專利名稱：利用氧化還原反應(yīng)的糖化蛋白質(zhì)的測定方法及測定試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用氧化還原反應(yīng)的糖化蛋白質(zhì)的測定方法及測定試劑盒。
背景技術(shù)：
糖化蛋白質(zhì)中，例如，血液中的糖化血紅蛋白(糖化Hb)，由于反映了生物中血糖值的過去的情況，因此被作為糖尿病的診斷和治療等的重要指標(biāo)。
這種糖化Hb，例如，采用高效液相色譜(HPLC)法、微柱法、免疫法、色素法等測定糖化率和糖化量。但是，上述HPLC法的場合，例如，需要測定糖化Hb的專用儀器，另外，免疫法和色素法的場合，例如，存在測定用的細(xì)胞污染和測定精度等問題。
因此，關(guān)于糖化Hb等糖化蛋白質(zhì)，利用不需要特殊的測定儀器、操作也簡便的酶進(jìn)行的氧化還原反應(yīng)的測定方法，例如，適用于生化分析和臨床檢查等。
利用上述氧化還原反應(yīng)的糖化Hb的測定，例如，如以下所述進(jìn)行。首先，將含有糖化Hb的試樣用果糖基氨基酸氧化酶(以下稱為FAOD)處理，使之作用于糖化Hb的糖化部分而產(chǎn)生過氧化氫。該過氧化氫量對應(yīng)于上述糖化Hb量。然后，在該FAOD處理后的上述試樣中添加過氧化物酶(以下稱為POD)和還原劑，上述POD作為催化劑使上述過氧化氫和上述還原劑之間發(fā)生氧化還原反應(yīng)。此時，作為上述還原劑，如果使用因氧化而顯色的還原劑，便可通過測定其顯色來測定上述過氧化氫量，結(jié)果，可知試樣中的糖化Hb量。

發(fā)明內(nèi)容
然而，這種現(xiàn)有的測定方法，測定靈敏度不充分。另外，關(guān)于測定精度，例如，由于產(chǎn)生與試樣中實(shí)際含有的糖化Hb相對應(yīng)的以上過氧化氫，觀察到患者糖化Hb測定值暫時急劇增加的現(xiàn)象，所以要求進(jìn)一步提高精度。
因此，本發(fā)明的目的是提供利用氧化還原反應(yīng)測定試樣中的糖化蛋白質(zhì)的方法，其測定靈敏度和測定精度兩者均優(yōu)良。另外，提供用于上述糖化蛋白質(zhì)的測定、測定精度、測定靈敏度、操作性優(yōu)良的測定試劑盒。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明的糖化蛋白質(zhì)的測定方法是使FAOD作用于試樣中的糖化蛋白質(zhì)進(jìn)行氧化還原反應(yīng)，通過測定該氧化還原反應(yīng)來測定糖化蛋白質(zhì)的量的方法，其特征在于，以除去上述試樣中與糖化蛋白質(zhì)分別存在的糖化氨基酸為目的，在上述氧化還原反應(yīng)之前，使上述糖化氨基酸在FAOD作用下分解，在四唑鎓化合物及疊氮化鈉存在下，進(jìn)行上述氧化還原反應(yīng)。
再者，上述FAOD為一般名稱，作為其底物，不限于糖化氨基酸，例如，也作用于糖化蛋白質(zhì)和糖化肽。下面，在本發(fā)明中，將分解上述糖化氨基酸的FAOD稱作“分解用FAOD”，將作用于上述糖化蛋白質(zhì)進(jìn)行測定的FAOD稱作“測定用FAOD”。
本發(fā)明的發(fā)明人為提高測定精度進(jìn)行了深入研究，結(jié)果弄清了下面的事情。即，在全血中，本來除糖化蛋白質(zhì)外，還存在游離的糖化氨基酸，上述FAOD對這種糖化氨基酸也有作用。因此，使用上述FAOD測定糖化蛋白質(zhì)時，不僅糖化蛋白質(zhì)與FAOD發(fā)生氧化還原反應(yīng)，糖化氨基酸與FAOD也發(fā)生氧化還原反應(yīng)，表面上，糖化蛋白質(zhì)的測定值增加。進(jìn)一步，關(guān)于相同患者的全血試樣，即使在完全相同的條件下用上述測定方法進(jìn)行測定時，因患者采血時間不同測定值也有顯著變化，關(guān)于這個問題，弄清了下面的事情。即，弄清了這種問題主要是接受點(diǎn)滴等的患者出現(xiàn)的現(xiàn)象，這種測定值之所以變化，是因?yàn)樽鳛辄c(diǎn)滴等的成分，例如，含有葡萄糖等糖類及各種氨基酸時，由這些外來成分生成糖化氨基酸，糖化氨基酸暫時增加。因此，本發(fā)明的發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)，即使全血試樣中存在穩(wěn)定糖化氨基酸和暫時性的外來糖化氨基酸，根據(jù)本發(fā)明，如果預(yù)先將糖化氨基酸在分解用FAOD作用下分解，便可抑制上述糖化氨基酸引起的測定值的上升。因此，可以提高測定精度，而且，無論是否接受點(diǎn)滴，隨時可以采血，所以也可以減輕患者負(fù)擔(dān)。進(jìn)一步地，如果在四唑鎓化合物及疊氮化鈉存在下進(jìn)行上述氧化還原反應(yīng)，也可提高測定靈敏度，其作用機(jī)理尚不清楚。因此，根據(jù)這種測定精度和測定靈敏度優(yōu)良的測定方法，各種糖化蛋白質(zhì)作為指標(biāo)的可靠性也增加，成為臨床醫(yī)療等領(lǐng)域中有用的方法。
本發(fā)明中，作為上述糖化蛋白質(zhì)，例如，優(yōu)選糖化Hb。因?yàn)槿绻捎眠@種方法，可增加糖化Hb作為糖尿病診斷的指標(biāo)的可靠性，在臨床醫(yī)療等領(lǐng)域中有用。
作為本發(fā)明的測定方法，例如可列舉，上述糖化氨基酸和上述糖化蛋白質(zhì)使用不同底物特異性的FAOD的第1測定方法，和使用相同底物特異性的FAOD的第2測定方法。
再者，如后面所述，F(xiàn)AOD中，例如，有作用于α-氨基的糖化部分的、作用于賴氨酸和精氨酸等氨基酸殘基的側(cè)鏈氨基的糖化部分的，以及作用于上述兩者的糖化部分的等，其底物特異性因FAOD的種類而有各種各樣。例如，糖化蛋白質(zhì)為糖化Hb時，糖化Hb的測定，使FAOD作用于上述α-氨基的糖化部分、上述側(cè)鏈氨基的糖化部分或兩者的糖化部分的任一種，都可以測定其量。
作為本發(fā)明的第1測定方法，優(yōu)選作用于上述糖化氨基酸的分解用FAOD和作用于糖化蛋白質(zhì)的測定用FAOD具有不同的底物特異性。據(jù)此，通過分解用FAOD分解上述糖化氨基酸，關(guān)于糖化蛋白質(zhì)，由于可以使不同的底物特異性的測定用FAOD進(jìn)一步作用于上述分解用FAOD不作用的糖化部分，所以不受糖化氨基酸的影響，可以提高測定精度。
具體地說，例如，優(yōu)選上述分解用FAOD特異性作用于糖化α-氨基，上述測定用FAOD特異性作用于糖化α-氨基及糖化側(cè)鏈氨基。由于上述測定用FAOD作用于α-氨基糖化部分及側(cè)鏈氨基糖化部分兩者，如果按照現(xiàn)有的方法，如上所述，也作用于α-氨基被糖化的糖化氨基酸。但是，本發(fā)明中，由于上述糖化氨基酸預(yù)先通過特異性作用于上述糖化α-氨基的分解用FAOD得到分解，測定用FAOD不作用于它，抑制了表面上的測定值的增加，提高了精度。另外，如上所述，上述測定用FAOD作用于α-氨基糖化部分及側(cè)鏈氨基糖化部分兩者，但是由于糖化蛋白質(zhì)的α-氨基糖化部分也預(yù)先通過分解用FAOD得到分解，所以可使測定用FAOD只作用于糖化蛋白質(zhì)的側(cè)鏈氨基糖化部分。因此，特別是對于測定特征在于側(cè)鏈氨基的糖化量的糖化Hb可以說是有用的方法。
這樣，使用不同的FAOD時，優(yōu)選在FAOD作用于上述糖化氨基酸之前或作用之后，將糖化蛋白質(zhì)用蛋白酶分解，使作用于上述糖化蛋白質(zhì)的測定用FAOD作用于該糖化蛋白質(zhì)的分解物，進(jìn)行上述氧化還原反應(yīng)。之所以將糖化蛋白質(zhì)用蛋白酶分解，是因?yàn)镕AOD與糖化蛋白質(zhì)相比更易作用于糖化氨基酸和更短的糖化肽片段。另外，蛋白酶處理的順序不限于分解處理糖化氨基酸的前后，這是因?yàn)?，如上所述，由于測定用FAOD作用于與分解用FAOD不同的糖化部分，糖化蛋白質(zhì)的測定本身不受影響。
其次，作為本發(fā)明的第2測定方法，優(yōu)選分解用FAOD作用于糖化氨基酸后，將糖化蛋白質(zhì)用蛋白酶分解，再添加與上述分解用FAOD相同的FAOD，使之作用于上述蛋白酶分解物，進(jìn)行上述氧化還原反應(yīng)。即，分解用FAOD與測定用FAOD相同時的測定方法。
具體地說，優(yōu)選通過上述蛋白酶使上述分解用FAOD失活。如上所述，F(xiàn)AOD具有與測定的糖化蛋白質(zhì)相比更易作用于糖化氨基酸和更短的糖化肽片段的性質(zhì)。因此，從酶的反應(yīng)速度論來看，可以說即使添加分解用FAOD，在分解糖化氨基酸的處理時間內(nèi)，也不怎么作用于糖化蛋白質(zhì)。但是，如果接下來的糖化蛋白質(zhì)的蛋白酶處理期間上述分解用FAOD活性還殘存的話，與上述蛋白酶處理并行，殘存的上述分解用FAOD可能作用于通過蛋白酶得到的糖化蛋白質(zhì)分解物(即糖化氨基酸和糖化蛋白質(zhì)的肽片段)。而且，之后，即使再添加測定用FAOD，已經(jīng)成為上述殘存的分解用FAOD作用于上述糖化蛋白質(zhì)分解物的一部分的狀態(tài)，反而可能會降低測定精度。因此，如上所述，通過分解糖化蛋白質(zhì)的蛋白酶處理，使同時殘存的上述分解用FAOD失活，通過蛋白酶處理得到的糖化蛋白質(zhì)分解物，與上述分解用FAOD維持未反應(yīng)的狀態(tài)，可以與接下來添加的測定用FAOD反應(yīng)。因此也可提高測定精度。
另一方面，作為第3測定方法，如上所述，即使用蛋白酶處理沒有使分解用FAOD失活，例如通過調(diào)整上述分解用FAOD的添加量和測定用FAOD的添加量，也可以實(shí)現(xiàn)高精度測定。這種情況，例如，優(yōu)選將上述分解用FAOD(A)與測定用FAOD(B)的添加比例(活性比A∶B)設(shè)定為A∶B＝1∶10～1∶1000的范圍。如果是這種添加比例，進(jìn)行蛋白酶處理時，從酶的反應(yīng)速度論的觀點(diǎn)看，上述分解用FAOD即使殘存，也難以作用于糖化蛋白質(zhì)分解物。
本發(fā)明的測定方法中，作為上述蛋白酶，可以使用金屬蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、枯草桿菌蛋白酶及氨基肽酶、來自枯草桿菌(Bacillus Sbtilis)的蛋白酶等中的至少一種蛋白酶。
糖化蛋白質(zhì)為糖化Hb時，上述蛋白酶優(yōu)選選擇性分解糖化Hb的、選自金屬蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、來自豬胰腺的胰蛋白酶及來自枯草桿菌的蛋白酶的至少一種蛋白酶。其中優(yōu)選金屬蛋白酶、來自枯草桿菌的蛋白酶，更加優(yōu)選金屬蛋白酶。測定對象物為糖化Hb時，如果使這種蛋白酶作用，由于糖化Hb以外的糖化蛋白質(zhì)和糖化肽難以被分解，F(xiàn)AOD也難以作用于上述其他糖化蛋白質(zhì)等，因此可能只測定糖化Hb。
本發(fā)明的測定方法中，優(yōu)選四唑鎓化合物(C)和疊氮化鈉(D)的添加比例(摩爾比C∶D)為C∶D＝20∶3～20∶12的范圍。另外，優(yōu)選上述氧化還原反應(yīng)溶液中的四唑鎓化合物的終濃度為0.5～2.5mmol/L的范圍，上述反應(yīng)溶液中的疊氮化鈉的終濃度為0.13～1.3mmol/L的范圍。
本發(fā)明的測定方法中，由于可以進(jìn)一步提高靈敏度，所以優(yōu)選將含有四唑鎓化合物和疊氮化鈉的溶液老化后，添加到上述試樣中。這時，老化的處理溫度優(yōu)選為20～60℃的范圍，老化的處理時間優(yōu)選為6～120小時的范圍。
本發(fā)明中，作為上述氧化還原反應(yīng)的測定，沒有特別限制，例如，糖化蛋白質(zhì)在FAOD作用下產(chǎn)生的過氧化氫與因氧化而顯色的基質(zhì)(顯色基質(zhì))通過氧化還原酶進(jìn)行反應(yīng)，通過測定上述顯色基質(zhì)的顯色量，確定過氧化氫量的過氧化氫量的測定等。作為上述顯色基質(zhì)，例如，可以使用N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-雙(二甲氨基)二苯基胺鈉(以下也稱為DA-64)。
使用上述DA-64時，在表面活性劑存在下，將上述DA-64添加到反應(yīng)溶液中，優(yōu)選上述反應(yīng)溶液中的四唑鎓化合物濃度為0.5～8mmol/L的范圍，疊氮化鈉濃度為0.08～0.8mmol/L的范圍，表面活性劑濃度為0.3～10mmol/L的范圍，且上述反應(yīng)溶液的pH為7.0～8.5。
本發(fā)明的特征之一是為了提高測定靈敏度，在四唑鎓化合物和疊氮化鈉存在下進(jìn)行上述氧化還原反應(yīng)，但是，如上所述，顯色基質(zhì)使用DA-64時，由于該DA-64與四唑鎓化合物和疊氮化鈉共存，DA-64有時發(fā)生誤顯色。這樣，如果發(fā)生誤顯色，例如，顯色量的測定中本底變高，另外，本來添加的足量的DA-64發(fā)生不足的問題。但是，如果在表面活性劑存在下添加DA-64，且各成分濃度設(shè)定為上述濃度范圍，反應(yīng)溶液的pH設(shè)定為上述范圍，便可抑制上述本底升高，可進(jìn)行更高精度的測定。
本發(fā)明的測定方法中，上述測定試樣的種類沒有特別限制，除全血、血漿、血清、血細(xì)胞等外，例如對尿、脊髓液等生物試樣以及果汁等飲料水、醬油、調(diào)味汁等食品類等試樣也適用，其中對全血試樣、血細(xì)胞試樣特別有用。例如，測定紅細(xì)胞內(nèi)的糖化Hb時，可以將全血直接溶血，或可將從全血中分離的紅細(xì)胞溶血，將其作為測定試樣。
