球花屬植物源提取物的新用途，以及通過離體植物培養(yǎng)獲得所述提取物的方法
【專利摘要】根據(jù)本發(fā)明，球花屬的植物源提取物用于皮膚和/或附器的非治療性化妝品處理。作為首選，物種是心葉球花，提取物通過離體植物培養(yǎng)獲得。提取物尤其能用于通過毒物刺激型響應來刺激解毒反應和細胞再生而預防和/或處理皮膚老化，有于改善面色的透明度和光亮度，用于預防或處理過敏性和反應性皮膚，用于預防或處理發(fā)紅，用于預防蛋白質(zhì)糖化，用于增加和/或維持皮膚干細胞的數(shù)量，用于增加和/或維持皮膚大分子，尤其是膠原蛋白和彈性蛋白，用于增大真皮的體積，用于預防和/或處理細線和皺紋，用于皮膚定形，用于預防脫發(fā)和/或刺激頭發(fā)再生。本發(fā)明也提出了通過球花屬未分化細胞的離體植物培養(yǎng)獲得提取物的原始方法，以及能通過此方法獲得的植物源提取物。
【專利說明】球花屬植物源提取物的新用途，以及通過離體植物培養(yǎng)獲得所述提取物的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明的主題是球花屬(Globularia)植物源提取物的新用途，以及通過離體(invitro)植物培養(yǎng)獲得所述提取物的首選方法。
[0002]本發(fā)明一般主要涉及化妝品工業(yè)；它生產(chǎn)和/或使用植物源提取物來預防并處理動物或人類哺乳動物的皮膚、頭皮、粘液和附器(比如頭發(fā)、睫毛、眉毛、指甲或毛發(fā))的紊舌L。
[0003]根據(jù)本發(fā)明，“植物源提取物”意思是從植物上直接獲得的、或者通過植物細胞或組織的培養(yǎng)而獲得的提取物。
【背景技術】
[0004]在化妝品中，有許多方式來改善皮膚、頭發(fā)和指甲的總體條件。這包括給予或恢復膚色、水合作用、著色或褪色；防止外部攻擊行為，比如UV輻射或寒冷、平靜刺激、發(fā)紅、痤瘡；減少微水腫(比如眼袋);減少黑眼圈，老化跡象，比如皺紋、細線、著色；恢復柔軟度和彈性；處理脫發(fā)；作用于脂肪組織；增加體積、密度；改善質(zhì)地等。長期以來，在全球各地，植物王國是一個豐富、并被廣泛使用的生物活性物質(zhì)來源，尤其是在制藥和化妝品領域。
[0005]球花屬種類屬于車前草科，Globularioideae亞科，由若干個物種組成，包括已知的那些品種:Globularia aIypum (南歐球花)，Globularia bisnagarica (植物名稱)，Globularia cordifolia (心葉球花)，Globularia nudicaulis (植物名稱)，Globulariavulgaris (球花屬尋常)，Globularia gracilis (植物名稱)，Globularia repens (球花屬掠)和Globularia valentina (球花屬瓦倫蒂娜)。
`[0006]它們是小型草本植物，單葉，互生，具有球頭形花朵，分布地從亞熱帶到溫帶地區(qū)。它們主要能在歐洲和北美找到。
[0007]EP0006059 發(fā)明了 一種提取 Globularia aIypum (南歐球花)和 Globulariavulgaris (球花屬尋常)的過程；其中，利用兩種極性不同的萃取溶劑來處理整個植物、莖、或葉子。由此過程獲得的提取物在人類和獸醫(yī)治療方面都有用，尤其在布魯氏桿菌病的治療當中。
[0008]特定的黃酮、類黃酮、環(huán)烯醚萜和苯酚化合物都已經(jīng)在球花屬中找到，尤其是在Globularia cordifolia (心葉球花)物種當中(參考文獻:“6_羥基木犀草素和野黃岑黃素作為高等植物中的種系標記”，在期刊“植物化學”中，第10卷，第2號，1971-02，p.367-378 ；“Globularifolin,來自心葉球花的一種新酸基環(huán)烯醚職苷”，Helvetica Chimica Acta,第63卷，第I號，1980-01-23，p.117-120 ;“來自心葉球花的酚類化合物”，Turk J Chem,M 28卷，2004，p.455-460以及“來自心葉球花的環(huán)烯醚萜和雙環(huán)烯醚萜糖苷”，生物科學期刊，第58c 卷，2003, p.337-341)。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0009]本發(fā)明的目的是，為始終需要新型活性成分的化妝品工業(yè)提供一種新的植物源提取物。
[0010]為此，本發(fā)明提出，使用球花屬的植物源提取物，用于皮膚和/或附器的非治療性化妝品處理。
[0011]皮膚會遭受許多外部應力:UV，電磁波，氧化劑，污染物，生物制劑等。在其它有害影響當中，這些應力包括或多或少慢性的微發(fā)炎現(xiàn)象，以及在表皮細胞中或者在它們的周圍有毒產(chǎn)物的形成。
[0012]在這些產(chǎn)物當中，有預發(fā)炎的介質(zhì)和一些生長因素；它們能造成與對外部刺激物反應過度相關的表皮神經(jīng)末梢的局部過度增濃。這導致皮膚針對這些刺激物的閾值下降。它變得非常敏感，產(chǎn)生不適感，而且在大多數(shù)時間都會伴隨短時發(fā)紅。
[0013]此外，皮膚逐步積累各種起源的碎屑，其組成有蛋白質(zhì)、碳水化合物及改變的脂質(zhì)。這些組分(羰基化的蛋白質(zhì)，脂質(zhì)過氧化物，脂褐素等)也將充當毒素；它們能干擾生理學和細胞的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，并改變脆弱的代謝平衡。
[0014]隨著時間的推移，它們改變線粒體呼吸、薄膜完整性、酶的活性、以及解毒機理，t匕如蛋白酶體。此類改變能導致某些細胞行為的變化，比如干細胞。實際上，后者處于一種具體環(huán)境；其中，改變可能導致削弱它們的特性和它們的原本表型(細胞尺寸變大，多層能力下降等)，使得它們保持其在角質(zhì)化細胞更新中的能力下降。
