫吸附測(cè)定技術(shù)巧LISA)具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏、成本低廉等特點(diǎn)，是目前最有前途的檢 測(cè)麻搏性貝類毒素技術(shù)。
[000引其中紙條快速檢測(cè)技術(shù)是近年來(lái)逐漸發(fā)展成熟的一項(xiàng)簡(jiǎn)便、快速、檢測(cè)成本低廉 的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)W抗體對(duì)抗原的特異性識(shí)別和單向免疫膜層析技術(shù)為基礎(chǔ)。試 紙條檢測(cè)不僅可W進(jìn)行定性檢測(cè)，而且也可W實(shí)現(xiàn)定量或半定量檢測(cè)。單克隆抗體為該技 術(shù)的核屯、，高親和力、適合亞型、位點(diǎn)配對(duì)、高度特異、識(shí)別譜廣是對(duì)單抗的具體要求。隨著 快速檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，集成多目標(biāo)，實(shí)現(xiàn)高通量、多殘留檢測(cè)的呵視"檢測(cè)忍片是我們未來(lái) 試紙條檢測(cè)發(fā)展的方向。多位點(diǎn)抗原測(cè)、抗體水平檢測(cè)、半抗原小分子殘留檢測(cè)是未來(lái)發(fā)展 目標(biāo)。
[0006] 因?yàn)镚TX是貝類毒素中危害嚴(yán)重的毒素之一，誤食帶有GTX毒素的蟹及貝類會(huì)導(dǎo)致 人類很高的死亡率。鑒于GTX及GTX毒素目前尚無(wú)有效的治療方法，快速準(zhǔn)確的毒素分離檢 測(cè)及其人工抗原的制備技術(shù)已成為各國(guó)學(xué)者研究的焦點(diǎn)及難點(diǎn)之一，迫切需要一種簡(jiǎn)便、 快速準(zhǔn)確、現(xiàn)場(chǎng)的檢測(cè)方法，快速檢測(cè)試紙條的研制與開(kāi)發(fā)正好有望滿足運(yùn)種需要，但是目 前在檢測(cè)GTX2，3的快速測(cè)試紙條的技術(shù)上，還未見(jiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在小分子膝溝藻毒素 GTX2,3人工抗原制備難，因此難W實(shí) 現(xiàn)其單克隆抗體金標(biāo)試紙條的問(wèn)題，應(yīng)用本發(fā)明人制備的GTX2,3人工抗原，得到GTX2,3單 克隆抗體，提供一種抗膝溝藻毒素 GTX2，3單克隆抗體的免疫膠體金標(biāo)記試紙條，針對(duì)海洋 環(huán)境尤其是南方近海污染日益嚴(yán)重導(dǎo)致Cl'S貝類毒素在貝類及蟹等水生生物體內(nèi)蓄積，對(duì) 人體造成危害，迫切需要一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方法，本發(fā)明是依據(jù)貝類及蟹等 水生生物生理學(xué)特點(diǎn)而設(shè)計(jì)發(fā)明的，采用間接ELISA競(jìng)爭(zhēng)原理制備而成，W達(dá)到快速、準(zhǔn)確、 簡(jiǎn)便、靈敏度高、現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)目的。
[0008] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是： 一種抗膝溝藻毒素 GTX2，3單克隆抗體的免疫膠體金標(biāo)記試紙條，所述的試紙條底層為 支撐層，中間層為吸附層，保護(hù)層固定在吸附層上，吸附層從測(cè)試端依次為吸附纖維層、硝 酸纖維素膜層及末端的吸水材料層，金標(biāo)抗體纖維層中的金標(biāo)抗體為抗Cl'S毒素單克隆抗 體，該抗體是用本發(fā)明人制備的GTX2，3人工抗原，制備得到GTX2，3單克隆抗體;在硝酸纖維 素膜層上設(shè)有膝溝藻毒素控制線(C)和檢測(cè)線(T)。
[0009] 所述的抗膝溝藻毒素 GTX2,3單克隆抗體的免疫膠體金標(biāo)記試紙條，其線性檢測(cè)范 圍為0.277 ~9.852iig/mL。
[0010] 所述的控制線(C)和檢測(cè)線(T)，分別包被有羊抗鼠二抗和包被GTX2,3-Gly-KLH抗 原。
[0011] 所述的免疫膠體金標(biāo)記試紙條，其使用方法為檢測(cè)端充分浸泡于待測(cè)液體中，37 °C恒溫反應(yīng)；陽(yáng)性一一白色顯示區(qū)上下呈現(xiàn)兩條紅線；陰性：白色顯示區(qū)上呈現(xiàn)一條紅色控 審Ij線C;無(wú)效：IOmin內(nèi)無(wú)控制線C出現(xiàn)。
[0012] -種抗膝溝藻毒素 GTX2,3單克隆抗體的免疫膠體金標(biāo)記試紙條的制備方法，包括 抗原GTX2,3-Gly-KLH的包被、膝溝藻毒素 GTX2,3的單克隆抗體的制備、膠體金的制備、膠體 金標(biāo)記抗體、試紙制備步驟。