作為測定對象物的糖化蛋白質(zhì)，例如有前面所述的糖化Hb、糖化白蛋白等，優(yōu)選糖化Hb。
其次，本發(fā)明的Hb糖化率的測定方法，是由糖化Hb量和Hb量求出Hb糖化率的測定方法，根據(jù)上述本發(fā)明的糖化蛋白質(zhì)的測定方法測定試樣中的糖化Hb量，另一方面，測定上述試樣中的Hb量，由上述糖化Hb量和上述Hb量求出Hb糖化率。根據(jù)本發(fā)明，由于能夠以高精度測定糖化Hb量，所以可以得到可靠性高的Hb糖化率。再者，“Hb量”包括糖化的Hb和未糖化的Hb兩者。
本發(fā)明中，測定上述Hb量的方法沒有特別限制，優(yōu)選用四唑鎓化合物使試樣中的Hb變性，在對得到的變性Hb特異的吸收波長下測定上述試樣的吸光度，由該吸光度算出上述試樣中的Hb量的方法。由于未變性的Hb，例如，根據(jù)與氧結(jié)合的狀態(tài)及未結(jié)合的狀態(tài)等其形態(tài)的不同，具有各種各樣的吸收波長，因此，即使單純地測定吸光度也難以準(zhǔn)確求出Hb量。而通過四唑鎓化合物變性的變性Hb是穩(wěn)定的，顯示吸收最大的波長在一定范圍之內(nèi)，所以可以容易且以高精度求出Hb量。因此，可以由上述可靠性高的糖化Hb量和Hb量進(jìn)一步求出可靠性高的Hb糖化率。
另外，采用本發(fā)明的糖化蛋白質(zhì)的測定方法，也可以測定HbAlc。例如，該HbAlc的測定方法，是準(zhǔn)備由上述本發(fā)明的糖化蛋白質(zhì)的測定方法得到的糖化Hb量和HbAlc量的相關(guān)關(guān)系作成的校正曲線，將由上述本發(fā)明的糖化蛋白質(zhì)的測定方法得到的試樣中的糖化Hb量代入上述校正曲線中，從而求出上述試樣中的HbAlc量的方法。
本發(fā)明的發(fā)明人深入研究的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)根據(jù)上述本發(fā)明的糖化蛋白質(zhì)的測定方法得到的全血中的糖化Hb量，與相同試樣中的HbAlc量存在高的相關(guān)關(guān)系。HbAlc為Hb的β鏈N末端的α-氨基被糖化的糖化Hb，在糖化Hb中，也被作為糖尿病診斷等的特別重要的指標(biāo)。根據(jù)現(xiàn)有的方法，測定HbAlc，需使FAOD特異性作用于糖化部分中的HbAlc的特征性結(jié)構(gòu)部分β鏈N末端的α-氨基的糖化部分，測定其氧化還原反應(yīng)。這種場合，例如，由于使用的FAOD對上述α-氨基糖化部分的底物特異性高，并要求充分作用于上述α-氨基糖化部分等，所以不得不采用特別的方法。但是，根據(jù)本發(fā)明，由于以高精度測定的糖化Hb量為基礎(chǔ)，可以確定HbAlc量，所以能夠準(zhǔn)確且簡便地測定HbAlc。因此，HbAlc的測定在臨床檢查等中能夠?qū)嵱没?br> 下面，本發(fā)明的糖化蛋白質(zhì)的測定試劑盒，是利用氧化還原反應(yīng)測定糖化蛋白質(zhì)使用的測定試劑盒，其特征是包括含有FAOD的試樣的預(yù)處理用試劑、含有FAOD、氧化還原酶及顯色基質(zhì)的顯色用試劑。
本發(fā)明的發(fā)明人，如上所述，弄清了發(fā)生測定精度的問題的原因。而且，本發(fā)明的發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)，即使全血試樣中存在穩(wěn)定糖化氨基酸和暫時性的外來糖化氨基酸，根據(jù)本發(fā)明，如果使試樣的預(yù)處理用試劑中含有FAOD，通過在上述氧化還原反應(yīng)之前添加上述預(yù)處理試劑，試樣中的糖化氨基酸得到分解，便可抑制上述糖化氨基酸引起的測定值的上升。因此，如果使用本發(fā)明的測定試劑盒，就能夠以優(yōu)良的精度快速簡便地利用氧化還原反應(yīng)測定糖化蛋白質(zhì)，而且，即使是接受點(diǎn)滴的患者的血液試樣，也可以在同樣的條件下進(jìn)行測定。另外，使用本發(fā)明的測定試劑盒進(jìn)行的測定，如上所述，由于測定精度優(yōu)良，所以各種糖化蛋白質(zhì)作為指標(biāo)的可靠性也增加，成為臨床醫(yī)療等領(lǐng)域中有用的測定試劑盒。
本發(fā)明的測定試劑盒，優(yōu)選測定對象物例如為糖化Hb。因?yàn)橥ㄟ^這種測定試劑盒，糖化Hb作為糖尿病診斷的指標(biāo)的可靠性增加，在臨床醫(yī)療等領(lǐng)域中有用。
再者，本發(fā)明中，由于預(yù)處理試劑中含有的FAOD分解上述糖化氨基酸，所以，如上所述，下面也稱作“分解用FAOD”，由于顯色用試劑中含有的FAOD作用于糖化蛋白質(zhì)，所以下面也稱作“測定用FAOD”。
本發(fā)明的測定試劑盒，優(yōu)選進(jìn)一步包括含有蛋白酶的蛋白酶試劑。上述FAOD具有與糖化蛋白質(zhì)相比更容易與糖化氨基酸和更短的糖化肽作用的性質(zhì)。因此，如果用上述蛋白酶試劑分解試樣中的糖化蛋白質(zhì)，顯色用試劑中的測定用FAOD變得更容易作用，也可以提高測定精度。再者，作為上述蛋白酶，可以使用與上述本發(fā)明的糖化蛋白質(zhì)測定方法相同的蛋白酶。
本發(fā)明的測定試劑盒中，優(yōu)選上述蛋白酶試劑進(jìn)一步含有四唑鎓化合物和疊氮化鈉。這樣，如果使蛋白酶試劑中含有四唑鎓化合物和疊氮化鈉，在可以提高測定靈敏度的同時，通過四唑鎓化合物，可以排除上述試樣中含有的還原物質(zhì)等對氧化還原反應(yīng)的影響，也可提高測定精度。
另外，上述蛋白酶試劑中，作為蛋白酶，使用金屬蛋白酶時，優(yōu)選進(jìn)一步含有Ca和Na，金屬蛋白酶濃度為100～40000KU/L，Ca濃度為0.1～50mmol/L，Na濃度為5～1000mmol/L。這樣，為達(dá)到上述濃度范圍，如果使金屬蛋白酶、Ca及Na共存，可提高金屬蛋白酶的穩(wěn)定性，例如，不僅在低溫條件下，在常溫條件下也可防止金屬蛋白酶失活，可穩(wěn)定保存。再者，Ca和Na使用時可以分別離子化成Ca2+和Na+。
再者，上述蛋白酶試劑中的各物質(zhì)的濃度不限于上述濃度范圍，例如，優(yōu)選其比例為與上述濃度范圍同樣的含有比例。根據(jù)上述蛋白酶試劑對反應(yīng)溶液的添加比例(稀釋率)，可以調(diào)整反應(yīng)所需的上述各物質(zhì)的添加量。再者，關(guān)于其他物質(zhì)和其他試劑也同樣。
作為本發(fā)明的測定試劑盒，上述預(yù)處理用試劑中含有的分解用FAOD和上述顯色用試劑中含有的測定用FAOD，例如可列舉使用不同底物特異性的FAOD的第1測定試劑盒、使用相同F(xiàn)AOD的第2及第3測定試劑盒。
本發(fā)明中，作為第1測定試劑盒，如上所述，優(yōu)選預(yù)處理用試劑中含有的分解用FAOD和顯色用試劑中含有的測定用FAOD使用不同底物特異性的FAOD。如果使用這種測定試劑盒，上述糖化氨基酸通過分解用FAOD得到分解，關(guān)于糖化蛋白質(zhì)，由于可使上述測定用FAOD作用于上述分解用FAOD不作用的不同的糖化部分，所以不受糖化氨基酸的影響，可以提高測定精度。
具體地說，例如，優(yōu)選上述分解用FAOD為特異性作用于糖化α-氨基的FAOD，上述測定用FAOD為特異性作用于糖化α-氨基及糖化側(cè)鏈氨基的FAOD。由于上述測定用FAOD作用于α-氨基糖化部分及側(cè)鏈氨基糖化部分兩者，如果按照現(xiàn)有的方法，如上所述，也作用于α-氨基被糖化的糖化氨基酸。但是，如果使用本發(fā)明的測定試劑盒，通過用預(yù)處理用試劑處理，上述糖化氨基酸預(yù)先被特異性作用于上述糖化α-氨基的分解用FAOD分解，所以測定用FAOD不作用于它，便可抑制表面上的測定值的增加，提高精度。另外，如上所述，測定用FAOD作用于α-氨基糖化部分及側(cè)鏈氨基糖化部分兩者，但由于糖化蛋白質(zhì)的α-氨基糖化部分也預(yù)先通過分解用FAOD得到分解，所以用本發(fā)明的上述顯色用試劑處理，可以使測定用FAOD只作用于糖化蛋白質(zhì)的側(cè)鏈氨基糖化部分。因此，特別是對于測定特征在于側(cè)鏈氨基的糖化量糖化Hb可以說是有用的測定試劑盒。再者，這種測定試劑盒可以用于上述本發(fā)明的第1糖化蛋白質(zhì)的測定方法。
其次，上述第2測定試劑盒，作為預(yù)處理用試劑的上述分解用FAOD和顯色用試劑的上述測定用FAOD，優(yōu)選使用相同F(xiàn)AOD、包括含有分解糖化蛋白質(zhì)，且使上述分解用FAOD消化失活的蛋白酶的蛋白酶試劑。
該第2測定試劑盒的使用方法，例如，首先將預(yù)處理用試劑添加到試樣中，使分解用FAOD作用于糖化氨基酸后，添加蛋白酶試劑，將糖化蛋白質(zhì)用蛋白酶分解，殘存的分解用FAOD也通過蛋白酶一并消化分解。而且，可再添加上述顯色用試劑，使測定用FAOD作用于上述蛋白酶分解物，進(jìn)行上述氧化還原反應(yīng)。
如上所述，F(xiàn)AOD具有與測定的糖化蛋白質(zhì)相比更易作用于糖化氨基酸和更短的糖化蛋白質(zhì)的肽片段的性質(zhì)。因此，從酶的反應(yīng)速度論看，可以說即使添加含有分解用FAOD的預(yù)處理用試劑，在分解糖化氨基酸的處理時間內(nèi)，上述FAOD也不怎么作用于糖化蛋白質(zhì)。但是，如果接下來的用蛋白酶試劑的處理期間上述分解用FAOD的活性還殘存的話，與蛋白酶處理并行，上述分解用FAOD作用于通過蛋白酶得到的糖化蛋白質(zhì)分解物(即糖化氨基酸和糖化蛋白質(zhì)的肽片段)，然后，即使添加含有測定用FAOD的顯色用試劑，由于已經(jīng)成為分解用FAOD作用于上述糖化蛋白質(zhì)的分解物的一部分的狀態(tài)，反而可能會降低測定精度。因此，如上述第2測定試劑盒，如果含有分解糖化蛋白質(zhì)、且使分解用FAOD消化失活的蛋白酶試劑，糖化蛋白質(zhì)的分解物與上述分解用FAOD維持未反應(yīng)的狀態(tài)，可以與接著添加的顯色用試劑中的測定用FAOD反應(yīng)。因此也提高測定精度。再者，這種測定試劑盒可以用于上述本發(fā)明的第2糖化蛋白質(zhì)的測定方法。
另外，第3測定試劑盒，即使是分解用FAOD和測定用FAOD使用相同F(xiàn)AOD的場合，如上述第2測定試劑盒，雖然用蛋白酶試劑沒有使殘存的分解用FAOD失活，但是，例如，通過調(diào)整預(yù)處理用試劑的上述分解用FAOD濃度和顯色用試劑的上述測定用FAOD濃度，也可以實(shí)現(xiàn)高精度測定。這種場合，例如，優(yōu)選設(shè)定預(yù)處理用試劑和顯色用試劑的FAOD濃度，使最終的顯色反應(yīng)溶液中的上述分解用FAOD(A)與測定用FAOD(B)的添加比例(活性比A∶B)為A∶B＝1∶10～1∶1000的范圍。如果是這種添加比例，用蛋白酶試劑處理時，從酶的反應(yīng)速度論的觀點(diǎn)看，上述分解用FAOD即使殘存，也難以作用于糖化蛋白質(zhì)。再者，這種測定試劑盒可以用于上述本發(fā)明的第3糖化蛋白質(zhì)的測定方法。
本發(fā)明的測定試劑盒中，上述顯色基質(zhì)，例如，可以使用因氧化而顯色的基質(zhì)和因還原而顯色的基質(zhì)等，優(yōu)選為因氧化而顯色的基質(zhì)，具體地，優(yōu)選為N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-雙(二甲氨基)二苯基胺鈉。
顯色基質(zhì)使用DA-64時，如果上述蛋白酶試劑含有四唑鎓化合物和疊氮化鈉，這3種成分因在反應(yīng)系統(tǒng)中混合，DA-64有時發(fā)生誤顯色。如果發(fā)生誤顯色，例如，測定顯色量時本底變高，另外，添加的足量的DA-64發(fā)生不足的問題。但是，如上所述，如果各試劑以上述濃度范圍含有各成分，便可防止反應(yīng)系統(tǒng)中的DA-64的誤顯色。因此也可抑制上述本底升高，可進(jìn)行更高精度的測定。
本發(fā)明的測定試劑盒中，上述預(yù)處理用試劑、蛋白酶試劑、顯色用試劑也可進(jìn)一步含有表面活性劑。
另外，上述各種試劑優(yōu)選含有選自CHES、MOPS、MES、Tris、磷酸、TES、TAPS、HEPES、HEPPSO、硼酸、三乙醇胺、BES、MOPSO、EPPS、POPSO、ADA、PIPES、ACES、Bis-Tris的至少一種緩沖劑。由于上述各種試劑分別含有酶，通過添加緩沖劑，例如可以于最適pH下使上述酶作用。
具體地說，上述預(yù)處理用試劑優(yōu)選進(jìn)一步含有選自CHES、MOPS、TAPS、EPPS、磷酸、HEPPSO、POPSO、硼酸的至少一種緩沖劑，其pH優(yōu)選為8.0～10.0的范圍。
另外，上述蛋白酶試劑優(yōu)選進(jìn)一步含有選自Tris、MES、DIPSO、TES、POPSO、HEPES、MOPSO、Bis-Tris、MOPS、ADA、PIPES、ACES、磷酸的至少一種緩沖劑，其pH優(yōu)選為5.0～7.0的范圍。
另外，上述顯色用試劑優(yōu)選進(jìn)一步含有選自MES、Tris、磷酸、MOPS、TES、HEPES、HEPPSO、EPPS的至少一種緩沖劑，其pH優(yōu)選為6.0～9.0的范圍。
上述顯色用試劑，例如，由于可以防止DA-64等顯色基質(zhì)的誤顯色，優(yōu)選進(jìn)一步含有疊氮化鈉。