[0015]實驗數(shù)據(jù)顯示，早期接收的適度應力能延緩降級，從而延緩皮膚的老化，幫助身體在以后應對更加嚴重的應力(外部事件)。這種現(xiàn)象稱為毒物刺激作用。它基于作為對適度應力的響應、或者作為對據(jù)說具有毒物刺激效應的物質(zhì)(稱為毒物刺激劑的分子)的響應，解毒機理和細胞防御的激活。毒物刺激作用將有助于細胞、從而也就是身體對后續(xù)應力的更好適應，允許它更加有效地抵抗上面提到的有害影響。
[0016]這樣，從化妝品觀點出發(fā)，非常有趣的是，通過模擬毒物刺激作用來改善皮膚的生理學，允許它更好地抵抗將來的應`力，從而防止皮膚老化。
[0017]為了更好地理解這種毒物刺激效應，可以將它說成是一種抗老化疫苗。毒物刺激效應雖然顯示了它的長期效應(抗老化)，但是，通過降低皮膚對外部應力的敏感性、并通過給皮膚提供更多透明度和亮度(或光亮度)，它也將在短期內(nèi)快速改善皮膚條件。通過一系列試驗(下面具體描述)，針對球花屬提取物，已經(jīng)特別顯示了這一組原始的、和意想不到的性質(zhì)。
[0018]這樣，下面給出的詳細描述顯示，尤其利益于對皮膚毒物刺激防御的模擬，這種提取物具有完全意想不到的、在目標【技術領域】中原始的體內(nèi)(in vivo)性質(zhì)；包括提高皮膚透明度和皮膚反應，在皮膚的視覺質(zhì)量方面產(chǎn)生明顯影響:光亮度，清晰度，純度和顏色均勻性，光滑性等。
[0019]另外，本發(fā)明的球花屬提取物已經(jīng)顯示了在皮膚干細胞上的功效。
[0020]在毛囊的愈合、形態(tài)發(fā)生和發(fā)展過程中，都涉及到皮膚干細胞。其它性質(zhì)都與皮膚干細胞有關:它們是真皮層的前體，維持并形成一個細胞庫；這利益于它們區(qū)分成若干細胞類型的潛力。
[0021]增加的和維持的皮膚干細胞數(shù)量意味著真皮中更多處于良好狀態(tài)的成纖維細胞，從而有更多的大分子和纖維(膠原蛋白，彈性蛋白等)。能夠設想與真皮重新豐滿相關的所有化妝品應用；例如，皺紋和細線的處理，或者是穩(wěn)固性的處理。另一個應用是能夠增強的毛發(fā)再生和/或脫發(fā)預防，因為我們知道，完整毛囊的形成是通過真皮細胞誘導的。
[0022]下面給出的詳細活體外(in vitro)示例研究表明，本發(fā)明尤其適用于:
[0023]-通過模擬毒物刺激型響應的解毒反應和細胞再生，預防和/或處理皮膚老化；和/或
[0024]-改善面色的光亮度和/或透明度；和/或
[0025]-用于預防和/或處理過敏的、和/或反應性皮膚；和/或
[0026]-用于預防和/或處理發(fā)紅；和/或
[0027]-用于預防蛋白質(zhì)糖化；和/或
[0028]-用于增加和/或維持皮膚干細胞的數(shù)量；和/或
[0029]-用于增加和/或維持皮膚大分子，尤其是膠原蛋白和彈性蛋白；和/或
[0030]-用于增加真皮的體積(真皮的重新豐滿)；和/或
[0031]-用于預防和/或處理細線和皺紋；和/或
[0032]-用于固化皮膚；和/或
[0033]-用于預防脫發(fā)和/或刺激頭發(fā)再生。
[0034]其它使用也是可能的；例如，增白，增濕，減重，表皮體積增大，痤瘡，抗發(fā)炎等。尤其是化妝品中，能夠提供的應用示例范圍是:增濕劑，清潔劑，凈化，抗老化，抗氧化劑，保護劑，恢復劑(手，足，唇)，輪廓(面部，眼睛，頸部，唇)，補充皮膚護理和用于附器，包括睫毛、唇部產(chǎn)品、防陽產(chǎn)品、重新塑造、豐滿、整形、充脂(例如在手上、胸部、乳房)，毛發(fā)用產(chǎn)品等。
[0035]更明確地說，本發(fā)明指的是展示了特別感興趣結(jié)果的心葉球花物種。心葉球花(也
稱為heart leaf globe daisy-中文意思也是“心葉球花”)是在海拔高達2000m處生長
的小型山巖植物。它在-30° C的溫度下都能存活，在惡劣的白堊質(zhì)土壤中能茁壯成長。它來自歐洲和中亞的山區(qū)。
[0036]根據(jù)其它特點，本發(fā)明使用的提取物最好是通過離體植物培養(yǎng)來獲得，更加尤其是通過植物細胞培養(yǎng)，或者通過來自細胞基質(zhì)的組織培養(yǎng)、或來自不同植物器官的組織線。
[0037]本發(fā)明也涵蓋了從整個植物或其特定部位、更加首選的是從葉子中獲得的提取物的使用。
[0038]與農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)路徑相比(在露天土地中植物培養(yǎng)，隨后在工廠中萃取)，通過離體培養(yǎng)獲取植物源提取物具有許多優(yōu)點。獲得的提取物沒有毒性物質(zhì)(除草劑，農(nóng)藥，化肥，重金屬和其它污染物，比如可能來自植物寄生蟲的那些污染物)。另外，離體培養(yǎng)條件的嚴格控制能減少應變輪廓自發(fā)變異的風險，并保證對應于尋求利益分子的可再生的二次代謝物輪廓；這與露天土地種植不同。在那里，由于天氣和地理的原因，存在可變性的問題。還有，這種技術能克服其它障礙，比如植物的天然生物周期、以及二次代謝物生產(chǎn)的季節(jié)性，從而允許更好的安全性和快速供應能力。
[0039]此外，環(huán)境影響非常小，避免了耕地消耗與土壤污染。還有，由于只需要一株植物、甚至是一粒種子就能開始離體培養(yǎng)，所以生物多樣性得到保留。最后，這項技術提供了朝著生產(chǎn)有用分子的直接細胞新陳代謝(培養(yǎng)的激發(fā))的能力，而且能夠?qū)崿F(xiàn)一些受控的、相對快速的協(xié)議，以便使產(chǎn)率最大化。
`[0040]在離體植物培養(yǎng)領域的現(xiàn)有技術當中，下列技術能根據(jù)本發(fā)明使用:[0041]未分化細胞的培養(yǎng):這種方法涉及首先在瓊脂培養(yǎng)基中形成高度增殖的細胞株。這些株接著在液體培養(yǎng)基中生長，以便實質(zhì)性地增大生物體量。在生長周期和待定義并優(yōu)化的環(huán)境條件(針對合適的激發(fā)參數(shù)搜索)結(jié)束時，細胞生物體量將合成感興趣分子。然后，在最佳時間培養(yǎng)停止并提取，以獲得我們稱之為植物源的提取物，包含最多數(shù)量的感興趣分子。最初也可以使用已經(jīng)存在的原有的細胞株。