[0013] 所述的膝溝藻毒素 GTX2,3的單克隆抗體的制備，利用專利CN201210325168.0膝溝 藻毒素 GTX2，3人工抗原加強(qiáng)免疫后的雌性BALB/C小鼠脾細(xì)胞中篩選培育的雜交瘤細(xì)胞系 4C2,2F10注射預(yù)先用無(wú)菌石蠟油處理過(guò)的BAIB/C小鼠，收集該小鼠的腹水，一硫酸錠利用 辛酸一硫酸錠法對(duì)收集的腹水進(jìn)行柱純化處理得到抗膝溝藻毒素 GTX2，3單抗； 所述的抗原GTX2,3-Gly-KLH的包被，條件為封閉條件采用0.5~2%明膠37°C封閉20~ 40min，包被條件為37°C包被0.5~化，包被濃度為^2.5y g/mL 所述的膠體金的制備，為每0.01%氯金酸溶液IOOlul與0.1%巧樣酸=鋼2.加 I混合，加 熱致l〇〇°C制成膠體金溶液，用0.2~0.3%碳酸鐘調(diào)至8.2~8.4; 所述的膠體金標(biāo)記抗體，按每ImL膠體金5~IOug抗GTX單抗的添加量加入到制備好的膠 體金溶液中，慢攬5~20min，4°C過(guò)夜，然后將其在4°C下ISOOOg離屯、50~70min，棄上清，取其 沉淀重懸于0.02%疊氮鋼、0.5%Tween-20的0.0 lMPBS中，真空冷凍干燥，備用； 所述的試紙制備，為硝酸纖維素膜層用將質(zhì)量濃度為^3 g/L包被GTX2，3-Gly-KLH包 被于的檢測(cè)線(T線），包被量為0.5~2 iiL/cm;在距離檢測(cè)線3 mm處將質(zhì)量濃度為10~50 g/ L的羊抗鼠二抗包被于質(zhì)控線(C線），包被量為0.5~化L/cm。包被完畢后將包被好的硝酸纖 維素膜置于37 °C烘干50~80 min,取出；將樣品吸收墊置于濃度為0.1 mol/L(抑值為7.2， 體積分?jǐn)?shù)0.5%)膠體金標(biāo)記抗體的憐酸鹽緩沖液中浸泡5~7 h，37 °C烘干;最后吸附層從測(cè) 試端依次為吸附纖維層、硝酸纖維素膜層及末端的吸水材料層，再按試紙條底層為支撐層， 中間層為吸附層，保護(hù)層固定在吸附層上，安裝好，按需切割成形，即得。
[0014]本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)： 本發(fā)明采用間接化ISA競(jìng)爭(zhēng)原理制備而成，可W在較低的待測(cè)抗原濃度達(dá)到運(yùn)一相對(duì) 結(jié)合率，且使用酶標(biāo)二抗進(jìn)行系統(tǒng)放大時(shí)，因此靈敏度大大提高。該試紙條簡(jiǎn)便、可靠，可有 效應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)檢驗(yàn)，易于推廣應(yīng)用，具有良好的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。經(jīng)過(guò)性能測(cè)試結(jié)果表明， 本專利提供的抗膝溝藻毒素 GTX2,3單克隆抗體的免疫膠體金標(biāo)記試紙條，靈敏度高，特異 性高，穩(wěn)定性好。
【附圖說(shuō)明】
[001引圖1 Snm膠體膠體金顆粒標(biāo)記后的膠體金顆粒。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，運(yùn)些實(shí)施例僅用來(lái)說(shuō)明本發(fā)明，并 不限制本發(fā)明的范圍。
[0017] 實(shí)施例1 一種抗膝溝藻毒素 GTX2，3單克隆抗體的免疫膠體金標(biāo)記試紙條，所述的試紙條底層為 支撐層，中間層為吸附層，保護(hù)層固定在吸附層上，吸附層從測(cè)試端依次為吸附纖維層、硝 酸纖維素膜層及末端的吸水材料層，金標(biāo)抗體纖維層中的金標(biāo)抗體為抗Cl'S毒素單克隆抗 體;在硝酸纖維素膜層上設(shè)有膝溝藻毒素設(shè)有控制線(C)和檢測(cè)線(T)。
[0018] -種抗膝溝藻毒素 GTX2,3單克隆抗體的免疫膠體金標(biāo)記試紙條的制備方法，包括 抗原GTX2,3-Gly-KLH的包被、膝溝藻毒素 GTX2,3的單克隆抗體的制備、膠體金的制備、膠體 金標(biāo)記抗體、試紙制備步驟： 膝溝藻毒素 GTX2,3的單克隆抗體的制備：利用專利CN201210325168.0膝溝藻毒素 GTX2,3人工抗原加強(qiáng)免疫后的雌性BALB/C小鼠脾細(xì)胞中篩選培育的雜交瘤細(xì)胞系4C2， 2F10注射預(yù)先用無(wú)菌石蠟油處理過(guò)的BAIB/C小鼠，收集該小鼠的腹水，利用辛酸一硫酸錠 法對(duì)收集的腹水進(jìn)行柱純化處理得到抗膝溝藻毒素 GTX2，3單抗； 抗原GTX2，3-Gly-KLH的包被:封閉條件采用0.5%明膠37°C封閉20min，包被條件為37°C 包被0.化，包