上述預(yù)處理用試劑優(yōu)選進(jìn)一步含有尿酸酶及膽紅素氧化酶的至少之一。如果含有尿酸酶，例如，可以分解測定試樣中含有的尿酸，另外，如果含有膽紅素氧化酶，可以分解膽紅素。由于該尿酸和膽紅素具有還原力，如果這樣進(jìn)行分解，可進(jìn)一步排除還原物質(zhì)帶來的影響，可以提高測定精度。
本發(fā)明的測定試劑盒中各試劑的具體組成，例如可列舉下面的組成。
上述預(yù)處理試劑，例如，優(yōu)選果糖基氨基酸氧化酶為特異性作用于糖化的α-氨基的酶，其濃度為10～5000U/L的范圍，緩沖劑濃度為5～200mmol/L的范圍，pH為8.0～10.0的范圍。
上述蛋白酶試劑，例如，優(yōu)選金屬蛋白酶的濃度為100～10000KU/L的范圍，四唑鎓化合物濃度為0.1～10mmol/L的范圍，疊氮化鈉濃度為0.08～4mmol/L的范圍，Ca濃度為0.1～50mmol/L的范圍，Na濃度為5～1000mmol/L的范圍，緩沖劑濃度為0.1～500mmol/L的范圍，pH為5.0～7.0的范圍。
上述顯色用試劑，例如，優(yōu)選果糖基氨基酸氧化酶為特異性作用于糖化的α-氨基及糖化的氨基酸殘基側(cè)鏈的酶，其濃度為100～50000U/L的范圍，過氧化物酶濃度為0.1～400KU/L的范圍，N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-雙(二甲氨基)二苯基胺鈉濃度為0.02～2mmol/L的范圍，緩沖劑濃度為10～500mol/L的范圍，pH為6～9的范圍。
本發(fā)明的測定試劑盒，可以適用于與上述本發(fā)明的糖化蛋白質(zhì)的測定方法相同的試樣。另外，其測定對象物也相同，優(yōu)選為糖化Hb。
再者，本發(fā)明的測定試劑盒中的各種試劑，可以是將各成分在水性溶劑中溶解的液系試劑，也可以是使用前在水性溶劑中溶解使用的干系試劑。


圖1是表示本發(fā)明的測定方法的一個實(shí)施例中，通過酶法測定的HbAlc量與通過HPLC法測定的HbAlc量的相關(guān)關(guān)系的圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的測定方法及測定試劑盒中使用的FAOD，優(yōu)選為催化下式(1)所示的反應(yīng)的FAOD，例如可舉出，特異性作用于α-氨基被糖化的糖化胺的FAOD(以下稱為FAOD-α)、特異性作用于氨基酸殘基的側(cè)鏈氨基被糖化的糖化胺的FAOD(以下稱為FAOD-S)、特異性作用于α-氨基被糖化的糖化胺及上述側(cè)鏈氨基被糖化的糖化胺之任一種的FAOD(以下稱為FAOD-αS)等。再者，“糖化胺”是指糖化蛋白質(zhì)、糖化肽及糖化氨基酸等。
…(1)上述式(1)中，R1表示羥基或來自糖化反應(yīng)前的糖的殘基(糖殘基)。當(dāng)反應(yīng)前的糖為醛糖時，上述糖殘基(RU)為醛糖殘基，而反應(yīng)前的糖為酮糖時，則為酮糖殘基。例如，當(dāng)反應(yīng)前的糖為葡萄糖時，通過阿馬多利(Amadori)重排，使反應(yīng)后的結(jié)構(gòu)為果糖結(jié)構(gòu)，但此時，糖殘基(R1)變成葡萄糖殘基(醛糖殘基)。該糖殘基(R1)例如可以用-[CH(OH)]n-CH2OH表示，n為0～6的整數(shù)。
上述式(1)中，R2沒有特別限制，但是，在糖化胺為糖化氨基酸或糖化肽(包括糖化蛋白質(zhì))的場合、α-氨基被糖化的場合、除此以外的氨基(氨基酸側(cè)鏈的氨基)被糖化的場合是不同的。
上述式(1)中，α-氨基被糖化的場合，R2為下式(2)表示的氨基酸殘基或肽殘基。在這種情況下，特異性催化上式(1)的反應(yīng)的是上述FAOD-α和FAOD-αS。
-CHR3-CO-R4…(2)上述式(2)中，R3表示氨基酸側(cè)基，R4表示羥基、氨基酸殘基或肽殘基，例如可以用下式(3)表示。下式(3)中，n為0以上的整數(shù)，R3與上述相同，表示氨基酸側(cè)鏈基，氨基酸側(cè)鏈基可以完全相同，也可以不同。
-(NH-CR3H-CO)n-OH …(3)另外，上述式(1)中，α-氨基以外的氨基被糖化(氨基酸側(cè)基被糖化)的場合，R2可以用下式(4)表示。在這種場合，特異性催化上式(1)的反應(yīng)的是上述FAOD-S和FAOD-αS。
-R5-CH(NH-R6)-CO-R7…(4)上述式(4)中，R5表示氨基酸側(cè)基中被糖化的氨基以外的部分。例如，被糖化的氨基酸為賴氨酸時，R5為-CH2-CH2-CH2-CH2-，例如，被糖化的氨基酸為精氨酸時，R5為-CH2-CH2-CH2-NH-CH(NH2)-。
另外，上述式(4)中，R6為氫、氨基酸殘基或肽殘基，例如可以用下式(5)表示。再者，下式(5)中，n為0以上的整數(shù)，R3與上述相同，表示氨基酸側(cè)鏈基，氨基酸側(cè)鏈基可以完全相同，也可以不同。
-(CO-CR3H-NH)n-H …(5)另外，上述式(4)中，R7為羥基、氨基酸殘基或肽殘基，例如可以用下式(6)表示。再者，下式(6)中，n為0以上的整數(shù)，R3與上述相同，表示氨基酸側(cè)鏈基，氨基酸側(cè)鏈基可以完全相同，也可以不同。
-(NH-CHR3-CO)n-OH …(6)作為特異性作用于上述糖化α-氨基的FAOD-α，例如可列舉，市售的商品名為Fructosyl-Amino Acid Oxidase(FAOX-E)(Kikkoman公司生產(chǎn))、來自青霉屬的FAOD(特開平8-336386號公報)等。作為特異性作用于上述糖化的氨基酸側(cè)鏈的FAOD-S，例如有來自鐮刀菌屬的FAOD(日本生物工學(xué)會大會平成12年度“來自鐮刀菌的氨基酸氧化酶的底物特異性轉(zhuǎn)化；藤原真紀(jì)等”)等。另外，作為作用于上述糖化α-氨基及糖化氨基酸側(cè)基兩者的FAOD-αS，例如有市售的商品名為FOD(旭化成公司生產(chǎn))、來自赤霉菌屬的FAOD(特開平8-154672號公報)、來自鐮刀菌屬的FAOD(特開平7-289253號公報)、來自曲霉屬的FAOD(WO 99/20039)等。
作為本發(fā)明中的四唑鎓化合物，例如，優(yōu)選為在四唑環(huán)的至少2個位置上具有環(huán)結(jié)構(gòu)取代基的結(jié)構(gòu)，更加優(yōu)選為在3個位置上具有環(huán)結(jié)構(gòu)取代基的結(jié)構(gòu)。
上述四唑鎓化合物，如上所述，在上述四唑環(huán)的至少2個位置上具有環(huán)結(jié)構(gòu)取代基的場合，優(yōu)選在上述四唑環(huán)的2位及3位上有上述取代基。另外，當(dāng)四唑鎓化合物在3個位置上具有環(huán)結(jié)構(gòu)取代基時，優(yōu)選在上述四唑環(huán)的2位、3位及5位上具有上述取代基。
另外，四唑鎓化合物優(yōu)選至少2個環(huán)結(jié)構(gòu)取代基的環(huán)結(jié)構(gòu)為苯環(huán)。作為除了上述苯環(huán)以外的環(huán)結(jié)構(gòu)取代基，例如可舉出，在環(huán)骨架中含有S或O、且為共振結(jié)構(gòu)的取代基，例如，噻吩基、噻唑基等。
另外，上述四唑鎓化合物優(yōu)選在四唑環(huán)的至少3個位置上具有環(huán)結(jié)構(gòu)取代基，上述環(huán)結(jié)構(gòu)取代基的至少2個環(huán)結(jié)構(gòu)取代基的環(huán)結(jié)構(gòu)為苯環(huán)。
另外，優(yōu)選至少1個環(huán)結(jié)構(gòu)取代基具有官能團(tuán)，更加優(yōu)選上述官能團(tuán)的數(shù)目多。
作為上述官能團(tuán)，優(yōu)選為吸電子性官能團(tuán)，例如有鹵素基、醚基、酯基、羧基、?；?、亞硝基、硝基、羥基、磺基等。其他例如有氫過氧基、氧基(oxy)、環(huán)氧基、環(huán)二氧基、氧代基(oxo)等含氧的特性基及巰基、烷硫基、甲基硫甲基、硫代基、亞磺基、苯磺酰基(benzenesulfonyl)、苯基磺酰基(phenylsulfonyl)、對甲苯磺酰基(p-toluenesulfonyl)、對甲苯基磺酰基(p-tolylsulfonyl)、對甲苯磺酰基(tosyl)、氨磺酰基、異硫氰酸酯基等含硫的特性基等。這些吸電子性官能團(tuán)中，優(yōu)選硝基、磺基、鹵素基、羧基、羥基、甲氧基、乙氧基。另外，除了上述吸電子性官能團(tuán)外，例如還有苯基(C6H5-)、苯乙烯基(C6H5CH＝CH-)等不飽和烴基等。再者，上述官能團(tuán)也可以通過離解而離子化。
上述四唑鎓化合物優(yōu)選在四唑環(huán)的2位及3位上具有苯環(huán)，上述苯環(huán)中的至少一個具有選自鹵素基、羧基、硝基、羥基、磺基、甲氧基及乙氧基的至少1種官能團(tuán)。再者，上述兩個苯環(huán)具有上述官能團(tuán)也可以。上述苯環(huán)中，在任一位置(鄰位、間位、對位)上有上述官能團(tuán)也可以。另外，對官能團(tuán)的數(shù)目沒有特別限制，可以具有相同的官能團(tuán)，也可以具有不同的官能團(tuán)。
上述四唑鎓化合物，例如，作為在上述四唑環(huán)的2位、3位及5位上具有苯環(huán)結(jié)構(gòu)取代基的化合物，例如可以舉出，2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓鹽(以下也稱作WST-3)、2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓鹽、2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓鹽、2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鎓鹽、3，3’-(1，1’-聯(lián)苯-4，4’-二基)-雙(2，5-二苯基)-2H-四唑鎓鹽、3，3’-[3，3’-二甲氧基-(1，1’-聯(lián)苯)-4，4’-二基]-雙[2-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鎓鹽]、2，3-二苯基-5-(4-氯苯基)四唑鎓鹽、2，5-二苯基-3-(對二苯基)-四唑鎓鹽、2，3-二苯基-5-(對二苯基)四唑鎓鹽、2，5-二苯基-3-(4-苯乙烯基苯基)四唑鎓鹽、2，5-二苯基-3-(間甲苯基)四唑鎓鹽及2，5-二苯基-3-(對甲苯基)四唑鎓鹽等。
另外，上述四唑鎓化合物并不限于上述那些化合物，除此之外，也可以使用在上述四唑環(huán)的2個位置上具有苯環(huán)結(jié)構(gòu)取代基及1個位置上具有其他的環(huán)結(jié)構(gòu)取代基的化合物，例如有2，3-二苯基-5-(2-噻吩基)四唑鎓鹽、2-苯并噻唑基-3-(4-羧基-2-甲氧基苯基)-5-[4-(2-磺乙基氨基甲?；?苯基]-2H-四唑鎓鹽、2，2’-二苯并噻唑-5，5’-雙[4-二(2-磺乙基)氨基甲?；交鵠-3，3’-(3，3’-二甲氧基-4，4’-亞聯(lián)苯基)二四唑鎓鹽及3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-四唑鎓鹽等。
另外，也可以使用在上述四唑環(huán)的2個位置上有苯環(huán)結(jié)構(gòu)取代基及1個位置上有非環(huán)結(jié)構(gòu)取代基的四唑鎓化合物，例如有2，3-二苯基-5-氰基四唑鎓鹽、2，3-二苯基-5-羧基四唑鎓鹽、2，3-二苯基-5-甲基四唑鎓鹽、2，3-二苯基-5-乙基四唑鎓鹽等。
上述四唑鎓化合物中，如上所述，優(yōu)選具有3個環(huán)結(jié)構(gòu)取代基的化合物，更加優(yōu)選有3個環(huán)結(jié)構(gòu)為苯環(huán)的取代基，且含有較多吸電子性官能團(tuán)的化合物，特別優(yōu)選WST-3。再者，這樣的四唑鎓化合物，例如可以是鹽，也可以是離子化的狀態(tài)等。另外，該四唑鎓化合物可以使用一種，也可以2種以上并用。
下面關(guān)于本發(fā)明的糖化蛋白質(zhì)的測定方法，以測定血細(xì)胞中的糖化Hb為例在下述實(shí)施方式A-1～A-5中進(jìn)行說明。
(實(shí)施方式A-1)該實(shí)施方式是分解上述糖化氨基酸使用FAOD-α、測定糖化Hb使用FAOD-αS，在四唑鎓化合物及疊氮化鈉存在下，進(jìn)行上述氧化還原反應(yīng)的例子。
首先，將全血直接溶血，或用離心分離等常用方法從全血分離出血細(xì)胞成分，將其溶血，配制溶血試樣。該溶血方法沒有特別限制，例如，可以使用采用表面活性劑的方法、采用超聲波的方法、利用滲透壓差的方法等。其中，從操作的簡便性等的理由看，上述采用表面活性劑的方法是優(yōu)選的。
作為上述表面活性劑，例如，可以使用聚氧乙烯對叔辛基苯基醚(Triton類表面活性劑等)、聚氧乙烯失水山梨糖醇烷基酯(Tween類表面活性劑等)、聚氧乙烯烷基醚(Brij類表面活性劑等)非離子型表面活性劑，具體例如有TritonX-100、Tween-20、Brij35等。上述采用表面活性劑的處理?xiàng)l件，通常，當(dāng)處理溶液中的血細(xì)胞濃度為1～10體積％時，添加上述表面活性劑使得在上述處理溶液中的濃度達(dá)0.01～5重量％，室溫下，攪拌數(shù)秒(約5秒)～10分鐘。
然后，在上述溶血試樣中，添加四唑鎓化合物及疊氮化鈉。