[0042]組織或器官的培養(yǎng):這類培養(yǎng)能關注根部分(“根培養(yǎng)”)或地上部分(“苗條培養(yǎng)”)。在這類方法中，有一些培養(yǎng)已經(jīng)通過基因組細菌發(fā)根土壤桿菌(根)或根癌土壤桿菌(莖)轉(zhuǎn)變而來。這樣轉(zhuǎn)變的根或苗條部分培養(yǎng)具有高生產(chǎn)速率，而且基因非常穩(wěn)定。在優(yōu)化激發(fā)參數(shù)之后，使用它們來合成感興趣分子。然后，通過常規(guī)方法提取這些分子。
[0043]通過無性繁殖的離體微體繁殖，尤其是體細胞胚胎發(fā)生:此技術的第一步是，選擇具有優(yōu)化特征(在有用代謝物的生長和生產(chǎn)方面)的親本植株。在胚胎發(fā)生中，下一步是從來自親本植株的外植體引入愈傷組織。這些未分化細胞能產(chǎn)生眾多體細胞胚；它能可能通過連續(xù)的培養(yǎng)周期而增多并擴大。從最有增殖和生產(chǎn)能力的植株，籽苗在合適的培養(yǎng)基中再生，并在針對有用代謝物最佳生產(chǎn)的合適時間提取。第二步是在合適的培養(yǎng)基中，引入來自親本植株外植體的帶葉子的莖；這利益于它的激素組成。在誘導根的生根階段之后，跟著多葉莖的放大階段。然后，可以大量再生小植物，以便在合適的培養(yǎng)基中種植它們，并提取感興趣分子。
[0044]根據(jù)未分化細胞植物培養(yǎng)的第一種技術，本發(fā)明擇優(yōu)地提供了一種制造方法。
[0045]尤其是，此方法屬于包括來自未分化植物細胞的植株的類型:
[0046]-一個預培養(yǎng)步驟，用于增大生物體量，
[0047]-在生物反應器中的一個培養(yǎng)步驟，包括增殖階段和之后的激發(fā)階段，以及
[0048]-所述提取物的回收步驟。
[0049]根據(jù)其它特點:
[0050]-預培養(yǎng)步驟包括完成增大體積的預培養(yǎng)，較小規(guī)格的每個預培養(yǎng);用于大量生成細胞的生物體量，以便接種較大規(guī)格的預培養(yǎng)。
[0051]-生物反應器中的后續(xù)培養(yǎng)步驟是在生物反應器中實現(xiàn)，利用在預培養(yǎng)步驟中生產(chǎn)的生物體量進行接種。在基礎培養(yǎng)基中的細胞增殖的初始階段后，將二次代謝物的激發(fā)培養(yǎng)基加到生物反應器中。當二次代謝物已經(jīng)達到所需的水平時，停止培養(yǎng)。更可取的是，為了達到這個水平，根據(jù)本發(fā)明，使用在蔗糖和常量營養(yǎng)素中缺乏的激發(fā)培養(yǎng)基。
[0052]-回收步驟(也稱為收獲步驟)包括該生物體量的提取階段；通過任何生理上可以接受的溶劑，或者這些溶劑的任何混合物。提取可以通過不同已知方法的組合來完成:加熱，浸潰，煎熬，注入，加壓，浸析，超聲波，微波，通過用任何化學或物理上合適的方法來溶解細胞。通過過濾或離心處理，能實現(xiàn)相位分離?；蛘?，也可以利用超臨界或亞臨界流體來提取生物體量。還有一種替代方法，即可以使用吸附樹脂、色譜法或液液分割實現(xiàn)提純。
[0053]根據(jù)首選的具體做法，細胞被溶解，目的是將細胞內(nèi)容轉(zhuǎn)移到水中。更加首選的是，根據(jù)本發(fā)明，溶菌是通過下降到酸性PH值來進行。在若干過濾后，獲得無菌提取物。然后，根據(jù)提取物的后續(xù)使用，方便地調(diào)節(jié)其PH值；例如，對于下面描述的化妝品應用，pH值調(diào)節(jié)到4。
[0054]根據(jù)本發(fā)明，細胞株可以是原有的株，或者是在預備步驟中創(chuàng)建的株，利用及時單獨執(zhí)行的所述步驟。
[0055]根據(jù)本發(fā)明，創(chuàng)建細胞株包括以下步驟:1)引入愈傷組織(未分化細胞的束);2)選擇最好的愈傷組織株；3)轉(zhuǎn)移到細胞懸浮物，優(yōu)化生長參數(shù)，并生產(chǎn)感興趣分子(例如，激發(fā))。
[0056]尤其是:
[0057]I)愈傷組織的引入能利用植物的所有部位來完成，包括:葉，果實，根，芽，種子，莖，枝，及分生組織，尤其是形成層；根據(jù)本發(fā)明，未分化細胞培養(yǎng)最好是利用植物的葉子來實現(xiàn)。
[0058]2)在液體培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)移之前，最佳株的選擇根據(jù)本發(fā)明執(zhí)行；尤其是包括下列準則:高增殖能力，溫柔和脆性結(jié)構，均勻的顏色，以及在液體培養(yǎng)基中的良好分散和這些參數(shù)的長期穩(wěn)定性。
[0059]3)對于選擇的株，通過在第一個步驟中選擇最合適的培養(yǎng)基來保證生物體量的快速生長、以及第二次在細胞指數(shù)生長期結(jié)束時允許二次代謝物合成的最大效率，在液體培養(yǎng)基中優(yōu)化二次代謝物生長和生產(chǎn)特征。這樣的第二階段對應于培養(yǎng)激發(fā)，能以熟練人員可用的諸多不同方式來實現(xiàn)。這些方式包括:給培養(yǎng)中添加微生物分數(shù)，給已知分子加壓、以指導細胞實現(xiàn)它們的二次新陳代謝，在培養(yǎng)中采用溫度或PH值、或滲透壓力的變化，環(huán)境貧化的使用，給培養(yǎng)基中增加吸附樹脂；除了激發(fā)以外，感興趣的化合物能捕捉它們。根據(jù)本發(fā)明，激發(fā)的首選方法是在常量元素和糖中使培養(yǎng)基枯竭。
[0060]因此，本發(fā)明的另一個目的是，獲取球花屬的植物源提取物的方法；尤其是實施根據(jù)本發(fā)明的離體植物培養(yǎng)的使用，包括來自未分化植物細胞的植株:
[0061]-預培養(yǎng)步驟，設計用于增大生物體量；
`[0062]-生物反應器中的培養(yǎng)步驟，包括激發(fā)階段后的增殖階段；以及
[0063]-所述提取物的回收步驟。
[0064]其中，生物反應器步驟中的激發(fā)階段利用蔗糖和常量營養(yǎng)素培養(yǎng)基中的不足來實現(xiàn)；而在所述提取物的具體回收步驟中，包括酸性PH細胞溶菌。
