蛋白芯片、蛋白質(zhì)芯片診斷試劑盒制備及使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種用于早期診斷肺癌的基于6種肺癌相關(guān)自身抗原的自身抗體檢測(cè) 的蛋白質(zhì)忍片，W及由此蛋白質(zhì)忍片衍生的診斷試劑盒。本發(fā)明進(jìn)一步提供了該蛋白質(zhì)忍 片W及由此蛋白質(zhì)忍片衍生的診斷試劑盒在肺癌早期診斷、健康人群或肺癌高危人群的早 期肺癌篩查中的應(yīng)用。
[0002] 具體的，本發(fā)明設(shè)及一種可用于血清學(xué)檢測(cè)早期診斷人肺癌的蛋白質(zhì)忍片，該蛋 白質(zhì)忍片可W通過(guò)檢測(cè)6種肺癌相關(guān)的自身抗原在被檢人血液樣品中的各自的相應(yīng)IgG型 和IgM型自身抗體的相對(duì)含量，并聯(lián)合分析運(yùn)6種自身抗原相應(yīng)抗體檢測(cè)的結(jié)果，來(lái)判定被 檢人是否患有肺癌。進(jìn)一步，本發(fā)明還設(shè)及由此蛋白質(zhì)忍片衍生的診斷試劑盒，運(yùn)些診斷試 劑盒均采用或包含了此蛋白質(zhì)忍片。另外，本發(fā)明還設(shè)及該蛋白質(zhì)忍片及衍生的診斷試劑 盒在早期肺癌診斷、健康人群或肺癌高危人群的早期肺癌篩查中的應(yīng)用。
[0003] 本發(fā)明設(shè)及一種蛋白忍片、蛋白質(zhì)忍片診斷試劑盒制備及使用方法。
【背景技術(shù)】
[0004] 肺癌是全球死亡率和發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一。根據(jù)美國(guó)癌癥中屯、的最新數(shù) 據(jù)，肺癌死亡率占癌癥死亡總?cè)藬?shù)的27%，比常見(jiàn)的結(jié)腸癌，乳腺癌和膜腺癌死亡人數(shù)總和 還要多。世界衛(wèi)生組織在2001年曾經(jīng)發(fā)布警告:在過(guò)去的10年中，全球肺癌的發(fā)病率每年W 22%的速度在飛快上升，每年全球新增肺癌患者達(dá)120萬(wàn)人，死亡110萬(wàn)人。據(jù)北京市衛(wèi)生局 提供的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2010年肺癌位居北京市戶籍人口男性惡性腫瘤發(fā)病的第一位，在女 性中居第二位，僅次于乳腺癌。2001至2010年，北京市肺癌發(fā)病率增長(zhǎng)了 56%。全市新診斷 出的癌癥中有五分之一為肺癌。據(jù)流行病學(xué)專家預(yù)測(cè)，如果不控制吸煙和空氣污染，到2025 年，我國(guó)肺癌患者將超過(guò)100萬(wàn)，成為世界第一肺癌大國(guó)。
[0005] 現(xiàn)有臨床相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，肺癌的5年存活率是16.6%，顯著低于其他常見(jiàn)癌癥，如 結(jié)腸癌(64.2%)，乳腺癌(89.2%)和前列腺癌(99.2%)。肺癌的預(yù)后與其發(fā)展階段緊密相 關(guān)，局限性肺癌五年存活率為53%，而在出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的情況下五年存活率僅為4%。肺癌的早 發(fā)現(xiàn)和早防治能顯著提高患者的存活率和生活質(zhì)量。
[0006] 然而，由于肺癌發(fā)展早期大多無(wú)明顯癥狀，臨床上只有10%-15%的肺癌能在早期 被發(fā)現(xiàn)。由于早期肺癌病人無(wú)體征，因而到醫(yī)院就診的病人絕大多數(shù)是中晚期病人。提高早 期肺癌、肺癌的診斷率，將亞臨床肺癌或隱匿性肺癌從人群中篩查出來(lái)，對(duì)于提高肺癌的治 愈率及降低死亡率具有重大的意義。
[0007] 目前肺癌的診斷主要分為2類:侵入性診斷和非侵入性診斷。侵入性診斷包括穿刺 活檢、手術(shù)探查等創(chuàng)傷性手段;非侵入性診斷包括各種影像學(xué)診斷手段(如X光胸片、CT、核 磁共振、PET等）、細(xì)胞學(xué)檢查，W及各種體液中某些肺癌或腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)。肺癌的侵入 性診斷痛苦大，病人不愿意接受，一般只用于臨床的鑒別診斷和確診。肺癌最常用的診斷手 段還是非侵入性診斷，在目前尤其是指影像學(xué)診斷和細(xì)胞學(xué)診斷。