例如，當(dāng)處理溶液中的血細(xì)胞濃度為0.2～2體積％時，優(yōu)選添加上述四唑鎓化合物使?jié)舛冗_(dá)到0.005～400mmol/L的范圍，更加優(yōu)選0.02～100mmol/L的范圍，特別優(yōu)選0.1～50mmol/L的范圍。具體地說，上述四唑鎓化合物為WST-3時，優(yōu)選添加以使?jié)舛冗_(dá)到0.004～16mmol/L的范圍，更加優(yōu)選0.02～10mmol/L的范圍，特別優(yōu)選0.1～5mmol/L的范圍。再者，上述四唑鎓化合物可以使用一種，也可以2種以上并用。這樣，通過添加四唑鎓化合物及疊氮化鈉，與不添加的場合相比，其靈敏度提高約1.2～3倍。
另外，上述四唑鎓化合物(C)和疊氮化鈉(D)的添加比例(摩爾比C∶D)，例如為C∶D＝20∶3～20∶12的范圍，優(yōu)選為20∶5～20∶11的范圍，更加優(yōu)選為20∶6～20∶10的范圍。
上述四唑鎓化合物和疊氮化鈉可以直接添加到上述溶血試樣中。但是，從操作的簡便性等觀點(diǎn)來看，優(yōu)選使用溶解在溶劑中的四唑鎓化合物溶液和疊氮化鈉溶液，或使用含有四唑鎓化合物和疊氮化鈉兩者的溶液(四唑鎓化合物·疊氮化鈉混合液)。
上述各種溶液中的四唑鎓化合物或疊氮化鈉的濃度，可以根據(jù)添加到上述溶血試樣時的稀釋倍率等適當(dāng)確定，四唑鎓化合物的濃度例如為0.1～10mmol/L的范圍，優(yōu)選為0.6～5mmol/L的范圍，更加優(yōu)選為0.7～2.7mmol/L的范圍。疊氮化鈉的濃度例如為0.1～4mmol/L的范圍，優(yōu)選為0.15～1.8mmol/L的范圍，更加優(yōu)選為0.2～1.5mmol/L的范圍。另外，上述混合液的場合，四唑鎓化合物(C)和疊氮化鈉(D)的配合比例(摩爾比C∶D)為C∶D＝20∶3～20∶12的范圍，優(yōu)選為20∶5～20∶11的范圍，更加優(yōu)選為20∶6～20∶10的范圍。
作為上述溶液的溶劑，例如可以使用MOPS、MES、MOPSO、DIPSO、TES、POPSO、HEPES、磷酸等緩沖液，優(yōu)選為MOPS、MES。上述溶劑的pH，例如為5.0～7.0的范圍，優(yōu)選為5.5～6.5的范圍。另外，上述緩沖液的濃度，例如為0.1mmol/L～10mmol/L的范圍，優(yōu)選為1～5mmol/L的范圍，更加優(yōu)選為1～3mmol/L的范圍。添加到上述溶血試樣的場合的處理溶液的最終濃度，例如為0.7～9mmol/L的范圍，優(yōu)選為0.8～4.5mmol/L的范圍，更加優(yōu)選為0.8～2.7mmol/L的范圍。
另外，由于可進(jìn)一步提高靈敏度，優(yōu)選將配制的上述四唑鎓化合物·疊氮化鈉混合液在添加到上述溶血試樣之前通過放置一定時間進(jìn)行老化。通過該老化處理，與不老化的場合相比，靈敏度例如提高約1.2～3倍。
上述老化中，例如，處理溫度優(yōu)選為40～60℃的范圍，更加優(yōu)選為50～60℃的范圍。處理時間例如為6～72小時的范圍，優(yōu)選為15～20小時的范圍。
對于上述溶血試樣，直接或作為上述溶液添加四唑鎓化合物及疊氮化鈉后，通常，處理溫度為40～60℃的范圍，保溫6～72小時，進(jìn)行上述試樣的預(yù)處理。試樣通過用四唑鎓化合物及疊氮化鈉預(yù)處理，如上所述，在可以提高靈敏度的同時，通過四唑鎓化合物可以排除上述試樣中含有的還原物質(zhì)等對氧化還原反應(yīng)的影響，也可提高測定精度。這樣，四唑鎓化合物也有助于提高測定精度，本發(fā)明的目的之一是為了提高測定精度，不只是四唑鎓化合物，也需要疊氮化鈉共存，據(jù)此本發(fā)明可達(dá)到特有的效果。
接著，將添加了四唑鎓化合物及疊氮化鈉的預(yù)處理過的溶血試樣進(jìn)行蛋白酶處理。因?yàn)檫@樣用于后面的處理的FAOD易作用于測定對象物。另外，如上所述，因?yàn)樵谒倪蜴f化合物存在下進(jìn)行蛋白酶處理，糖化Hb的分解也可以快速進(jìn)行。
作為上述蛋白酶，例如可以使用絲氨酸蛋白酶、硫趕蛋白酶(thiolproteases)、金屬蛋白酶等，具體地說，可以使用胰蛋白酶、蛋白酶K、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、彈性蛋白酶、氨基肽酶等，優(yōu)選選擇性分解上述糖化Hb的菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、來自豬胰腺的胰蛋白酶、金屬蛋白酶、來自枯草桿菌的蛋白酶等。作為上述來自枯草桿菌的蛋白酶，例如有商品名為Protease N(例如Fulka公司生產(chǎn))、商品名為Protease N“Amano”(天野制藥公司生產(chǎn))等。作為上述金屬蛋白酶，例如有來自芽孢桿菌屬的金屬蛋白酶(EC 3.4.24.4)(例如，東洋紡公司生產(chǎn)商品名為Toyoteam)等。其中更加優(yōu)選金屬蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶，特別優(yōu)選金屬蛋白酶。這樣，如果使用選擇性分解的蛋白酶，可以選擇性調(diào)制糖化Hb分解物。上述蛋白酶處理通常在緩沖液中進(jìn)行，其處理?xiàng)l件根據(jù)使用的蛋白酶的種類、糖化Hb的濃度等適當(dāng)確定。
作為上述緩沖液，例如可以使用CHES緩沖液、CAPSO緩沖液、CAPS緩沖液、磷酸緩沖液、Tris緩沖液、EPPS緩沖液、HEPES緩沖液等。其pH例如為6～13的范圍，優(yōu)選為8～12的范圍，更加優(yōu)選為9～11的范圍。另外，蛋白酶處理溶液中的上述緩沖液的最終濃度例如為1.0～10mmol/L的范圍。
具體地說，例如，作為上述蛋白酶，使用金屬蛋白酶處理上述預(yù)處理過的溶血試樣時，通常，反應(yīng)液中的金屬蛋白酶濃度為0.1～40MU/L，反應(yīng)液中的血細(xì)胞濃度為0.05～15體積％，反應(yīng)溫度為15～37℃，反應(yīng)時間為1分鐘～24小時，pH為6～12的范圍。
另外，例如，作為上述蛋白酶，使用蛋白酶K處理上述預(yù)處理過的溶血試樣時，通常，反應(yīng)液中的蛋白酶濃度為10～300KU/L，反應(yīng)液中的血細(xì)胞濃度為0.05～15體積％，反應(yīng)溫度為15～37℃，反應(yīng)時間為1分鐘～24小時，pH為6～12的范圍。另外，上述緩沖液的種類也沒有特別限制，例如可以使用Tris-鹽酸緩沖液、EPPS緩沖液、PIPES緩沖液等。
然后，將上述蛋白酶處理的溶血試樣用催化上述式(1)的反應(yīng)，具體地說是催化下式(7)的反應(yīng)的FAOD-α(分解用FAOD)處理。
…(7)上述式(7)中，R1表示與上述相同的糖殘基，R3表示與上述相同的氨基酸側(cè)鏈。
通過該處理，上述溶血試樣中含有的α-氨基被糖化的糖化氨基酸以及上述糖化Hb分解物中α-氨基的糖化部分得到分解。
再者，通過上述FAOD-α處理，糖化氨基酸中側(cè)鏈氨基被糖化的氨基酸沒有被分解而殘存下來。但是，即使從該側(cè)鏈被糖化的氨基酸相對于糖化氨基酸總體的比例，及相對于糖化Hb中具有糖化的側(cè)鏈氨基的氨基酸殘基的比例考慮，可以說殘存的糖化氨基酸的影響小，可充分提高測定精度。
作為處理?xiàng)l件，例如，反應(yīng)液中的FAOD-α濃度為10～5000U/L，反應(yīng)液中的血細(xì)胞濃度為0.5～20體積％，反應(yīng)溫度為20～50℃，反應(yīng)時間為1分鐘～1小時，pH為6～9的范圍。該處理通常在緩沖液中進(jìn)行，可以使用與上述蛋白酶處理相同的緩沖液。
然后，將上述FAOD-α處理的上述溶血試樣進(jìn)一步用FAOD-αS處理。如上所述，該FAOD-αS作用于糖化的α-氨基及糖化的側(cè)鏈氨基兩者。但是，由于糖化Hb分解物預(yù)先通過分解用FAOD-α處理，所以可使測定用FAOD-αS只作用于糖化側(cè)鏈氨基。
該FAOD-αS處理優(yōu)選在與上述蛋白酶處理相同的緩沖液中進(jìn)行，作為上述緩沖液，沒有特別限制，可以使用與上述蛋白酶處理相同的緩沖液。
作為處理?xiàng)l件，例如，反應(yīng)液中的FAOD-αS濃度為10～30000U/L，反應(yīng)液中的血細(xì)胞濃度為0.1～5體積％，反應(yīng)溫度為20～50℃，反應(yīng)時間為1分鐘～1小時，pH為6～9的范圍。
接著，將用上述FAOD-αS處理生成的過氧化氫使用氧化酶及顯色基質(zhì)通過進(jìn)一步氧化還原反應(yīng)進(jìn)行測定。
作為上述顯色基質(zhì)，例如有DA-64、鄰苯二胺(OPD)、Trinder試劑與4-氨基安替比林組合的基質(zhì)等。作為上述Trinder試劑，例如有苯酚、苯酚衍生物、苯胺衍生物、萘酚、萘酚衍生物、萘胺、萘胺衍生物等。另外，除了上述氨基安替比林之外，也可以使用氨基安替比林衍生物、香草醛二胺磺酸、甲基苯并噻唑啉酮腙(MBTH)、磺化甲基苯并噻唑啉酮腙(SMBTH)等。這些顯色性基質(zhì)中，如上所述，特別優(yōu)選DA-64。
作為上述氧化酶，例如優(yōu)選POD。
上述氧化還原反應(yīng)通常在緩沖液中進(jìn)行，其條件根據(jù)上述生成的過氧化氫的濃度等適當(dāng)確定。通常，反應(yīng)液中的POD濃度為10～100000IU/L，顯色基質(zhì)濃度為0.005～30mmol/L，反應(yīng)溫度為15～37℃，反應(yīng)時間為0.1～30分鐘，pH為5～9。另外，上述緩沖液沒有特別限制，例如，可以使用與上述蛋白酶處理及FAOD處理等相同的緩沖液等。
上述氧化還原反應(yīng)中，例如，使用上述顯色基質(zhì)時，通過用分光光度計(jì)測定上述反應(yīng)液的顯色程度(吸光度)，可以測定過氧化氫的量。而且，例如，用預(yù)先準(zhǔn)備的表示過氧化氫量與糖化Hb量的相關(guān)關(guān)系的校正曲線和測定的過氧化氫量，可以求出試樣中的糖化Hb量。
再者，由于由開始添加的分解用FAOD-α生成的過氧化氫因血液試樣(溶血試樣)中開始存在的過氧化氫酶而消失，所以對測定來自通過FAOD-αS生成的測定對象物的過氧化氫沒有影響。另外，也可以添加過氧化氫酶使之消失。這樣，通過上述過氧化氫酶消去過氧化氫時，為了防止連后面進(jìn)行的用測定用FAOD-αS處理生成的過氧化氫也消去，優(yōu)選與添加FAOD-αS一起添加過剩量的POD及顯色性基質(zhì)。這種場合，相對于上述過氧化氫酶的添加量(U)，例如優(yōu)選添加POD5～100倍的活性(U)量。
另外，用分解用FAOD處理溶血試樣時，例如，也可以進(jìn)一步添加尿酸酶、膽紅素氧化酶進(jìn)行同樣的處理。這樣，如果用尿酸酶處理，可以進(jìn)一步分解上述試樣中含有的尿酸，另外，如果用膽紅素氧化酶處理，可以分解膽紅素。由于該尿酸和膽紅素具有還原力，通過這種處理，可進(jìn)一步除去還原物質(zhì)帶來的影響，可以提高測定精度。
上述尿酸酶或膽紅素氧化酶的添加比例，反應(yīng)液中的血細(xì)胞濃度為0.2～2體積％時，例如，上述反應(yīng)液中的尿酸酶濃度為0.1～5000U/L，膽紅素氧化酶濃度為0.1～5000U/L，優(yōu)選尿酸酶濃度為1～2000U/L，膽紅素氧化酶濃度為0.5～1000U/L，更加優(yōu)選尿酸酶濃度為5～1000U/L，膽紅素氧化酶濃度為2～1000U/L。另外，作為其處理?xiàng)l件，例如，可以與上述分解用FAOD同樣地進(jìn)行。
該測定中，如上所述，上述蛋白酶處理不限于在上述分解用FAOD-α處理前進(jìn)行，例如，也可以在上述FAOD-α處理后進(jìn)行。如上所述，上述蛋白酶處理是為了使FAOD易作用而進(jìn)行的，由于上述FAOD-α處理是以分解糖化氨基酸為目的而進(jìn)行的，所以，F(xiàn)AOD-α處理前即使糖化Hb通過蛋白酶沒有被分解，也可以充分得到本發(fā)明的效果。
另外，本發(fā)明的測定方法，不限于本實(shí)施方式的操作順序，例如，也有可以同時進(jìn)行的工序。例如，溶血處理、四唑鎓化合物及疊氮化鈉處理和分解用FAOD處理可以同時進(jìn)行，另外，蛋白酶處理與四唑鎓化合物及疊氮化鈉處理也可以同時進(jìn)行。再者，不限于這些組合。
再者，上述過氧化氫量，除了采用上述POD等的酶方法外，例如，也可以通過電學(xué)方法測定。
(實(shí)施方式A-2)該實(shí)施方式是分解糖化氨基酸和測定糖化Hb使用相同F(xiàn)AOD的例子。作為FAOD沒有特別限制，例如，可以使用FAOD-α、FAOD-S、FAOD-αS之任一種。再者，只要沒有特別表示，就與上述實(shí)施方式A-1同樣地進(jìn)行測定。
在添加了四唑鎓化合物及疊氮化鈉的預(yù)處理過的溶血試樣中添加分解用FAOD。
作為具體的處理?xiàng)l件，例如，反應(yīng)液中的分解用FAOD濃度為10～5000U/L，反應(yīng)液中的血細(xì)胞濃度為0.5～20體積％，反應(yīng)溫度為20～50℃，反應(yīng)時間為1分鐘～1小時，pH為6～9的范圍。該處理通常在緩沖液中進(jìn)行，可以使用與上述相同的緩沖液。
然后，對分解用FAOD處理的試樣進(jìn)行蛋白酶處理。該蛋白酶處理的第1個目的，與上述相同，是為了分解來自血細(xì)胞的糖化Hb，使后面的工序中進(jìn)一步添加的測定用FAOD易作用。而且，第2個目的是為了使上述分解用FAOD消化失活。