[0065]這樣就獲得了用于生產(chǎn)本發(fā)明中實施的植物源提取物的原始細胞株；這在研究領域中是原始的和活躍的，正如下面給出的功效試驗顯示，尤其是心葉球花的細胞株。
[0066]因此，本發(fā)明的另一個目的是能夠利用上文所述本發(fā)明中的方法獲得的提取物。
[0067]本發(fā)明還有一個目的是局部成分；包括球花屬提取物，首選的是心葉球花提取物，更加首選的是通過本發(fā)明上文披露的未分化植物細胞離體培養(yǎng)而獲得的心葉球花提取物。此類局部成分可能包括生理上可接受的培養(yǎng)基和附加活性物質(zhì)(這將在下文的草本制劑示例中提到)。局部成分可以用于化妝品應用或皮膚制藥應用。
[0068]本發(fā)明也涵蓋了用常規(guī)方法獲得的植物源提取物，例如通過整個植物或植物的特定部位的溶劑提取，通過超臨界流體、微波或超聲波；但是，比較結(jié)果表明，從細胞株獲得的提取物要遠優(yōu)于常規(guī)溶劑提取物。這些結(jié)果將在下文詳細描述。
[0069]實現(xiàn)本發(fā)明的球花屬提取物能在生理上可接受的培養(yǎng)基中以純凈或稀釋方式使用，構成賦形劑或胞間質(zhì)。
[0070]根據(jù)本發(fā)明的其它先進特點，球花屬提取物至少能與一個附加活性成分組合，目的是提供具有更加廣大性質(zhì)范圍的終端產(chǎn)品。例如，附加活性成分可以選自:增白劑，防發(fā)紅，UV防曬霜，增濕，潤濕劑，防脫落，抗老化，抗皺，減小體積，增大體積，改善彈性，防痤瘡，防發(fā)炎，抗氧化劑，抗自由基，去色，增色，脫毛劑，防生長或促進頭發(fā)生長，肽，維生素劑等。這些活性成分能從植物材料獲得，比如植物提取物、或植物培養(yǎng)或發(fā)酵的產(chǎn)品。
[0071]更加特別的是，在化妝品組分中，本發(fā)明的植物源提取物能組合至少一種化合物，它們可選自下列化合物:B3維生素化合物，比如煙酰胺和生育酚；類維生素A化合物，比如松香油，去氧苯經(jīng)妥，α -硫辛酸，白藜蘆醇或DHEA，肽，包括N-acetyl-Tyr-Arg-O-hexadecyl,Pal-VGVAPG (SEQ ID NO:1)，Pal-KTTKS (SEQ ID NO:2),Pal-GHK，Pal-KM02K和Pal-GQPR (SEQ ID NO:3);它們是在局部化妝品或皮膚制藥組分中使用的常規(guī)活性成分。
[0072]為了更好地理解本發(fā)明，我們給出下面的描述。
[0073]下列示例展示的本發(fā)明并不意味著將它限制在僅有的那些應用。
【具體實施方式】
[0074]組分制備
[0075]根據(jù)本發(fā)明，表達術語“生理上可接受的培養(yǎng)基”意思是，但不限于，水性或水-醇溶液，水在油中乳化液，油在水中乳化液，微乳化液，水性凝膠，無水凝膠，漿液，泡囊或粉末的分散液。
[0076]“生理上可以接受”意思是，組分適合于局部使用，可以接觸哺乳動物、尤其是人類的粘膜、指甲、頭皮、毛發(fā)、頭發(fā)和皮膚，不存在毒性、不兼容性、不穩(wěn)定性、過敏反應等等其它方面的風險。
`[0077]“生理上可接受的培養(yǎng)基”構成了我們常說的組分的賦形劑。
[0078]本發(fā)明提到的植物源提取物的有效數(shù)量、也可說是它的劑量，取決于很多因素；匕匕如患者的年齡、狀態(tài)、疾病的嚴重程度、或管理的條件和模式。有效數(shù)量指的是足以實現(xiàn)所需效果的沒有毒性的數(shù)量。
[0079]在本發(fā)明的化妝品組分中，以有效數(shù)量存在的球花屬提取物一般采用的數(shù)量范圍是從組分總重的0.000001%到15%，更加首選的是在0.0001%到10%之間，取決于組分的運用目的地和希望更加明顯或不太明顯的效果。
[0080]此處使用的所有百分比和比例都指的是與總組分的重量比；所有測量都是在25。C時進行，除非另外注明。
[0081]組分中賦形劑的選擇是根據(jù)球花屬活性提取物的約束條件(穩(wěn)定性，溶解性等)；而且，如果必要，還根據(jù)組分中打算進一步運用的劑型。
[0082]本發(fā)明的球花屬提取物可以采用水性溶液的方式組合到組分中；或者通過常規(guī)生理上可接受的助溶劑溶解，例如(但并不限于)這個清單:乙醇，丙醇，異丙醇，丙二醇，丙三醇，丁二醇，或聚乙二醇；或者是它們的任意組合。用乳化劑溶解提取物它也可能是有趣的。也能使用粉末培養(yǎng)基。
[0083]本發(fā)明的組分通?？赏ㄟ^常規(guī)方法來制備；在制造局部和口服組分及注射組分領域熟練的人員都知道這些方法。此方法可能涉及在一個或多個步驟中配料的混合物，以獲得均勻狀態(tài)，可以利用、也可以不用加熱、冷卻等。
[0084]可以包含本發(fā)明球花屬提取物的不同草本制劑形態(tài)是指下面的一切形態(tài):即，面霜，乳液，奶或霜膏，凝膠，乳化液，分散液，溶液，懸浮液，清潔劑，襯底，無水制劑(棒，尤其是唇膏，身體和洗浴油)，淋浴和泡澡凝膠，洗發(fā)水和頭發(fā)護理液，用于皮膚護理或頭的奶或霜膏，凈化洗液或奶液，防曬洗液，奶或霜膏，人工曬黑洗液，奶或霜膏，剃須前、中或后霜劑，泡沫，凝膠或洗液，化妝品，唇膏，染睫毛油或指甲拋光，皮膚香精，漿液，粘結(jié)或吸附材料，透皮貼劑，或軟化劑粉末，洗液，奶或霜膏，噴劑，身體和洗浴油，襯底基礎，軟膏，乳化液，膠質(zhì)，壓實懸浮液或固體，鉛筆，可噴涂配方，可刷物，刷子，紅顏料，描眼膏，描唇膏，潤唇膏，面或身體粉末，定形凝膠或摩絲，指甲調(diào)節(jié)，唇膏，皮膚調(diào)節(jié)器，增濕劑，清漆，肥皂，去角質(zhì)劑，收斂劑，脫毛劑，永久成波浪溶液，防頭屑配方，止汗或防排汗組分，包括棒，“卷起的”除臭劑，空氣清新劑，鼻子噴劑等。
[0085]這些組分也可以采用唇膏的形式，意圖是給嘴唇上色、或防止它們皸裂；或者是用于眼睛、眼影的化妝品，以及面部的襯底。本發(fā)明的組分能包括化妝品，個人護理產(chǎn)品和制藥制劑。也能考慮采用泡沫形式的組分，或者采用氣凝膠組分，也包括加壓的推進劑。