[000引40年前胸部X光片就已作為早期肺癌的診斷和篩查手段之一，盡管運(yùn)種技術(shù)費(fèi)時(shí)， 費(fèi)用也高于細(xì)胞學(xué)檢查，但確實(shí)能發(fā)現(xiàn)一些疲檢陰性的早期肺癌，優(yōu)于疲細(xì)胞學(xué)。但X光片 通常只能檢出大于1.5cm病灶的肺癌，而對(duì)更早期的肺癌、隱匿性、可疑肺癌及癌前病變均 不能檢出。
[0009] 自70年代英國(guó)科學(xué)家化USfield發(fā)明CT用于肺癌的診斷W來(lái)，先進(jìn)的影像設(shè)備和 技術(shù)的應(yīng)用使得對(duì)早期肺癌的檢出率也有所提高。近年來(lái)美國(guó)、日本一些發(fā)達(dá)國(guó)家將螺旋 CT技術(shù)用于人群早期肺癌的篩查。1993年美國(guó)的早期肺癌普查方案對(duì)1000例自愿者高危人 群采用低劑量螺旋CT篩查，發(fā)現(xiàn)233例有1-6個(gè)非巧化結(jié)節(jié)，其中27例確診肺癌，早期肺癌23 例(85%)，而同期X光片漏診率為83%。隨著醫(yī)學(xué)影像學(xué)的發(fā)展，低劑量螺旋CT被廣泛用于 檢測(cè)肺部早期結(jié)節(jié)。根據(jù)2011年6月發(fā)表在《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》上的美國(guó)國(guó)家肺癌篩查臨 床試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，使用低劑量螺旋CT進(jìn)行肺部篩查使高危人群的肺癌致死率降低了 20 % (Aberle DR,et al.(2011)Reduced lung-cancer mortality with low-dose computed tomogra地ic screening.N Elngl J Med 365(5) :395-409.)。因此，美國(guó)國(guó)家癌癥研究所推 薦低劑量螺旋CT是肺癌早期篩查的有效手段。同時(shí)，美國(guó)國(guó)家癌癥研究所也明確指出，低劑 量螺旋CT的問(wèn)題在于其檢測(cè)結(jié)果的高假陽(yáng)性，而且多次CT檢測(cè)還有可能加速肺癌的惡化。
[0010] 近幾年發(fā)展起來(lái)的另一種新技術(shù)PET對(duì)肺癌診斷的敏感性和準(zhǔn)確性又有進(jìn)一步的 提高。美國(guó)、日本、德國(guó)、加拿大等各國(guó)報(bào)道的結(jié)果顯示，PET在分辨惡性與良性非巧化結(jié)節(jié) 的敏感性、特異性均高于螺旋CT，可達(dá)85 %和90 %。但是，PET不能檢出小于1.5cm的肺癌病 灶，在早期肺癌的診斷上無(wú)顯著優(yōu)勢(shì)，且設(shè)備價(jià)格更昂貴。
[0011] 綜上所述，現(xiàn)有影像學(xué)設(shè)備和技術(shù)，在我國(guó)目前的國(guó)情下均不可能單獨(dú)用于人群 早期肺癌的篩查和診斷，需要聯(lián)合其他肺癌早期診斷或篩查技術(shù)W解決假陽(yáng)性率高和敏感 性有時(shí)不高的問(wèn)題。但它們?cè)诖_診早期肺癌中有一定的意義。
[0012] 支氣管纖維鏡檢在肺癌診斷中的應(yīng)用，主要是用于疲檢和X光胸片發(fā)現(xiàn)異?；駽T 發(fā)現(xiàn)非巧化結(jié)節(jié)的病例，通過(guò)支纖鏡檢確定病變，并取活檢組織或洗液，再進(jìn)一步進(jìn)行病理 或細(xì)胞學(xué)確診。通常對(duì)于有經(jīng)驗(yàn)的大夫，支纖鏡檢可發(fā)現(xiàn)約30-40%的早期癌，難W檢出癌 前病變和原位癌。近年來(lái)出現(xiàn)了巧光支氣管鏡，有助于確定活檢部位，發(fā)現(xiàn)早期肺癌，并有 助于判斷手術(shù)范圍，同時(shí)還能檢出癌前病變。美國(guó)、加拿大報(bào)道的結(jié)果顯示，其原位癌和癌 前病變檢出率是普通白光支纖鏡的幾倍。但運(yùn)一設(shè)備價(jià)格昂貴，對(duì)操作人員專業(yè)水平要求 很高，檢測(cè)費(fèi)也貴，是痛苦有創(chuàng)性檢測(cè)技術(shù)，對(duì)中屯、型早期肺癌和癌前病變，檢出率較高，對(duì) 周圍型肺癌檢出率低。因此運(yùn)一技術(shù)和設(shè)備也不可能作為肺癌早期診斷和篩查人群的技術(shù) 方法。