由于FAOD與糖化蛋白質(zhì)相比更易作用于糖化氨基酸，所以上述分解用FAOD處理時，糖化氨基酸得到分解。但是，該分解用FAOD處于殘存的狀態(tài)，如果將上述糖化Hb進(jìn)行蛋白酶處理，殘存的分解用FAOD與糖化Hb分解物的糖化部分發(fā)生反應(yīng)，存在不能準(zhǔn)確測定的問題。因此，用蛋白酶使該殘存的分解用FAOD失活，防止與上述糖化Hb分解物反應(yīng)。因此，需要添加使開始添加的分解用FAOD迅速失活、且只能分解糖化Hb的蛋白酶。
作為上述蛋白酶，沒有特別限制，可以使用與上述相同的蛋白酶。另外，其處理?xiàng)l件，例如，根據(jù)使用的蛋白酶的種類、糖化Hb的濃度、分解用FAOD的種類及其量等適當(dāng)確定。
對于分解用FAOD 100U/L而言，蛋白酶處理的反應(yīng)溶液中的蛋白酶的添加量例如為1～1000000KU/L的范圍，優(yōu)選為10～300000KU/L的范圍，更加優(yōu)選為100～100000KU/L的范圍。
具體地說，作為蛋白酶，使用胰蛋白酶處理上述試樣時，例如，反應(yīng)液中的蛋白酶濃度為1000～30000KU/L，反應(yīng)液中的血細(xì)胞濃度為0.2～5體積％，反應(yīng)液中的FAOD濃度為10～1000U/L，反應(yīng)溫度為20～50℃，反應(yīng)時間為10分鐘～20小時，pH為6～9的范圍。
然后，向通過上述蛋白酶處理得到的糖化Hb分解物中添加與分解用FAOD相同的FAOD，作為再度測定用FAOD進(jìn)行處理。由于該測定用FAOD可能因上述蛋白酶而失活，所以需添加足夠量。
該測定用FAOD處理與上述相同，也優(yōu)選在緩沖液中進(jìn)行。作為上述緩沖液，沒有特別限制，可以使用與上述蛋白酶處理同樣的緩沖液。
對于蛋白酶10000KU/L而言，測定用FAOD處理的反應(yīng)溶液中的測定用FAOD的添加量例如為10～1000000U/L的范圍，優(yōu)選為100～200000U/L的范圍，更加優(yōu)選為500～50000U/L的范圍。
作為具體的處理?xiàng)l件，例如，反應(yīng)液中的測定用FAOD濃度為500～20000U/L，反應(yīng)液中的蛋白酶濃度為100～30000KU/L，反應(yīng)液中的血細(xì)胞濃度為0.01～1體積％，反應(yīng)溫度為15～40℃，反應(yīng)時間為1分鐘～1小時，pH為6～9的范圍。
(實(shí)施方式A-3)該實(shí)施方式是分解糖化氨基酸和測定糖化Hb使用相同F(xiàn)AOD的例子。只要沒有特別表示，就與上述實(shí)施方式A-1同樣地進(jìn)行測定。
但是，該實(shí)施方式與上述實(shí)施方式A-2不同，為沒有必要必須用蛋白酶使分解用FAOD失活的實(shí)施方式。由于酶有底物特異性，根據(jù)蛋白酶和FAOD的組合，有時出現(xiàn)用蛋白酶難以使FAOD失活的情況。在這種場合，本實(shí)施方式的方法有效。再者，如果開始添加的分解用FAOD與通過蛋白酶生成的糖化Hb分解物反應(yīng)，由于不能提高測定精度，所以，如下所述，調(diào)整FAOD的添加比例變得重要。
在添加了四唑鎓化合物及疊氮化鈉的預(yù)處理過的溶血試樣中添加分解用FAOD。
用蛋白酶難以使分解用FAOD失活時，即使其活性殘存，蛋白酶處理期間，需要在不作用于生成的糖化Hb分解物的范圍內(nèi)添加。另外，由于利用FAOD易作用于糖化氨基酸、難作用于糖化蛋白質(zhì)的性質(zhì)，所以優(yōu)選只作用于糖化氨基酸程度的添加量和反應(yīng)時間。
作為FAOD處理的條件，例如，反應(yīng)液中的FAOD濃度為10～5000U/L，反應(yīng)液中的血細(xì)胞濃度為0.2～20體積％，反應(yīng)溫度為20～50℃，反應(yīng)時間為1分鐘～1小時，pH為6～9的范圍。該處理通常在緩沖液中進(jìn)行，可以使用與上述相同的緩沖液。
然后，對上述FAOD處理的試樣進(jìn)行蛋白酶處理。如上所述，由于該實(shí)施方式是蛋白酶難以作用于上述FAOD的場合的例子，所以蛋白酶的添加量沒有特別限制。
作為上述蛋白酶沒有特別限制，可以使用與上述同樣的蛋白酶。其處理?xiàng)l件與上述相同，根據(jù)使用的蛋白酶的種類、糖化Hb的濃度、使用的蛋白酶對FAOD的底物特異性等適當(dāng)確定。
作為適應(yīng)于這種實(shí)施方式的FAOD與蛋白酶的組合，例如有商品名為FOD(旭化成公司生產(chǎn))和商品名為Toyoteam(東洋紡公司生產(chǎn))、上述來自赤霉菌屬的FAOD及商品名為Proteinase K(Roche公司生產(chǎn))的蛋白酶等。
作為蛋白酶，使用胰蛋白酶處理上述試樣時，例如，反應(yīng)液中的蛋白酶濃度為100～6000U/L，反應(yīng)液中的血細(xì)胞濃度為0.2～5體積％，反應(yīng)液中的FAOD濃度為1～100U/L，反應(yīng)溫度為20～50℃，反應(yīng)時間為10分鐘～20小時，pH為6～9的范圍。
接下來，向通過上述蛋白酶處理得到的分解物中再次添加相同的FAOD作為測定用FAOD。
該測定用FAOD處理與上述相同，也優(yōu)選在緩沖液中進(jìn)行，作為上述緩沖液，沒有特別限制，可以使用與上述蛋白酶處理同樣的緩沖液。
這樣，本實(shí)施方式中，分解用FAOD(A)與測定用FAOD(B)的添加比例(活性比A∶B)，例如，如上所述，為A∶B＝1∶50000～1∶10的范圍，優(yōu)選為1∶5000～1∶25的范圍，更加優(yōu)選為1∶500～1∶50的范圍。如果這樣設(shè)定，與上述實(shí)施方式A-2不同，反應(yīng)液中殘存上述分解用FAOD，但是由于該殘存的FAOD的反應(yīng)速度非常慢，蛋白酶處理工序中，殘存FAOD作用于生成的糖化Hb分解物沒有達(dá)到影響測定的程度。
作為處理?xiàng)l件，例如，反應(yīng)液中的測定用FAOD濃度為500～20000U/L，反應(yīng)液中的蛋白酶濃度為100～30000KU/L，反應(yīng)液中的血細(xì)胞濃度為0.01～1體積％，反應(yīng)溫度為15～40℃，反應(yīng)時間為1分鐘～1小時，pH為6～9的范圍。
(實(shí)施方式A-4)該實(shí)施方式是顯色基質(zhì)使用DA-64，測定通過上述測定用FAOD處理生成的過氧化氫的例子。再者，只要沒有特別表示，就與上述實(shí)施方式A-1同樣地進(jìn)行測定。
顯色基質(zhì)使用DA-64時，為了防止DA-64的誤顯色，將DA-64、四唑鎓化合物、疊氮化鈉及表面活性劑在上述氧化還原反應(yīng)溶液中的終濃度分別設(shè)定為以下范圍。通常，各成分的終濃度為DA-64為1～10000μmol/L，表面活性劑為0.01～200mmol/L，四唑鎓化合物為0.05～20mmol/L，疊氮化鈉為0.01～5mmol/L的范圍，優(yōu)選DA-64為2～1000μmol/L，表面活性劑為0.05～30mmol/L，四唑鎓化合物為0.01～10mmol/L，疊氮化鈉為0.02～2mmol/L的范圍，更加優(yōu)選DA-64為3～300μmol/L，表面活性劑為0.1～10mmol/L，四唑鎓化合物為0.5～8mmol/L，疊氮化鈉為0.08～0.8mmol/L的范圍。作為上述表面活性劑，沒有特別限制，例如，可以使用上述及后述的表面活性劑。
該氧化還原反應(yīng)溶液的pH優(yōu)選為6.0～10.0的范圍，更加優(yōu)選為6.5～9.0的范圍，特別優(yōu)選為7.0～8.5的范圍。
上述表面活性劑的添加例如可以在添加DA-64之前或同時進(jìn)行，如果為配制溶血試樣添加表面活性劑時，也可以預(yù)先添加，使氧化還原反應(yīng)時表面活性劑達(dá)到上述濃度范圍。
上述DA-64由于通過氧化還原反應(yīng)而顯色，關(guān)于該反應(yīng)液，例如，如果用分光光度計(jì)測定檢測波長600～780nm范圍的吸光度(顯色程度)，可以測定過氧化氫的量。
(實(shí)施方式A-5)下面，關(guān)于本發(fā)明的Hb糖化率的測定方法，舉以全血作為試樣時的例子進(jìn)行說明。
首先，與上述實(shí)施方式A-1相同，將全血溶血，測定溶血試樣中的糖化Hb量，另一方面，測定上述溶血試樣中的Hb量。
例如可如以下所示測定Hb量。首先，向上述溶血試樣中添加上述四唑鎓化合物，使Hb變性。其添加比例，例如，當(dāng)上述溶血試樣中的血細(xì)胞濃度為0.2～2體積％時，優(yōu)選添加以使?jié)舛冗_(dá)到0.005～400mmol/L的范圍，更加優(yōu)選為0.02～100mmol/L的范圍，特別優(yōu)選為0.1～50mmol/L的范圍。具體地說，上述四唑鎓化合物為WST-3時，優(yōu)選添加以使?jié)舛冗_(dá)到0.004～16mmol/L的范圍，更加優(yōu)選為0.02～10mmol/L的范圍，特別優(yōu)選為0.1～5mmol/L的范圍。
上述四唑鎓化合物也可以直接使用，但從操作的簡便性和處理效率等方面來看，優(yōu)選使用溶解在溶劑中的四唑鎓化合物溶液。上述溶液的濃度根據(jù)四唑鎓化合物的種類(例如分子量等)等適當(dāng)確定，例如為0.01～120mmol/L的范圍，優(yōu)選為0.1～50mmol/L的范圍，更加優(yōu)選為0.2～20mmol/L的范圍。作為上述溶劑，例如可以使用蒸餾水、生理鹽水、緩沖液等，作為上述緩沖液，例如可以使用上述緩沖液。再者，上述四唑鎓化合物可以使用一種，也可以2種以上并用。
對采用上述四唑鎓化合物的處理?xiàng)l件沒有特別限制，例如溫度為4～50℃的范圍，處理時間為20秒～60分鐘的范圍，優(yōu)選溫度為15～40℃的范圍，處理時間為20秒～20分鐘的范圍，更加優(yōu)選溫度為25～37℃的范圍，處理時間為30秒～6分鐘的范圍。
另外，該四唑鎓化合物處理優(yōu)選在表面活性劑存在下進(jìn)行。因?yàn)檫@樣可以進(jìn)一步促進(jìn)Hb的變性。因此，從操作的簡便性等來看，在上述試樣溶血時，預(yù)先添加四唑鎓化合物也可以。
作為上述表面活性劑，例如可以使用聚氧乙烯醚、聚氧乙烯苯酚醚、聚氧乙烯失水山梨糖醇烷基酯、聚氧乙烯烷基醚等。優(yōu)選聚氧乙烯醚等。該聚氧乙烯醚[CLHM-O-(CH2CH2O)NH]是聚氧乙烯鏈與烴鏈進(jìn)行醚鍵合，作為上述烴鏈例如有烷基、烷基苯基等。優(yōu)選上述聚氧乙烯鏈的重均聚合度(N)為8～23的范圍，另一方的烴鏈的碳數(shù)(L)為8～18的范圍，更加優(yōu)選上述重均聚合度(N)為8～15的范圍，烴鏈的碳數(shù)(L)為8～16的范圍，特別優(yōu)選上述重均聚合度(N)為8～10的范圍，烴鏈的碳數(shù)(L)為8～14的范圍。另外，上述烴鏈，例如，可以是直鏈，也可以有支鏈。作為上述聚氧乙烯醚的具體例子，例如有聚氧乙烯對叔辛基苯基醚、聚乙二醇(10)月桂醚、聚乙二醇(9)月桂醚等。
更具體地說，例如可以使用市售的Triton類表面活性劑聚氧乙烯對叔辛基苯基醚等、市售的Tween類表面活性劑聚氧乙烯失水山梨糖醇烷基酯等、市售的Brij類表面活性劑聚氧乙烯烷基醚等。除此以外，例如，也可以使用聚氧乙烯(10)月桂醚、商品名Nikkol BL-9EX(聚氧乙烯的重均聚合度N為9，和光純藥工業(yè)公司生產(chǎn))等之類的聚氧乙烯(9)月桂醚、商品名Tergitol NPX(聚氧乙烯的重均聚合度N為約10.5，Nacalai Tesque公司生產(chǎn))及商品名Tergitol NP-40(聚氧乙烯的重均聚合度N為20，Nacalai Tesque公司生產(chǎn))等之類的聚氧乙烯辛基苯基醚等。再者，這些表面活性劑也可以作為溶血用的表面活性劑使用。
表面活性劑的添加量沒有特別限制，例如上述溶血試樣中的血細(xì)胞濃度為0.2～1體積％時，優(yōu)選添加以使?jié)舛冗_(dá)到0.05～50mmol/L的范圍，更加優(yōu)選為0.2～30mmol/L的范圍，特別優(yōu)選為0.3～10mmol/L的范圍。具體地說，當(dāng)上述表面活性劑為商品名TritonX-100時，優(yōu)選添加以使?jié)舛冗_(dá)到0.2～100mmol/L的范圍，更加優(yōu)選為1～30mmol/L的范圍，特別優(yōu)選為2～20mmol/L的范圍。另外，當(dāng)為商品名Brij35時，優(yōu)選添加以使?jié)舛冗_(dá)到0.1～50mmol/L的范圍，更加優(yōu)選為0.5～20mmol/L的范圍，特別優(yōu)選為1～10mmol/L的范圍。
另外，對于0.5～5mmol上述四唑鎓化合物而言，例如，可以添加上述表面活性劑達(dá)到0.1～70mmol的范圍，優(yōu)選為0.3～50mmol的范圍，更加優(yōu)選為0.4～20mmol的范圍。具體地說，當(dāng)上述表面活性劑為商品名TritonX-100時，對于1mmol四唑鎓化合物而言，優(yōu)選添加使之達(dá)到0.2～15mmol的范圍，更加優(yōu)選為0.5～10mmol的范圍，特別優(yōu)選為0.7～5mmol的范圍。另外，當(dāng)為商品名Brij35時，對于1mmol四唑鎓化合物而言，優(yōu)選添加使之達(dá)到0.1～10mmol的范圍，更加優(yōu)選為0.2～8mmol的范圍，特別優(yōu)選為0.3～4mmol的范圍。再者，在試樣溶血時，預(yù)先添加能夠促進(jìn)Hb變性的足夠量的表面活性劑也可以。