[0086]本發(fā)明的提取物也可以采用下列形式:溶液，分散液，乳化液，膏，或粉末，單獨或作為預混或賦形的，在媒介物中單獨或作為預混，比如宏_、微-或毫微囊劑，宏_、微-或納米級囊劑、脂質(zhì)體、油質(zhì)體或乳糜微粒，宏-、微-或納米級顆粒，或宏-、微-或納米級海綿、孢子或外膜，微或納米級乳化液、或吸附在有機聚合物粉末、滑石、膨潤土、或其它無機或有機載體上。
[0087]本發(fā)明的球花屬提取物可以采用任何形式使用；采用的形式可以是粘到或組合進或吸附到下列物質(zhì)其中或上面:宏_、微-和納米顆粒，或者宏_、微-和鈉米-膠囊，用于處理織物、天然或合成纖維、木材、以及可以用于打算與皮膚接觸的日用或夜用衣服或內(nèi)衣的任何材料，手帕或布子，用于通過這種皮膚/織物接觸來施加它們的化妝品效果，并允許持續(xù)的局部輸出。
[0088]附加配料
[0089]《CTFA國際化妝品配料詞典和手冊(第13次修訂，2010年)》(出版商Cosmetic，Toiletry, and Fragrance Associa`tion, Inc., Washington, D.C.)描述了倉泛在本發(fā)明白勺組分中作為附加配料/化合物使用的、皮膚護理行業(yè)中常用的無限廣泛的化妝品和制藥配料。這些配料類別的示例包括，但不限于:愈合劑，皮膚抗老化劑，抗皺劑，抗萎縮劑，皮膚增濕劑，皮膚平滑劑，抗菌劑，抗寄生蟲劑，抗真菌劑，殺真菌劑，真菌靜態(tài)劑，殺菌劑，抑菌劑，抗微生物劑，消炎劑，止癢劑，麻醉劑，抗病毒藥物，角質(zhì)層分離劑，自由基清除劑，反皮脂溢齊?，去頭屑劑，調(diào)節(jié)皮膚變異、繁殖或著色的試劑，滲透加速劑，脫鱗片劑，黑色素合成刺激或抑制劑，增白、去色或發(fā)光劑，前著爭劑，自行曬褐劑，NO-合酶抑制劑，抗氧化劑，自由基清除劑和/或防大氣污染劑，活性羰基物種清除劑，抗糖化劑，收緊劑，刺激真皮或表皮大分子合成和/或能夠抑制或預防它們降級的試劑，比如膠原蛋白合成刺激劑，彈性蛋白合成刺激劑，核心蛋白聚糖合成刺激劑，層粘連蛋白合成刺激劑，防衛(wèi)蛋白合成刺激劑，伴護合成刺激劑，水通道蛋白合成刺激劑，透明質(zhì)酸合成刺激劑，粘連蛋白合成刺激劑，去乙?；负铣纱碳?，角質(zhì)層(神經(jīng)酰胺、脂肪酸等)脂類和組分合成的刺激劑，膠原蛋白降級抑制劑，彈性蛋白降級抑制劑，成纖維細胞增殖，角質(zhì)化細胞增殖刺激劑，脂肪細胞增殖刺激劑，黑素細胞增殖刺激劑，角質(zhì)化細胞變異刺激劑，脂肪細胞變異刺激劑，乙酰膽堿酯酶抑制劑，葡糖胺聚糖合成刺激劑，DNA修復劑，DNA保護劑，抗癢劑，過敏皮膚處理和/或護理劑，固化劑，防妊娠紋劑，收斂劑，皮脂生產(chǎn)調(diào)節(jié)劑，皮膚松馳劑，愈合輔助劑，表皮再植刺激劑，表皮再植聯(lián)合輔助劑，細胞因子生長素，鎮(zhèn)靜劑，消炎劑，毛細管循環(huán)和/或微循環(huán)作用劑，血管形成刺激劑，血管滲透性抑制劑，細胞新陳代謝作用劑，真皮-表皮接合改善劑，生發(fā)誘導劑，毛發(fā)生長抑制或阻燃劑，肌肉松馳劑，抗污染和/或抗自由基劑，脂解刺激劑，減肥劑，抗臀腿脂肪劑，微循環(huán)使用劑，細胞能量新陳代謝作用劑，清潔劑，頭發(fā)調(diào)節(jié)劑，頭發(fā)定形劑，頭發(fā)生長促進劑，防曬霜劑，完全防曬劑，化妝劑，去污劑，制藥產(chǎn)品，乳化劑，軟化劑，有機溶劑，防腐劑，除臭劑活性成分，生理上可接受的載體，表面活性劑，粘結(jié)劑，吸附齊?，美學組分，比如香料、顏料、染料、著色劑、天然著色劑、香料油，觸摸劑，化妝品收斂劑，抗痤瘡劑，抗凝結(jié)劑，消泡劑，抗氧化劑，粘結(jié)料，生物添加劑，酶，酶抑制劑，酶誘導劑，輔酶，螯合劑，植物提取物，植物衍生品，香料油，海洋提取物，從生物發(fā)酵或生物技術過程獲得的制劑，礦物鹽，細胞提取物，防曬霜(防紫外A和/或B射線的有機或礦物光保護劑活性成分)，神經(jīng)酰胺，肽，緩沖劑，增容劑，螯合劑，化學添加劑，著色劑，化妝品殺生物劑，變性劑，醫(yī)用收斂劑，外部鎮(zhèn)痛劑，成膜劑，比如聚合物、用于加強組分的成膜性質(zhì)和直染性，第四紀衍生品，親和力增加劑，乳濁劑，PH值調(diào)節(jié)劑(例如三乙醇胺)，推進劑，還原劑，螯合劑，褪色和/或增亮劑，皮膚調(diào)節(jié)劑(例如，潤濕劑，包括混雜物和閉合劑)，保濕劑，α羥基酸，β羥基酸，增濕劑，表皮水解酶，愈合和/或鎮(zhèn)靜劑，皮膚處理劑，抗皺劑，減少或處理眼袋的制劑，脫落劑，增稠劑，軟化劑，凝膠化聚合物，維生素及它們的衍生物，濕潤劑，剝皮劑，安慰劑，皮膚固化劑，木酚素，防腐劑(例如苯氧乙醇和對羥基苯甲酸脂類)，抗UV劑，細胞毒素劑，抗贅生物劑，粘度改良劑，不揮發(fā)溶劑，珠光劑，抗排汗劑，脫毛劑，疫苗，香水，皮膚重組劑(例如，豨薟草提取物)，賦形劑，裝料，礦物質(zhì)，抗真菌劑，抗過敏劑，Hl或Η2抗組胺藥，抗刺激劑，免疫系統(tǒng)刺激劑，免疫系統(tǒng)抑制劑，驅(qū)昆蟲劑，潤滑劑，顏料或染料，定影劑，防腐劑，光穩(wěn)定劑，以及它們的混合物，只要它們以物理或化學方式與組分的其它配料、尤其是本發(fā)明的活性成分兼容。
[0090]另外，這些附加配料的性質(zhì)不應該改變本發(fā)明活性成分的好處達到不可接受的地步。這些附加配料可以是合成的或天然的，比如植物提取物，或者來自生物發(fā)酵過程。附加示例能在《CTFA化妝品配料手冊`》中找到。