[0013] 疲細(xì)胞學(xué)檢測(cè)技術(shù)陽(yáng)性檢出率低，中晚期病人的檢出率為60-80%，而早期肺癌的 檢出率僅有10-20%。美國(guó)NCI的肺癌早期發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)中，不足10%的肺癌是由細(xì)胞學(xué)單獨(dú)發(fā) 現(xiàn)。近年來(lái)國(guó)外發(fā)展一種新的疲細(xì)胞學(xué)檢測(cè)技術(shù)（ThinPrep即液基超薄細(xì)胞電腦掃描技 術(shù)），目前已發(fā)展出第S代自動(dòng)化設(shè)備AutocytePrep and Auto化P系統(tǒng)，該技術(shù)能制備出質(zhì) 量很局的超薄細(xì)胞片，從而提局疲檢的檢出率，對(duì)早期肺癌診斷的敏感性可提局到40-60%。但該技術(shù)需價(jià)格昂貴的進(jìn)口設(shè)備，每份標(biāo)本處理的試劑費(fèi)為100元人民幣，操作人員 需較高的專業(yè)水平。國(guó)外主要在大醫(yī)院里應(yīng)用，用于人群早期肺癌篩查的報(bào)道甚少。國(guó)內(nèi)目 前僅有幾個(gè)大城市的極少醫(yī)院有此設(shè)備，開(kāi)展了運(yùn)項(xiàng)技術(shù)。因此，在我國(guó)現(xiàn)有國(guó)情下不可能 用于肺癌早期診斷和大人群篩檢。此外，該技術(shù)的致命缺點(diǎn)是對(duì)于周圍型和邊緣型早期肺 癌檢出率較低。
[0014] 隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，在研究肺癌病因的同時(shí)，也在分子水平上對(duì)肺癌發(fā) 生發(fā)展有了更多的了解。已有的研究表明在肺癌發(fā)生發(fā)展的多階段過(guò)程中，細(xì)胞形態(tài)的惡 性生物學(xué)改變伴隨著其分子水平的多種基因參與和改變，它們包括癌基因的擴(kuò)增、過(guò)度表 達(dá)、突變和抑癌基因的缺失、突變、易位、重排等等多種基因的改變。到目前為止，已報(bào)道的 與肺癌發(fā)生相關(guān)的基因異常改變約有十余種。最常見(jiàn)的癌基因改變有ras家族、myc家族、 肥R2、Bcl-2的過(guò)度表達(dá)等等。同時(shí)發(fā)現(xiàn)P53、Rb、CDKN2、DuTTl、FHIT、BAP-l等抑癌基因的突 變、缺失、轉(zhuǎn)導(dǎo)、易位及甲基化等改變。細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的分析，還發(fā)現(xiàn)多個(gè)染 色體上某些基因的改變與肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。近年來(lái)還發(fā)現(xiàn)端粒酶，hnRNPA2/Bl有 較高的癌變預(yù)測(cè)意義。近年來(lái)還發(fā)現(xiàn)了一些在肺癌中異常表達(dá)或存在的miRNA(小RNA， MicroRNA,miRNA)和LncRNA(長(zhǎng)鏈非編碼RNA，Long non-coding RNA，LncRNA)、）。為檢測(cè)運(yùn) 些基因的改變，相繼建立和發(fā)展起來(lái)多種分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，如各種PCR技術(shù)（尺1'-PCR. PCR-SSCP. PCR-RFLPs )，各種核酸雜交技術(shù)（Southern、Nodhern、比較基因組雜交技術(shù) 等)和直接測(cè)序技術(shù)等，W及近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的巧光原位雜交技術(shù)(FISH)和微衛(wèi)星多態(tài)性 分析技術(shù)等。但運(yùn)些技術(shù)對(duì)肺癌的診斷均需依賴于病灶組織或病變細(xì)胞的獲得，陽(yáng)性樣本 的獲取均有較大的難度，而且難于在肺癌的早期階段采集到所需的標(biāo)本，使運(yùn)些技術(shù)在肺 癌的早期診斷中難W發(fā)揮相應(yīng)的作用。一些血液型的DNA或RNA標(biāo)志物的診斷作用尚未得到 大規(guī)模人群檢測(cè)的驗(yàn)證，其早期診斷肺癌的能力尚存很大的疑問(wèn)。加之運(yùn)些技術(shù)需要特殊 試劑和儀器、操作復(fù)雜、價(jià)格昂貴、其敏感性、特異性和準(zhǔn)確性尚難W定論，目前國(guó)內(nèi)外均未 將運(yùn)些技術(shù)作為人群普查篩檢早期肺癌的手段和方法。