接下來，進(jìn)行上述變性Hb的吸光度測定。如上所述，優(yōu)選測定波長為520～670nm的范圍，更加優(yōu)選為550～660nm的范圍。另外，在以上述波長為主波長進(jìn)行雙波長測定的場合，優(yōu)選副波長為730～900nm的范圍，更加優(yōu)選為800～900nm的范圍，特別優(yōu)選為800～850nm的范圍。
然后，由所測定的變性Hb的吸光度與預(yù)先作成的校正曲線求出Hb量，由上述所測定的糖化Hb量與Hb量可以算出Hb糖化率。
上述校正曲線，例如，可以用上述的Hb測定方法及公知的測定方法測定含有已知量的Hb的標(biāo)準(zhǔn)試樣，由這些測定值作成。作為上述公知的測定方法，只要是測定精度優(yōu)良的方法，沒有特別的限制，例如，優(yōu)選國際標(biāo)準(zhǔn)HiCN法。
再者，為求出Hb量進(jìn)行的變性Hb的吸光度測定，例如，可以如下進(jìn)行分取為測定糖化Hb配制的溶血試樣的一部分，將其作為Hb測定用試樣。但是，從簡便快速地進(jìn)行操作的觀點(diǎn)看，優(yōu)選在糖化Hb的測定工序中進(jìn)行。具體地說，例如，測定上述實(shí)施方式A-1所示的上述糖化Hb時，向上述溶血試樣中添加四唑鎓化合物后，向上述溶血試樣中添加四唑鎓化合物及疊氮化鈉后、進(jìn)行蛋白酶處理后、或進(jìn)行測定用FAOD處理后等，可以測定變性Hb的吸光度。
(實(shí)施方式A-6)下面關(guān)于本發(fā)明的HbAlc的測定方法，舉以全血作為試樣時的例子進(jìn)行說明。
首先，關(guān)于全血試樣，與上述實(shí)施方式A-1相同，測定糖化Hb量。另一方面，準(zhǔn)備糖化Hb中HbAlc量已知的糖化Hb標(biāo)準(zhǔn)液，與上述相同，測定糖化Hb量，作成表示該標(biāo)準(zhǔn)液的測定值(糖化Hb量)與HbAlc量關(guān)系的校正曲線。如上所述，由于上述糖化Hb的測定值與HbAlc量存在相關(guān)關(guān)系，將上述全血試樣中的糖化Hb量的測定值代入該校正曲線，可以求出上述全血試樣中的HbAlc量。
再者，校正曲線的作成中，作為上述糖化Hb量的測定值，不只是最終求得的糖化Hb量，也可以是測定上述糖化Hb量時通過POD處理得到的反應(yīng)液的吸光度的值，也可以使用由上述吸光度求得的過氧化氫量。
下面，關(guān)于本發(fā)明的測定試劑盒，舉測定對象物為糖化Hb的例子進(jìn)行說明。
(實(shí)施方式B-1)該實(shí)施方式是預(yù)處理用試劑的分解用FAOD使用FAOD-α，顯色用試劑的測定用FAOD使用FAOD-αS的上述第1測定試劑盒的一例。
該測定試劑盒由含有分解用FAOD的預(yù)處理用試劑、含有蛋白酶的蛋白酶試劑，及含有測定用FAOD、氧化還原酶和顯色基質(zhì)的顯色用試劑組成。
這些預(yù)處理用試劑、蛋白酶試劑、顯色用試劑可分別通過在水性溶劑中溶解所含有的成分而配制。
(預(yù)處理用試劑)在最終的顯色反應(yīng)溶液中，將預(yù)處理用試劑例如稀釋10～200倍，優(yōu)選稀釋20～100倍。因此，預(yù)處理用試劑中含有的FAOD等的濃度例如可根據(jù)該稀釋倍率等適當(dāng)確定。另外，根據(jù)測定試樣中的測定對象物或分解的糖化氨基酸的量，通過改變預(yù)處理用試劑在試樣中的添加量，也可以調(diào)整反應(yīng)系統(tǒng)中的FAOD等的量。
具體地說，預(yù)處理用試劑中的分解用FAOD濃度例如為10～5000U/L的范圍。
作為上述水性溶劑，沒有特別限制，例如有水、含有上述各種緩沖劑的緩沖液等。上述緩沖劑中，優(yōu)選CHES、MOPS、TAPS、EPPS、磷酸、HEPPSO、POPSO、硼酸，更加優(yōu)選CHES、MOPS、TAPS、磷酸。上述緩沖液的濃度例如為5～200mol/L的范圍，優(yōu)選為20～150mol/L的范圍。另外，上述緩沖液的pH例如為8～10的范圍，優(yōu)選為8.5～10.0的范圍。
另外，該預(yù)處理用試劑，除分離用FAOD外，也可以進(jìn)一步含有以下成分。
含有表面活性劑時，例如可以使用上述各種表面活性劑，優(yōu)選聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯辛基苯基醚。另外，表面活性劑濃度例如為0.03～200mmol/L的范圍，優(yōu)選為0.1～50mmol/L的范圍。
含有尿酸酶時，其濃度例如為1～2000U/L的范圍，另外，含有膽紅素氧化酶時，其濃度例如為1～2000U/L的范圍。再者，也可以含有這兩者。
(蛋白酶試劑)下面，在最終的顯色反應(yīng)溶液中，將蛋白酶試劑例如稀釋1.1～3倍。因此，與上述預(yù)處理用試劑相同，各成分的濃度可根據(jù)該稀釋倍率等適當(dāng)確定，另外，根據(jù)試樣中的糖化Hb量，通過改變在試樣中的添加量，也可以調(diào)整反應(yīng)系統(tǒng)中的蛋白酶量。
作為蛋白酶，例如可以使用上述蛋白酶。當(dāng)?shù)鞍酌笧榻饘俚鞍酌笗r，蛋白酶試劑中的蛋白酶濃度例如為0.5～100MU/L的范圍，優(yōu)選為1～40MU/L的范圍。
作為上述水性溶劑，沒有特別限制，例如有水、含有上述各種緩沖劑的緩沖液等。上述緩沖劑中，優(yōu)選MES、MOPS，更加優(yōu)選MES。上述緩沖液的濃度例如為1～20mmol/L的范圍，優(yōu)選為1～5mmol/L的范圍。另外，上述緩沖液的pH例如為5.0～7.0的范圍，優(yōu)選為5.5～6.5的范圍。
另外，該蛋白酶試劑，除上述蛋白酶外，也可以進(jìn)一步含有以下成分。
作為其他成分，例如有四唑鎓化合物及疊氮化鈉。這時，上述蛋白酶試劑，例如四唑鎓化合物濃度為0.1～10mol/L的范圍，疊氮化鈉濃度為0.05～4mmol/L的范圍，優(yōu)選四唑鎓化合物濃度為0.6～5mmol/L的范圍，疊氮化鈉濃度為0.15～1.8mol/L的范圍。另外，四唑鎓化合物(C)和疊氮化鈉(D)的添加比例(摩爾比C∶D)優(yōu)選為C∶D＝20∶3～20∶12的范圍，更加優(yōu)選為C∶D＝20∶5～20∶11的范圍，特別優(yōu)選為C∶D＝20∶6～20∶10的范圍。
另外，作為蛋白酶，使用金屬蛋白酶時，也可以進(jìn)一步含有Ca化合物和Na化合物。作為上述Ca化合物和Na化合物，只要是在上述水性溶劑中離子化成Ca2+和Na+的化合物，沒有特別限制。作為上述Ca化合物，例如可以使用氯化鈣(CaCl2)、CaSO4、(CH3COO)2Ca等，優(yōu)選CaCl2、CaSO4。另外，作為上述Na化合物，例如可以使用氯化鈉(NaCl)、CH3COONa、Na2SO4、NaNO3等，優(yōu)選NaCl、Na2SO4。這些Ca化合物和Na化合物分別可以使用一種，也可二種以上并用。
如上所述，金屬蛋白酶的濃度為0.5～100MU/L的范圍，優(yōu)選為1～40MU/L的范圍。
另一方面，為使離解的Ca2+濃度達(dá)0.1～5mmol/L的范圍，上述Ca化合物的濃度為0.1～50mmol/L的范圍。另外，為使離解的Na+濃度達(dá)5～1000mmol/L的范圍，Na化合物的濃度為5～1000mmol/L的范圍，優(yōu)選為10～300mmol/L的范圍。
(顯色用試劑)下面，在最終的顯色反應(yīng)溶液中，將顯色用試劑例如稀釋2～20倍，優(yōu)選稀釋3～10倍，更加優(yōu)選稀釋4～8倍。這時也與上述相同，各成分的濃度可根據(jù)該稀釋倍率等適當(dāng)確定。另外，根據(jù)試樣中的糖化Hb及產(chǎn)生的過氧化氫的量，通過改變添加量，可以調(diào)整反應(yīng)系統(tǒng)中的各成分的量。
顯色用試劑中的測定用FAOD的濃度，例如為1～200KU/L的范圍，優(yōu)選為5～100KU/L的范圍。
氧化還原酶的濃度，例如為1～1000KU/L的范圍，優(yōu)選為10～200KU/L的范圍。作為上述氧化還原酶，如上所述，例如有POD。
上述顯色基質(zhì)的濃度，例如為0.001～100mmol/L的范圍，優(yōu)選為0.005～10mmol/L的范圍，更加優(yōu)選為0.02～1mmol/L的范圍。作為上述顯色基質(zhì)，例如有如上所述的顯色基質(zhì)。
作為上述水性溶劑，沒有特別限制，例如有水、含有上述各種緩沖劑的緩沖液等。上述緩沖劑中，優(yōu)選Tris、磷酸。上述緩沖液的濃度例如為20～1000mmol/L的范圍，優(yōu)選為50～500mmol/L的范圍。另外，上述緩沖液的pH例如為pH6～9的范圍，優(yōu)選為6.5～8的范圍。
(使用方法)下面，對使用這種測定試劑盒測定血細(xì)胞中的糖化Hb的方法進(jìn)行說明。
首先，與上述實(shí)施方式A-1相同，從全血配制溶血試樣，向該溶血試樣中添加上述預(yù)處理用試劑，使分解用FAOD作用于試樣中的糖化氨基酸，進(jìn)行分解。
通過該分解用FAOD-αS的作用，上述溶血試樣中含有的α-氨基被糖化的糖化氨基酸、以及上述糖化Hb分解物中α-氨基的糖化部分得到分解。再者，通過上述FAOD-α處理，糖化氨基酸中側(cè)鏈氨基被糖化的氨基酸沒有被分解而殘存下來。但是，即使從該側(cè)鏈被糖化的氨基酸相對于糖化氨基酸總體的比例，及相對于糖化Hb中被糖化的側(cè)鏈氨基的比例考慮，可以說殘存的糖化氨基酸的影響小，可充分提高測定精度。
對于血細(xì)胞濃度為30～60體積％的30μL溶血試樣而言，上述預(yù)處理用試劑的添加量例如為300～3000μL的范圍，優(yōu)選為600～2400μL的范圍。對于血細(xì)胞濃度1體積％而言，優(yōu)選添加上述預(yù)處理用試劑的預(yù)處理反應(yīng)液使上述分解用FAOD濃度達(dá)到10～5000Umol/L的范圍。另外，上述處理溶液的pH優(yōu)選為8～10的范圍，更加優(yōu)選為8.5～10的范圍。
該預(yù)處理優(yōu)選從添加上述預(yù)處理用試劑開始保溫，其條件例如為10～37℃、0.1～20分鐘，優(yōu)選為15～37℃、0.1～5分鐘。
再者，該預(yù)處理用試劑含有表面活性劑時，例如，沒有必要另行進(jìn)行上述溶血處理來配制溶血試樣。即，通過將預(yù)處理用試劑添加到全血或血細(xì)胞試樣中，可以進(jìn)行表面活性劑的溶血處理和分解用FAOD的糖化氨基酸的分解處理兩者。
這種情況，對于血細(xì)胞濃度1體積％而言，優(yōu)選添加上述預(yù)處理用試劑的預(yù)處理反應(yīng)液，使上述表面活性劑濃度達(dá)到0.05～50mmol/L的范圍，更加優(yōu)選為0.2～30mmol/L的范圍，特別優(yōu)選為0.3～10mol/L的范圍。
另外，上述預(yù)處理用試劑含有上述尿酸酶、膽紅素氧化酶時，對于血細(xì)胞濃度1體積％而言，上述處理用試劑優(yōu)選使上述尿酸酶濃度達(dá)到0.4～4000U/L的范圍，膽紅素氧化酶濃度達(dá)到0.4～4000U/L的范圍，更加優(yōu)選尿酸酶濃度為3～1500U/L的范圍，膽紅素氧化酶濃度為1～700U/L的范圍，特別優(yōu)選尿酸酶濃度為5～1000U/L的范圍，膽紅素氧化酶濃度為2～700U/L的范圍。
然后，向上述預(yù)處理反應(yīng)液中添加蛋白酶試劑，試樣中的糖化Hb在分解用FAOD作用下進(jìn)行分解。
例如，對于血細(xì)胞濃度1體積％的10μL上述預(yù)處理反應(yīng)液而言，蛋白酶試劑的添加量例如為50～300μL的范圍，優(yōu)選為60～180μL的范圍。對于血細(xì)胞濃度0.1體積％而言，優(yōu)選添加上述蛋白酶試劑的蛋白酶反應(yīng)液，使上述蛋白酶濃度達(dá)到100～50000KU/L的范圍，更加優(yōu)選為300～30000KU/L的范圍。另外，上述蛋白酶反應(yīng)液的pH優(yōu)選為6～9的范圍，更加優(yōu)選為7～8.5的范圍。
該蛋白酶處理，優(yōu)選在添加上述蛋白酶試劑開始保溫，其條件例如為25～37℃、3～30分鐘，優(yōu)選為25～37℃、3～10分鐘，更加優(yōu)選為30～37℃、3～5分鐘。
另外，該蛋白酶試劑含有上述四唑鎓化合物及疊氮化鈉時，對于上述蛋白酶濃度為100～10000KU/L的范圍而言，上述蛋白酶反應(yīng)液，例如，四唑鎓化合物為0.1～10mmol/L的范圍，疊氮化鈉為0.08～4.0mmol/L的范圍，優(yōu)選四唑鎓化合物為0.6～5mmol/L的范圍，疊氮化鈉為0.15～1.8mmol/L的范圍。具體地說，四唑鎓化合物為WST-3時，優(yōu)選在蛋白酶反應(yīng)液中的濃度為0.2～6mmol/L的范圍，更加優(yōu)選為0.6～4mmol/L的范圍，特別優(yōu)選為0.7～2.7mmol/L的范圍。這樣通過添加四唑鎓化合物及疊氮化鈉，與不添加的場合相比，其靈敏度提高約1.2～3倍。
另外，如上所述，該蛋白酶試劑含有金屬蛋白酶、進(jìn)一步含有Ca化合物和Na化合物時，對于上述金屬蛋白酶濃度為100～10000KU/L的范圍而言，上述蛋白酶反應(yīng)液，例如，Ca化合物為0.1～50mmol/L的范圍，Na化合物為5～1000mmol/L的范圍，優(yōu)選Ca化合物為0.2～10mol/L的范圍，Na化合物為10～500mol/L的范圍，更加優(yōu)選Ca化合物為0.2～5mol/L的范圍，Na化合物為30～500mol/L的范圍。