[0091]此類附加活性成分/化合物能夠從下面的組中選擇:糖胺，氨基葡萄糖，D-氨基葡萄糖，N-乙酰基氨基葡萄糖，N-乙?；?D-氨基葡萄糖，甘露糖胺，N-乙酰基甘露糖胺，氨基半乳糖，N-乙?；被肴樘?，Β3維生素及其衍生物，煙酰胺，去氫醋酸鈉，去氫醋酸及其鹽，植物留醇，水楊酸化合物，去氧苯經(jīng)妥，二烷?；u基脯氨酸化合物，大豆提取物和衍生物，牛尿酚，異黃酮，黃酮類似物，植烷三醇,法呢醇,香茅醇,沒藥醇,肽和它們的衍生物，二 _、三_、四_、五-和六肽及它們的衍生物，KTTKS (SEQ標識號:4)，PalKTTKS (SEQ標識號:2)，肌肽，N-?；被峄衔?，類維生素Α，視黃基丙酸，松香油，棕櫚酸視黃酯，視黃醇乙酸酯，視黃醛，視黃酸，水溶性維生素，抗壞血酸，維生素C，抗壞血酸基葡糖甙，抗壞血酸基軟脂酸鹽，鎂抗壞血酸基磷酸鹽,鈉抗壞血酸基磷酸鹽,維生素B和它們的衍生物，BI維生素，Β2維生素，Β6維生素，Β12維生素，K維生素和衍生物，泛酸及其衍生物，泛酸醇乙基醚，泛酰醇和衍生物，泛醇，生物素，氨基酸和它們的鹽及衍生物，水溶性氨基酸，天冬酰胺，丙氨酸，吲哚，谷氨酸，水不溶的維生素，A維生素，E維生素，維生素F，D維生素和單_、雙-和三-類萜化合物，β -亞諾抗氧化劑，雪松醇和它們的衍生物，水不溶的氨基酸，酪氨酸，色胺，顆粒材料，二叔丁對甲酚，叔丁對甲氧酚，尿囊素，生育酚煙酸鹽，生育酚，生育酚酯，pal-GHK (三勝肽)，植物留醇，羥酸，羥基乙酸，乳酸，乳糖酸，酮酸，丙酮酸，植酸，溶血磷脂酸，二苯乙烯，肉桂酸鹽，白藜蘆醇，呋喃甲基腺嘌呤，玉米素，二甲基氨基乙醇，天然肽，大豆肽，糖酸的鹽類，Mn葡糖酸鹽，Zn葡糖酸鹽，吡啶酮乙醇胺鹽，3，4，4’ -三氯二苯脲，三氯二苯脲，Zn羥基吡啶硫酮，對苯二酚，曲酸，抗壞血酸，鎂抗壞血酸基磷酸鹽，抗壞血酸基葡糖甙，吡哆醇，蘆薈，萜烯醇類，尿囊素，沒藥醇，甘草酸二鉀，甘油酸，山梨醇酸，季戊四醇酸，吡咯烷酮酸和鹽，二羥基丙酮，赤蘚酮糖，甘油醛，酒石醛，丁香油，薄荷醇，樟腦，桉葉油，丁香酚，薄荷基乳酸，金縷梅精華，二十烯和乙烯基吡咯烷酮共聚物，碘丙基丁基氨基甲酸酯，多糖，基本脂肪酸，水楊酸鹽，甘草次酸，類胡蘿卜素，神經(jīng)酰胺和假-神經(jīng)酰胺，類脂絡合物，一般處于天然來源狀態(tài)的油品，比如牛油脂、杏仁油、野驢油、李油、棕櫚油、依菁萃油，對苯二酚，HEPES，丙半胱氨酸，O-辛酰基-6-D-麥芽糖，甲基甘氨酸二醋酸的二鈉鹽，類固醇，比如薯蕷皂苷配基和DHEA的衍生物，DHEA或脫氫表雄甾酮和/或它們的前體或化學或生物衍生物，N-乙氧其羰基-4-對-氨基苯酚，藍莓提取物，植物激素，酵母、“酵母菌屬”酵母，藻類的提取物，大豆、羽扇豆、玉米和/或豌豆、阿爾維林及其鹽類的提取物，尤其是檸檬酸阿爾維林，屠夫掃帚和馬栗樹的提取物，以及它們的混合物，金屬蛋白酶抑制劑。
[0092]具體有用的更多皮膚護理和頭發(fā)護理活性成分能在SEDERMA商業(yè)文獻中找到，也請登錄網(wǎng)站:www.sederma.fr.。
[0093]也會提及下列商業(yè)活性物質(zhì)，例如:甜菜堿，甘油，Actimoist Bio2? (活性有機物)，AquaCacteen?(Mibelle AG 化妝品)，Aquaphy line? (Si lab), AquaregulK?( So labia),CarciIine?(Greentech),Codiavelane?(Biotech Marine),Dermaflux?(Arch Chemicals,Inc), Hydra' Flow? (Sochibo), Hydromoist L? (Symrise), RenovHyal? (Soliance),Seamoss? (Biotech Marine),Essenskin? (Sederma),Moist24? (Sederma),Argireline?(Lipotec公司乙?；?3的商品名)，以名稱Gatuline Expression?著名的千日菊酰胺或 Acmella oleracea (金鈕扣)的提取物，以名稱 Boswellin? 著名的 Boswellia serrata(鮑達乳香蟹)的提取物，Deepaline PVB? (Seppic), Syn-AKE? (Pentapharm), Ameliox?,Bioxilift? (Silab), Juvinity? (Sederma), Revidrat? (Sederma),或它們的混合物。(譯注:本段中，帶TM標記的是商品名稱，后面括號中是其生產(chǎn)商名稱。)`[0094]在能夠與本發(fā)明提取物組合的其它植物提取物當中，尤其可以有提到的常青藤提取物，尤其是英國常青藤(常春藤)，下列物質(zhì)的提取物:柴胡黃連，銀柴胡，山金車(ArnicaMontana L,譯注:括號中內(nèi)容與前面名稱相同),迷迭香(Rosmarinus officinalis N),金蓋花(Calendula officinalis),鼠尾草(Salvia officinalis L)，人參(Panax ginseng),銀杏亨，圣約翰麥芽汁(Hyperycum Perforatum),屠夫掃帚(Ruscus aculeatus L),歐洲繡線菊屬植物(Filipendula ulmaria L),大花 Jarva 茶(Orthosiphon Stamincus Benth),藻類(Fucus Vesiculosus),樣樹(Betula alba),綠茶，可樂豆(Cola Nipida),馬栗樹,竹子，積雪草，石南屬植物，墨角藻，柳樹，鼠耳草，七葉樹，倉術，黃金洋甘菊，Armeniacea屬的植物，Atractylodis Platicodon, Sinnomenum,牽牛子，千斤拔屬，薄荷科植物，比如C.Forskohlii,C.blumei,C.esquirolii,C.scutellaroides, C.xanthantus 和 C, Barbatus(髯毛屬)，比如髯毛鞘蕊花的根提取物，Ballote的提取物，Guioa, Davallia (骨碎補屬)，Terminalia (攬仁樹屬)，Barringtonia (玉蕊屬)，Trema (山黃麻屬)，antirobia, cecropia(蟻棲樹屬)，argania(樹葉多酹),dioscoreae(薯菌屬)，比如山藥或墨西哥菜,Ammi visnaga(阿米芳O的提取物，Siegesbeckia (豨薟屬),尤其是豨薟草,Ericaceae (杜醇花科)的植物提取物，尤其是歐洲越桔提取物(Vaccinium angustifollium)或 Arctostaphylos uva ursi(熊果)，aloe vera (蘆薈)，含甾醇類的植物(例如，植物甾醇)，Manjistha (從茜草屬植物中提取的，尤其是紅根)，以及Guggal (從沒藥屬植物中提取的，尤其是穆庫爾沒藥)，柯拉子提取物，白花春黃菊，紅三葉草提取物，卡瓦胡椒提取物(Kava Kava?