[0015] 目前大約已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了 60余種蛋白類的血液型肺癌生物標(biāo)志物，它們或與人肺癌直 接相關(guān)，或與不同種類的肺癌相關(guān)，或與肺癌預(yù)后相關(guān)，或與肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)，或與肺癌臨床 分期相關(guān)，或與肺癌耐藥相關(guān)等等。運(yùn)些標(biāo)志物包括:ACE、ADH、AFP、AgNORs、ANP、AHH、blood group antigens、BN/GRP、CAl25、CAl9-9、CA242、CA50、Cadherins、ClCitonin、Cathepsin B、CC10、CEA、Cholecystokinin-B/gastrin receptor、CK-BB、c-N-L-myc、Cyclin DUCYFRA 21-UCYFRA21. l、CYPlAl/GSTMl、EGFR、Epithelial glycoprotein I'Epithelial glycoprotein 2、Ferrit in、GangIioside fucosyl-GMl(FucGMl)、Glutathione-S-transferase、HER2、Heterogeneous nuclearribonucleoproteinA2/Bl、H-K-N-ras、IGF-I、IL-2R、Integ;rins、Ki-67、Lewis antigens、Le-y、MMP-9、MUC I、NCAM、NeuAc、N沈、P53、 PCNA、Peptid hormones ACTH、Phosphopyruvate Hydratase、pro GRP、p21、SCC antigen、 sialyl SSEA-I、SLX、TA-4、Telomerase、TGF-a、Thymidine kinase、TPA、Transferrin、uPA 等等化ulpa,J. ,Wojcik,E. ,Radkowski ,A. ,Kolodziejski ,L. ,and Stasik,Z.CYFRA 21-1, TPA-M,TPS,SCC-Ag and CEA in patients with squamous cell lung cancer and in chemical industry workers as a reference group.Anticancer Res.,2000,20(6D): 5035-5040.Nguyen,V.N.,Mirejovsky,T.,Melinova,L.,and Mandys,V.CD44and its v6spliced variant in lung carcinomas:relation to NCAM,CEA,EMA and UPland prognostic significance.Neoplasma,2000,47(6):400-408.Alatas,F.,Alatas,0., Metintas,M.,Colak,0.,Harmanci,E.,and Demir,S.Diagnostic value of CEA,CA 15-3, CA 19-9,CYFRA 21-1,NSE and TSA assay in pleural effusions.Lung Cancer,2001,31 (1) :9-16.Foa，P.,Fornier，M.,Miceli，民.，Seregni，E.，Santambrogio，L.,Nosotti，M.， Massaron，S.，Cataldo，I.，Oldani，S.,Iurlo，A.，Caldiera，S.,and Bombardieri， E.Preoperative CEA，NSE，SC