然后，向上述蛋白酶反應(yīng)液中添加上述顯色用試劑，使測定用FAOD作用于糖化Hb分解物，通過上述式(1)的反應(yīng)，生成過氧化氫，其與顯色基質(zhì)通過氧化還原酶反應(yīng)，通過氧化使上述顯色基質(zhì)顯色。
如上所述，測定用的FAOD-αS作用于糖化的α-氨基及糖化的側(cè)鏈氨基兩者。但是，由于預(yù)先通過預(yù)處理用試劑中的分解用FAOD-α處理，可使測定用FAOD-αS只作用于糖化的側(cè)鏈氨基。
例如，對于100μL上述蛋白酶反應(yīng)液而言，顯色用試劑的添加量例如為5～100μL的范圍，優(yōu)選為8～50μL的范圍，更加優(yōu)選為10～30μL的范圍。添加上述顯色用試劑的顯色反應(yīng)溶液，優(yōu)選測定用FAOD濃度為0.5～200KU/L的范圍，氧化還原酶濃度為1～1000KU/L的范圍，顯色基質(zhì)的濃度為0.001～100mmol/L的范圍，更加優(yōu)選測定用FAOD濃度為1～100KU/L的范圍，氧化還原酶濃度為5～200KU/L的范圍，顯色基質(zhì)的濃度為0.005～10mmol/L的范圍，更加優(yōu)選測定用FAOD濃度為2～100KU/L的范圍，氧化還原酶濃度為5～200KU/L的范圍，顯色基質(zhì)的濃度為0.01～1mmol/L的范圍。另外，上述顯色反應(yīng)溶液的pH優(yōu)選為6～9的范圍，更加優(yōu)選為6.5～8的范圍。
該顯色反應(yīng)優(yōu)選從添加上述顯色用試劑開始保溫一定時間，其條件例如為15～37℃、1～30分鐘，優(yōu)選為25～37℃、3～10分鐘，更加優(yōu)選為30～37℃、3～5分鐘。
然后，測定顯色基質(zhì)的顯色。例如，可以用分光光度計(jì)測定顯色反應(yīng)溶液的顯色程度(吸光度)，由該吸光度確定過氧化氫的量。而且，例如，用預(yù)先準(zhǔn)備的表示過氧化氫量與糖化Hb量的相關(guān)關(guān)系的校正曲線和測定的過氧化氫量，可以求出試樣中的糖化Hb量。
再者，由于由上述本發(fā)明的糖化蛋白質(zhì)開始添加的分解用FAOD-α生成的過氧化氫因血液試樣(溶血試樣)中開始存在的過氧化氫酶而消失，所以對測定由FAOD-αS生成的來自測定對象物的過氧化氫沒有影響。但是，為了充分消去上述過氧化氫，預(yù)處理用試劑中也可以進(jìn)一步含有過氧化氫酶。這樣，通過上述過氧化氫酶消去過氧化氫時，為了防止連通過后面添加的顯色用試劑中的測定用FAOD-αS處理生成的過氧化氫也因上述過氧化氫酶而消去，優(yōu)選顯色用試劑中含有過剩量的POD及顯色基質(zhì)。
這種場合，預(yù)處理用試劑中的過氧化氫酶濃度，例如為5～300U/L的范圍，優(yōu)選為10～100U/L的范圍，更加優(yōu)選為10～70U/L的范圍。另外，上述預(yù)處理反應(yīng)液中的過氧化氫酶濃度，例如為1.5～50U/L的范圍，優(yōu)選為1.5～30U/L的范圍，更加優(yōu)選為1.5～15U/L的范圍。上述顯色反應(yīng)溶液中的過氧化氫酶濃度，例如為1～50U/L的范圍，優(yōu)選為1～30U/L的范圍，更加優(yōu)選為1～10U/L的范圍。
另外，顯色用試劑中的POD濃度，例如為5～1000KU/L的范圍，優(yōu)選為10～200KU/L的范圍，更加優(yōu)選為20～200KU/L的范圍。顯色反應(yīng)溶液中的POD濃度，例如為3～300KU/L的范圍，優(yōu)選為5～200KU/L的范圍，更加優(yōu)選為10～100KU/L的范圍。
另外，顯色反應(yīng)溶液中的過氧化氫酶(E)與POD(F)的比例(活性比E∶F)，例如為E∶F＝1∶2～1∶40的范圍，優(yōu)選為1∶3～1∶20的范圍，更加優(yōu)選為1∶4～1∶10的范圍。
另外，顯色用試劑中的顯色基質(zhì)濃度，例如為0.01～200mol/L的范圍，優(yōu)選為0.02～20mol/L的范圍，更加優(yōu)選為0.04～5mol/L的范圍。顯色反應(yīng)溶液中的顯色基質(zhì)的濃度，例如為0.001～100mmol/L的范圍，優(yōu)選為0.005～10mmol/L的范圍，更加優(yōu)選為0.01～1mmol/L的范圍。
使用該測定試劑盒進(jìn)行測定時，各試劑的添加不限于上述順序，也有可以同時添加的試劑。具體地說，例如，在試樣中，可以添加預(yù)處理用試劑后，同時添加蛋白酶試劑和顯色用試劑，也可以同時添加預(yù)處理用試劑和蛋白酶試劑后，添加顯色用試劑。另外，例如，在試樣中，例如也可以添加蛋白酶試劑后，添加預(yù)處理用試劑，然后添加顯色用試劑。
再者，如果使用本發(fā)明的測定試劑盒，也可以快速簡便地高精度測定HbAlc量。這是由于使用本發(fā)明的測定試劑盒測定的糖化Hb量與HbAlc存在高的相關(guān)關(guān)系。具體地說，由通過本發(fā)明的測定試劑盒測定的糖化Hb量與HbAlc量的相關(guān)關(guān)系作成校正曲線，通過上述測定試劑盒測定試樣中的糖化Hb量，將該測定值代入上述校正曲線中，可以求出HbAlc量。
(實(shí)施方式B-2)該實(shí)施方式是預(yù)處理用試劑的分解用FAOD和顯色用試劑的測定用FAOD使用相同F(xiàn)AOD第2測定試劑盒的一例。作為FAOD，沒有特別限制，例如，可以使用FAOD-α、FAOD-S、FAOD-αS之任一種。再者，本實(shí)施方式的測定試劑盒，只要沒有特別表示，就與上述實(shí)施方式B-1相同，另外，可以同樣地用于測定糖化Hb。
如上所述，由于FAOD與糖化蛋白質(zhì)相比更易作用于糖化氨基酸，通過上述分解用FAOD，糖化氨基酸得到分解。但是，與上述實(shí)施方式B-1不同，如果分解用FAOD和測定用FAOD使用相同F(xiàn)AOD，發(fā)生以下問題。即，預(yù)處理反應(yīng)液中，在分解用FAOD殘存的狀態(tài)下添加蛋白酶試劑，如果分解上述糖化Hb，殘存的FAOD與糖化Hb分解物的糖化部分反應(yīng)，則發(fā)生不能準(zhǔn)確測定的問題。因此，使用相同F(xiàn)AOD時，需通過蛋白酶試劑的蛋白酶分解糖化Hb，且使上述預(yù)處理反應(yīng)液中殘存的分解用FAOD失活，防止與上述糖化Hb分解物反應(yīng)。因此，蛋白酶試劑中需含有使預(yù)處理試劑的分解用FAOD迅速失活、且只能分解糖化Hb的蛋白酶。
上述蛋白酶的種類及含有量沒有特別限制，例如，優(yōu)選根據(jù)使用的FAOD的種類及量、蛋白酶對于FAOD的底物特異性、糖化Hb量等、添加到反應(yīng)溶液中的稀釋比例適當(dāng)確定。作為這種FAOD與蛋白酶的組合，例如有商品名為FOD(旭化成公司生產(chǎn))和商品名為Toyoteam(東洋紡公司生產(chǎn))、上述來自赤霉菌屬的FAOD及商品名為Proteinase K(Roche公司生產(chǎn))的蛋白酶等。
具體地說，對于上述分解用FAOD 100U/L而言，例如，優(yōu)選添加上述蛋白酶試劑使蛋白酶反應(yīng)液中的蛋白酶濃度達(dá)到1～1000000KU/L的范圍，更加優(yōu)選蛋白酶濃度為10～300000KU/L的范圍，特別優(yōu)選為100～100000KU/L的范圍。具體地說，作為蛋白酶，使用胰蛋白酶時，例如，優(yōu)選添加上述蛋白酶試劑使上述蛋白酶反應(yīng)液中的胰蛋白酶濃度達(dá)到1000～30000KU/L，血細(xì)胞濃度達(dá)到0.2～5體積％，分解用FAOD濃度達(dá)到10～100U/L。另外，作為反應(yīng)條件，例如，溫度為20～50℃，時間為10分鐘～20小時，pH為6～9。
另外，本實(shí)施方式中，由于通過上述蛋白酶可能連顯色用試劑中的測定用FAOD也失活，所以需添加足夠量的上述測定用FAOD。
具體地說，對于10000KU/L蛋白酶而言，例如，優(yōu)選添加上述顯色用試劑使測定用FAOD處理的反應(yīng)溶液中的測定用FAOD濃度達(dá)到10～1000000U/L的范圍，更加優(yōu)選添加上述顯色用試劑使測定用FAOD濃度達(dá)到100～200000U/L的范圍，特別優(yōu)選測定用FAOD濃度達(dá)到500～50000U/L的范圍。
作為具體的處理?xiàng)l件，例如，優(yōu)選添加上述顯色用試劑使反應(yīng)液中的測定用FAOD濃度達(dá)到500～20000U/L，反應(yīng)液中的蛋白酶濃度達(dá)到100～30000KU/L，反應(yīng)液中的血細(xì)胞濃度達(dá)到0.01～1體積％。另外，作為反應(yīng)條件，例如，溫度為15～40℃，時間為1分鐘～1小時，pH為6～9的范圍。
(實(shí)施方式B-3)該實(shí)施方式是預(yù)處理用試劑的分解用FAOD和顯色用試劑的測定用FAOD使用相同F(xiàn)AOD的第3測定試劑盒的一例。但是，該實(shí)施方式與上述實(shí)施方式B-2不同，無需必須通過蛋白酶使預(yù)處理用試劑的分解用FAOD失活。由于酶具有底物特異性，通過蛋白酶與FAOD的組合，有時用蛋白酶難以使FAOD失活。這種情況下，本實(shí)施方式的測定試劑盒有效。再者，如果預(yù)處理用試劑中的分解用FAOD與糖化Hb分解物反應(yīng)，由于不能提高測定精度，所以，如下所示，調(diào)整預(yù)處理用試劑和顯色用試劑中的FAOD的添加比例變得重要。
作為上述FAOD，沒有特別限制，例如可以使用FAOD-α、FAOD-S、FAOD-αS之任一種。另外，本實(shí)施方式的測定試劑盒，只要沒有特別表示，就與上述實(shí)施方式B-1相同，另外，可以同樣地用于測定糖化Hb。
作為適應(yīng)于這種實(shí)施方式的FAOD與蛋白酶的組合，例如有商品名為FOD(旭化成公司生產(chǎn))及來自赤霉菌屬的FAOD(Arkray公司生產(chǎn)，特開平-154672號公報)、商品名為TrypsiN(Sigma公司生產(chǎn))及商品名為Proteinase K(和光純藥工業(yè)公司生產(chǎn))等。
上述分解用FAOD，即使其活性殘存，蛋白酶處理期間，需要在不作用于糖化Hb分解物的范圍內(nèi)添加，而且，由于利用易作用于糖化氨基酸、難作用于糖化蛋白質(zhì)的性質(zhì)，優(yōu)選只作用于糖化氨基酸程度的添加量。
具體地說，預(yù)處理用試劑中的分解用FAOD濃度，例如為10～20000U/L的范圍，優(yōu)選為20～10000U/L的范圍，更加優(yōu)選為100～5000U/L的范圍。顯色用試劑中的測定用FAOD濃度為0.5～200KU/L的范圍，優(yōu)選為1～100KU/L的范圍，更加優(yōu)選為2～100KU/L的范圍。
而且，例如，優(yōu)選添加上述預(yù)處理試劑，使預(yù)處理反應(yīng)液中分解用FAOD濃度達(dá)到10～5000U/L，血細(xì)胞濃度達(dá)到0.2～20體積％。
使用該測定試劑盒時，含有分解用FAOD的預(yù)處理用試劑進(jìn)行的處理，由于利用FAOD易作用于糖化氨基酸、難作用于糖化蛋白質(zhì)的性質(zhì)，例如，優(yōu)選只作用于糖化氨基酸程度的反應(yīng)時間。具體地說，優(yōu)選反應(yīng)溫度為20～37℃，反應(yīng)時間為1分鐘～60分鐘，更加優(yōu)選反應(yīng)溫度為25～37℃，反應(yīng)時間為2分鐘～30小時，特別優(yōu)選反應(yīng)溫度為30～37℃，反應(yīng)時間為3分鐘～10小時。
本實(shí)施方式中，例如，優(yōu)選添加上述預(yù)處理用試劑及顯色用試劑使顯色反應(yīng)溶液中的分解用FAOD(G)與測定用FAOD(H)的比例(活性比G∶H)達(dá)到G∶H＝1∶3～1∶100的范圍，更加優(yōu)選為G∶H＝1∶5～1∶50的范圍，特別優(yōu)選為G∶H＝1∶10～1∶40的范圍。如果這樣設(shè)定，與上述實(shí)施方式2不同，蛋白酶反應(yīng)溶液中殘存上述分解用FAOD，但是由于該殘存的FAOD的反應(yīng)速度非常慢，蛋白酶處理工序中，殘存FAOD作用于生成的糖化Hb分解物沒有達(dá)到影響測定的程度。
(實(shí)施方式B-4)該實(shí)施方式是作為顯色用試劑的顯色基質(zhì)，使用DA-64的例子。再者，本實(shí)施方式的測定試劑盒，只要沒有特別表示，就與上述實(shí)施方式B-1組成相同，另外，可以同樣地用于測定糖化Hb。
如上所述，為了提高測定靈敏度，蛋白酶試劑含有四唑鎓化合物和疊氮化鈉，顯色用試劑含有顯色基質(zhì)DA-64時，顯色反應(yīng)溶液中，由于上述四唑鎓化合物、疊氮化鈉及DA-64共存，如上所述，DA-64發(fā)生誤顯色。因此，為了防止該誤顯色，優(yōu)選設(shè)定以下組成。
優(yōu)選預(yù)處理用試劑、蛋白酶試劑及顯色用試劑中至少任一者含有表面活性劑。作為上述表面活性劑，例如可以使用上述表面活性劑。
使預(yù)處理用試劑中含有時，其濃度為0.03～200mmol/L的范圍，優(yōu)選為0.1～50mmol/L的范圍。使蛋白酶試劑中含有時，其濃度為0.01～50mmol/L的范圍，優(yōu)選為0.05～20mmol/L的范圍。使顯色用試劑中含有時，其濃度為0.06～30mol/L的范圍，優(yōu)選為0.1～20mol/L的范圍。