，來自SEDERMA)，Bacopamonieri (假馬齒莧)提取物(Bacocalmine?，來自SEDERMA)和海鞭提取物，提取物來自光果甘草，桑葚，白千層屬灌木(茶樹)，極叉開拉瑞阿，冬凌草，纖細裸藻，F(xiàn)ibraurea recisaHirudinea,叢林高粱，向日葵提取物,綠花恩南蕃爺，Spermacocea屬的Mitracarpe, Buchubarosma (南非香木布枯)，散沫花,Adiantium Capillus-Veneris L.,白屈萊，絲瓜，日本桔(Citrus reticulata Blanco var.unshiu),茶樹植物，白茅,黃花海S粟,地中海柏木,多花黃精，羅鍋底，歐洲接骨木，種豆科，百金花屬，巨藻，透納樹葉，知母，毛馬齒莧，啤酒花藤，咖啡樹或Ilex Paraguariensis (巴拉圭茶)。本發(fā)明的組分可能包括肽，包括、但不限于，二 -、三-、四-、五-和六-肽及它們的衍生物。根據(jù)具體體現(xiàn)，組分中附加肽的濃度范圍是1x10、到20%，最好是lxl(T6%到10%，特別首選的是1χ10-5%到5%重量比。
[0095]根據(jù)本發(fā)明，術語“肽”指的是含10氨基酸或以下的肽，它們的衍生物，異構體和與其它物種的絡合物，比如金屬離子(例如，銅、鋅、錳、鎂和其他)。術語“肽”同時包括天然肽和合成肽。它也指在自然界能發(fā)現(xiàn)的、和/或通過商業(yè)途徑可獲得的含肽組分。
[0096]此處使用的合適的二肽包括、但不限于:肌肽(β -AH), YR, Vff, NF, DF, KT, KC, CK,KP, KK或ΤΤ。此處使用的合適的三肽包括、但不限于:RKR，HGG, GHK, GKH, GGH, GHG, KFK,GKH, KPK, KMOK, KM02K或KAvaK。此處使用的合適的四肽包括、但不限于:RSRK (SEQ標識號:5)，GQPR (SEQ標識號:6)或KTFK (SEQ標識號:7)。合適的五肽包括，但不限于=KTTKS(SEQ標識號:4)。合適的六 肽包括，但不限于:GKTTKS (SEQ標識號:8)，VGVAPG (SEQ標識號:9)。
[0097]此處使用的其它合適的肽包括，但不限于:肽的親脂性衍生物，首選棕櫚酰衍生物，以及前面提到的金屬絡合物(例如，三肽HGG的銅鉻合物)。首選的二肽衍生物包括N-棕桐酸 _ β -Ala-His, N-乙酸基-Tyr-Arg-己癸稀酷(CALM0SENSINE?,來自 Sederma 公司)。首選的三肽衍生物包括N-棕櫚酰-Gly-Lys-His，(Pal_GKH，來自Sederma)，HGG的銅衍生物(Lamin?，來自 Sigma)，Lipospondin (Ν-Elaidoyl-KFK)及其存性置換的類似物，N-乙?；?RKR-NH2 (肽 CK+)，N-Biot-GHK (來自 Sederma)，Pal-KMO2K (Sederma)和它們的衍生物。根據(jù)本發(fā)明使用的合適的四肽衍生物包括，但不限于，N-棕櫚酰-GQPR (SEQ標識號:3)(來自Sederma)。此處使用的合適的五肽衍生物包括,但不限于，N-棕櫚酰-KTTKS(SEQ標識號:2)(可作為胞間質(zhì)YL?獲得，來自Sederma)，具有X Met或Leu的N-棕櫚酰-Tyr-Gly-Gly-Phe-X (SEQ標識號:10)，或它們的混合物。此處使用的合適的六肽衍生物包括，但不限于，N-棕櫚酰-VGVAPG(SEQ標識號:1)及它們的衍生物。也能涉及Pal-GHK和 Pal-GQPR (SEQ 標識號:3) (Matrixyl?3000, Sederma)的混合物。
[0098]商業(yè)上可獲得的含三肽或衍生物的首選組分包括生物肽-CL?，Maxilip?,BiobustyI?和MATRIXYL?，synthe’ 6? (生產(chǎn)商為Sederma)。商業(yè)上可獲得的四肽首選來源的組分包括 RIGIN?，EYELISS?, MATRIXYL?RELOADED 和 MATRIXYL3000? ;它們含有 50 至Ij500ppm的棕櫚酰-GQPR (SEQ標識號:3)和載體，這是由Sederma公司提出的。
[0099]能夠涉及下列市場上銷售的肽，以及附加活性成分:Vial0X?，Syn-ake?或Syn-Col1?(Pentapharm),Hydroxyprolisilane CN?(ExsymoI),ArgireIine?,LeuphasyI?,Aldenine?, Trylgen?, Eyeseryl?, Serilesine? 或 Decorinyl? (Lipotec), Collaxyl?或 Quintescine? (Vincience), BONT-L-妝 ? (lnfinitec Activos), Cytokinol?LS(Laboratoires Serobio1giques/Cognis),Kollaren?,IP2000? 或 Meliprene?(lnstitutEuropeen de Biologie Cellulaire),Neutrazen?(Innovations),ECM-Protect? (AtriumInnovations), Timp-妝 ? 或 ECM Moduline? (lnfinitec Activos)。(譯注:本段中，帶 TM標記的是商品名稱，后面括號中是其生產(chǎn)商名稱。)
[0100]化妝品處理方法
[0101]本發(fā)明也涉及化妝品處理方法，其目的是改善皮膚的整體條件；包括在皮膚和/或附器上局部應用有效數(shù)量的上文提到的球花屬提取物。
[0102]本發(fā)明的球花屬提取物可以局部運用于下列區(qū)域:臉、嘴唇、脖子、頸線、手、腳或身體。本發(fā)明的主要優(yōu)點之一表現(xiàn)在這樣的能力:無論何時必要時或希望時，能夠通過這種局部的、非侵略性方法施加局部選擇性的“輕柔”處理。對于防皺運用，例如，它可以使用注射器或微套管非常局部地運用。
[0103]不過，也可以考慮將含有本發(fā)明提取物的組分實施皮下注射。
[0104]根據(jù)其它具體特點，根據(jù)本發(fā)明的化妝品處理方法能夠組合一種或多種以皮膚為目標的處理方法，比如照射治療、加熱或芳香療法處理。