而且，為使顯色反應(yīng)溶液中的各成分達(dá)到以下的濃度范圍，可以添加測定試劑盒的各試劑。上述顯色反應(yīng)溶液中，例如，優(yōu)選DA-64為0.001～100mmol/L，表面活性劑為0.002～50mmol/L，四唑鎓化合物為0.1～10mmol/L，疊氮化鈉為0.08～4mmol/L的范圍，更加優(yōu)選DA-64為0.005～10mmol/L，表面活性劑為0.005～20mmol/L，四唑鎓化合物為0.6～5mmol/L，疊氮化鈉為0.15～1.8mmol/L的范圍，特別優(yōu)選DA-64為0.01～1mmol/L，表面活性劑為0.02～10mmol/L，四唑鎓化合物為0.7～2.7mmol/L，疊氮化鈉為0.2～1.5mmol/L的范圍。
另外，該顯色反應(yīng)溶液的pH優(yōu)選為6.0～9.0的范圍，更加優(yōu)選為6.5～8.5的范圍，特別優(yōu)選為7.0～8.0的范圍。
由于上述DA-64通過氧化還原反應(yīng)顯色，關(guān)于該反應(yīng)液，例如，如果用分光光度計(jì)測定檢測波長650～750nm范圍的吸光度(顯色程度)，可以測定過氧化氫的量。
實(shí)施例(實(shí)施例1)從患者采集全血試樣(患者數(shù)163名)，使紅細(xì)胞自然沉降回收。而且，向10μL該沉降的紅細(xì)胞部分中添加600μL下述預(yù)處理用試劑，配制溶血試樣(n＝163)。再者，該試樣由于使用使紅細(xì)胞自然沉降的部分，所以也含有血漿。
(預(yù)處理用試劑pH9.4)CHAPS 50mmol/L表面活性劑(商品名NIKKOL-BL9EX，9g/LNikko Chemical公司生產(chǎn))FAOD(商品名FAOX，Kikkoman公司生產(chǎn)) 1KU/L然后，將得到的20μL溶血試樣與76μL下述蛋白酶試劑混合，于37℃下保溫5分鐘。接著，再添加19μL下述顯色試劑，于37℃下保溫3分鐘，測定這時的波長751nm及波長571nm處的吸光度。測定吸光度使用自動分析裝置(商品名JCA-BM8、日本電子公司制造)。
(蛋白酶試劑pH5.5)四唑鎓化合物(商品名WST-3，同仁化學(xué)公司生產(chǎn)) 2mmol/LNaN30.6mmol/LNaCl100mmol/LCaCl22mmol/L中性蛋白酶(Arkray公司生產(chǎn)) 4MU/LMES 1mmol/L(顯色試劑pH7.0)商品名DA-64(和光純藥工業(yè)公司生產(chǎn)) 80μmol/LFAOD(Arkray株式會社生產(chǎn))36KU/LTris-HCl380mmol/LNaN30.5mmol/L而且，將測定的各吸光度代入預(yù)先作成的表示Hb濃度(g/L)或HbAlc濃度(g/L)與吸光度的關(guān)系的各校正曲線，求出HbAlc濃度及Hb濃度，根據(jù)下式算出HbAlc％。再者，Hb濃度可以由波長751nm處的吸光度求出，HbAlc濃度可以由波長571nm處的吸光度求出。
HbAlc(％)＝(HbAlc濃度/Hb濃度)×100再者，上述校正曲線通過下述方法作成。首先，關(guān)于Hb濃度為已知的各種濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，通過使用HbAlc測定裝置(商品名HA-8150Arkray公司制造)的HPLC法測定HbAlc濃度及Hb濃度。另一方面，關(guān)于上述各標(biāo)準(zhǔn)液，通過與上述實(shí)施例同樣的測定方法，測定與Hb濃度和HbAlc濃度相當(dāng)?shù)奈舛取６?，由上述自動測定儀得到的測定值和上述吸光度作成一次回歸式，將其作為校正曲線。
另外，作為對照例，將上述實(shí)施例1中配制的溶血試樣(n＝163)作為試樣，使用通過上述HPLC法測定的值。
以上結(jié)果如圖1所示。該圖是表示通過酶法測定的實(shí)施例1的HbAlc(％)與通過HPLC法的對照例HbAlc(％)的關(guān)系圖。該圖中，實(shí)施例的相關(guān)式為“y＝1.031x-0.09”，相關(guān)系數(shù)為“0.981”。
這樣，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，得到與對照例的值非常接近的值，由于其相關(guān)系數(shù)(0.981)也非常高，因此可知可以優(yōu)良的精度測定糖化Hb。
產(chǎn)業(yè)上的可利用性如上所述，本發(fā)明的糖化蛋白質(zhì)的測定方法及測定試劑盒，由于排除共存的糖化氨基酸的影響，測定精度優(yōu)良。因此，如果將本發(fā)明例如應(yīng)用于測定紅細(xì)胞中的糖化Hb、HbAlc，可以得到比以往可靠性高的測定值，所以，進(jìn)一步提高糖化Hb和HbAlc作為糖尿病診斷等的指標(biāo)物質(zhì)的重要性。
權(quán)利要求
1.糖化蛋白質(zhì)的測定方法，其通過使果糖基氨基酸氧化酶作用于試樣中的糖化蛋白質(zhì)，測定該氧化還原反應(yīng)來測定糖化蛋白質(zhì)的量，以除去上述試樣中與糖化蛋白質(zhì)分別存在的糖化氨基酸為目的，在上述氧化還原反應(yīng)之前，使上述糖化氨基酸在果糖基氨基酸氧化酶作用下分解，在四唑鎓化合物及疊氮化鈉存在下，進(jìn)行上述氧化還原反應(yīng)。
2.權(quán)利要求1所述的測定方法，其中糖化蛋白質(zhì)為糖化血紅蛋白。
3.權(quán)利要求1所述的測定方法，其中在果糖基氨基酸氧化酶作用于糖化氨基酸之前或作用之后，用蛋白酶分解糖化蛋白質(zhì)，使作用于上述糖化蛋白質(zhì)的果糖基氨基酸氧化酶作用于該分解物，進(jìn)行上述氧化還原反應(yīng)。
4.權(quán)利要求1所述的測定方法，其中上述氧化還原反應(yīng)的測定是使果糖基氨基酸氧化酶作用于糖化蛋白質(zhì)產(chǎn)生的過氧化氫與顯色基質(zhì)N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-雙(二甲氨基)二苯基胺鈉通過氧化還原酶反應(yīng)，通過測定上述顯色基質(zhì)的顯色量確定過氧化氫量的過氧化氫量的測定，在表面活性劑存在下，將上述顯色基質(zhì)添加到反應(yīng)溶液中，上述反應(yīng)溶液中的四唑鎓化合物的濃度為0.5～8mmol/L的范圍，疊氮化鈉的濃度為0.08～0.8mmol/L的范圍，表面活性劑濃度為0.3～10mmol/L的范圍，且上述反應(yīng)溶液的pH為7.0～8.5。
5.權(quán)利要求1所述的測定方法，其中作用于糖化氨基酸的果糖基氨基酸氧化酶特異性作用于糖化的α-氨基，作用于糖化蛋白質(zhì)的果糖基氨基酸氧化酶特異性作用于糖化的α-氨基及氨基酸殘基的糖化的側(cè)鏈氨基。
6.權(quán)利要求1所述的測定方法，其中將含有四唑鎓化合物和疊氮化鈉的溶液老化后添加到試樣中。
7.權(quán)利要求1所述的測定方法，其中四唑鎓化合物為2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓鹽。
8.血紅蛋白糖化率的測定方法，其由糖化血紅蛋白量和血紅蛋白量求出血紅蛋白糖化率，通過權(quán)利要求1所述的糖化蛋白質(zhì)的測定方法測定試樣中的糖化血紅蛋白量，另一方面，測定上述試樣中的血紅蛋白量，由上述糖化血紅蛋白量和上述血紅蛋白量求出血紅蛋白糖化率。
9.糖化蛋白質(zhì)的測定試劑盒，其用于利用氧化還原反應(yīng)測定糖化蛋白質(zhì)，其包括含有果糖基氨基酸氧化酶的試樣的預(yù)處理用試劑、含有果糖基氨基酸氧化酶、氧化還原酶及顯色基質(zhì)的顯色用試劑。
10.權(quán)利要求9所述的測定試劑盒，其中糖化蛋白質(zhì)為糖化血紅蛋白。
11.權(quán)利要求9所述的測定試劑盒，其中預(yù)處理用試劑的果糖基氨基酸氧化酶為特異性作用于糖化的α-氨基的酶，顯色用試劑的果糖基氨基酸氧化酶為特異性作用于糖化的α-氨基及氨基酸殘基側(cè)鏈的糖化的氨基的酶。
12.權(quán)利要求9所述的測定試劑盒，其進(jìn)一步包括含有蛋白酶的蛋白酶試劑。
13.權(quán)利要求12所述的測定試劑盒，其中蛋白酶為選自金屬蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、枯草桿菌蛋白酶及氨基肽酶的至少一種蛋白酶。
14.權(quán)利要求12所述的測定試劑盒，其中蛋白酶為選擇性分解糖化血紅蛋白的蛋白酶，為選自金屬蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、來自豬胰腺的胰蛋白酶及來自枯草桿菌(Bacillus Subtillis)的蛋白酶的至少一種蛋白酶。
15.權(quán)利要求12所述的測定試劑盒，其中蛋白酶試劑進(jìn)一步含有四唑鎓化合物和疊氮化鈉。
16.權(quán)利要求15所述的測定試劑盒，其中蛋白酶試劑中的四唑鎓化合物(A)和疊氮化鈉(B)的含有比例(摩爾比A∶B)為A∶B＝20∶3～20∶12的范圍。
17.權(quán)利要求12所述的測定試劑盒，其中蛋白酶試劑中，蛋白酶為金屬蛋白酶，進(jìn)一步含有Ca和Na，金屬蛋白酶濃度為100～40000U/L，Ca濃度為0.1～50mmol/L，Na濃度為5～1000mmol/L。
18.權(quán)利要求9所述的測定試劑盒，其中顯色基質(zhì)為N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-雙(二甲氨基)二苯基胺鈉。
19.權(quán)利要求9所述的測定試劑盒，其中預(yù)處理用試劑及顯色用試劑的至少之一進(jìn)一步含有表面活性劑。
20.權(quán)利要求12所述的測定試劑盒，其中蛋白酶試劑進(jìn)一步含有表面活性劑。
21.權(quán)利要求19或20所述的測定試劑盒，其中表面活性劑為選自聚氧乙烯醚、聚氧乙烯苯酚醚、聚氧乙烯失水山梨糖醇烷基酯及聚氧乙烯烷基醚的至少一種表面活性劑。
22.權(quán)利要求9所述的測定試劑盒，其中預(yù)處理用試劑進(jìn)一步含有選自CHES、MOPS、TAPS、EPPS、磷酸、HEPPSO、POPSO及硼酸的至少一種緩沖劑，其pH為8.0～10.0的范圍。
23.權(quán)利要求9所述的測定試劑盒，其中顯色用試劑進(jìn)一步含有選自MES、Tris、磷酸、MOPS、TES、HEPES、HEPPSO及EPPS的至少一種緩沖劑，其pH為6.0～9.0的范圍。
24.權(quán)利要求12所述的測定試劑盒，其中蛋白酶試劑進(jìn)一步含有選自Tris、MES、DIPSO、TES、POPSO、HEPES、MOPSO、Bis-Tris、MOPS、ADA、PIPES、ACES及磷酸的至少一種緩沖劑，其pH為5.0～7.0的范圍。
25.權(quán)利要求15所述的測定試劑盒，其中四唑鎓化合物為2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓鹽。
26.權(quán)利要求9所述的測定試劑盒，其中預(yù)處理用試劑進(jìn)一步含有尿酸酶及膽紅素氧化酶的至少之一。
27.權(quán)利要求9所述的測定試劑盒，其中顯色用試劑進(jìn)一步含有疊氮化鈉。
28.權(quán)利要求22所述的測定試劑盒，其中預(yù)處理用試劑中，果糖基氨基酸氧化酶為特異性作用于糖化的α-氨基的酶，其濃度為10～5000U/L的范圍，緩沖劑濃度為5～200mol/L的范圍，pH為8.0～10.0的范圍。
29.權(quán)利要求15所述的測定試劑盒，其中蛋白酶試劑進(jìn)一步含有Ca、Na及緩沖劑，蛋白酶為金屬蛋白酶，上述蛋白酶試劑中的金屬蛋白酶的濃度為100～10000KU/L的范圍，四唑鎓化合物濃度為0.1～10mmol/L的范圍，疊氮化鈉濃度為0.08～4mmol/L的范圍，Ca濃度為0.1～50mmol/L的范圍，Na濃度為5～1000mmol/L的范圍，緩沖劑濃度為0.1～500mol/L的范圍，pH為5.0～7.0的范圍。
30.權(quán)利要求23所述的測定試劑盒，其中顯色用試劑中，果糖基氨基酸氧化酶為特異性作用于糖化的α-氨基及糖化的氨基酸殘基側(cè)鏈的酶，氧化還原酶為過氧化物酶，顯色基質(zhì)為N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-雙(二甲氨基)二苯基胺鈉，上述顯色試劑中的果糖基氨基酸氧化酶的濃度為100～50000U/L的范圍，過氧化物酶濃度為0.1～400KU/L的范圍，N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-雙(二甲氨基)二苯基胺鈉濃度為0.02～2mmol/L的范圍，緩沖劑濃度為10～500mol/L的范圍，pH為6～9的范圍。
全文摘要
本發(fā)明提供利用氧化還原反應(yīng)的糖化蛋白質(zhì)的測定方法，其測定精度及測定靈敏度優(yōu)良。以除去試樣中與糖化蛋白質(zhì)分別存在的糖化氨基酸為目的，將糖化氨基酸預(yù)先在果糖基氨基酸氧化酶作用下分解，然后，在四唑鎓化合物及疊氮化鈉存在下，使果糖基氨基酸氧化酶作用于試樣中的糖化蛋白質(zhì)，通過測定此氧化還原反應(yīng)求出糖化蛋白質(zhì)量。作為糖化蛋白質(zhì)，優(yōu)選為糖化血紅蛋白。
文檔編號G01N33/68GK1625601SQ0380315
公開日2005年6月8日 申請日期2003年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月31日
發(fā)明者米原聰, 石丸香, 小森胤樹 申請人:愛科來株式會社