[0105]根據(jù)本發(fā)明，可以提出具有若干隔間或套件的裝置來運用上面描述的方法；它們可以包括，例如，但不限于，第一個隔間中放置含有球花屬提取物的組分，第二個隔間中放置含另一種活性成分和/或賦 形劑的組分。在此情況下，裝在所述第一和第二個隔間中的組分可以考慮成是組合組分；供及時同步、單獨或分階段使用，尤其是在上面提到的處理方法之一中。
[0106]本發(fā)明的處理方法尤其適用于，通過刺激解毒反應和/或通過毒物刺激類響應的細胞再生、防止和/或處理皮膚老化，尤其是用于改善皮膚的光亮度和/或透明度，用于預防和/或處理過敏和/或反應性皮膚，用于預防和/或處理發(fā)紅和/或預防蛋白質(zhì)的糖化。
[0107]本發(fā)明的處理方法也特別適用于增加和/或維持皮膚干細胞的數(shù)量，和/或增加和/或維持表皮大分子，尤其是膠原蛋白和彈性蛋白，和/或從而用于增大真皮的體積(重新豐滿)，和/或用于預防和/或處理細線和皺紋，和/或用于讓皮膚定形，和/或用于預防脫發(fā)和/或刺激頭發(fā)再生。
[0108]A)通過心葉球花的未分化細胞培養(yǎng)，獲得本發(fā)明植物源提取物的示例
[0109]I)細朐株的創(chuàng)律
[0110]心葉球花植物是從種子獲得的。
[0111]收集葉子，隨后清理和用水漂洗，去除污染，再次漂洗。
[0112]a)引入未分化細胞或愈傷組織的步驟
[0113]葉片被切割，放在營養(yǎng)瓊脂的表面；它含有可同化的碳源，微量和常量元素的溶液，以及適應的荷爾蒙與維生素的組合。利益于它的組分，這種營養(yǎng)培養(yǎng)基將在葉子的愈合部位上觸發(fā)未分化細胞束的生產(chǎn)，我們稱之為愈傷組織。[0114]使用的固體營養(yǎng)培養(yǎng)基的組分(根據(jù)Gamborg):常量元素和微量元素、蔗糖、瓊脂植物、植物激素和維生素的溶液。
[0115]DH倌調(diào)節(jié)到5, 5和6之間。
[0116]以后，這個培養(yǎng)基將被稱為“基本培養(yǎng)基”。這個引入步驟持續(xù)I到4個月。培養(yǎng)在25° C的黑暗條件下進行。
[0117]b)瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)物的穩(wěn)定化和選擇步驟。
[0118]每隔3個星期，在新鮮培養(yǎng)基上進行了后續(xù)移植后，獲得愈傷組織穩(wěn)定化。利益于它們的表型特征(顏色，易碎性，增殖)，從而獲得穩(wěn)定并均勻的培養(yǎng)物。
[0119]從早期開始的數(shù)十個當中，選擇最好的愈傷組織培養(yǎng)物用于液體培養(yǎng)基中的轉(zhuǎn)移。選擇的系的特征是:高生長率，柔軟和易碎的質(zhì)地，均勻的顏色，在液體培養(yǎng)基中的良好分散性，以及這些參數(shù)在傳代培養(yǎng)期間的穩(wěn)定性。
[0120]這個步驟持續(xù)6個月到I年。
[0121]c)液體培養(yǎng)基中的轉(zhuǎn)移和二次代謝物生產(chǎn)的優(yōu)化
[0122]選擇的系在液體培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)移，目的是在初始階段優(yōu)化它們的生長參數(shù)。
[0123]通過定期測量培養(yǎng)細胞占據(jù)的體積百分比、也稱為“細胞壓積”(PCV)，評價不同階段(潛伏狀態(tài)，指數(shù)生長階段，固定生長階段)的細胞生長和增值。
[0124]來自愈傷組織的不同懸浮液被放在定軌搖晃器上，以IlOrpm的轉(zhuǎn)速、在時間中25° C條件下攪拌(在各自裝有100ml培養(yǎng)基和10克均勻質(zhì)地、顏色和生長愈傷組織的三角燒瓶中)。測試并比較若干培`養(yǎng)基和激素組合，以便優(yōu)化生長曲線。也嘗試優(yōu)化接種體的初始密度，以縮短滯后階段，從而減小培養(yǎng)的整個持續(xù)時間。
[0125]另外，選擇的接種體的初始密度對應于10%的PCV。
[0126]下一個步驟是確定最佳環(huán)境條件，以便在培養(yǎng)的生長階段結(jié)束時，朝著生產(chǎn)二次代謝物的方向引導細胞的新陳代謝。這些二次代謝物和提取物培養(yǎng)基的其它組分一起，將參與在結(jié)束時獲得的提取物的活性。
[0127]這樣，在培養(yǎng)基中，識別出高比例的極性分子，包括糖、氨基酸、一次代謝物、肉桂酸和咖啡衍生物，以及苯乙醇糖苷的混合物。選擇苯乙醇糖苷作為二次代謝物生物體量生產(chǎn)的指示劑；它們總劑量能通過Arnow的方法容易地實現(xiàn)。這是一種分光光度計法，基于通過亞硝酸鈉和鑰酸鈉，讓全部多酚在堿性培養(yǎng)基中氧化(在510nm波長處的讀數(shù))。假設培養(yǎng)基中存在其它類別的分子，比如類黃酮或環(huán)烯醚萜，但不能識別。顯然，所有這些分子都將負責最終提取物的活性。
[0128]然后，將根據(jù)本發(fā)明選擇的用于引導二次代謝物生產(chǎn)的引導劑放在缺乏蔗糖和常量營養(yǎng)素的培養(yǎng)基的細胞中，最好是以相同比例。
[0129]液體培養(yǎng)基中的這個轉(zhuǎn)移階段、以及生長和生產(chǎn)的參數(shù)優(yōu)化能持續(xù)6個月到I年。
[0130]這個步驟之后，將選擇能給出最佳結(jié)果的系。
[0131]它被交付給DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkuturenGmbH)，位于參考號DSM25009之下。
[0132]本發(fā)明涵蓋了從編號DSM25009之下記錄的細胞株中獲得的心葉球花物種的提取物。
[0133]2)提取物獲得[0134]a)生物反應器中預培養(yǎng)物的生產(chǎn)
[0135]實現(xiàn)了細胞株的連續(xù)預培養(yǎng)；選擇量為I升，接著是5升，接著是25升，最后是100升。各自都在10%PCV中種植，然后長到50%的PCV。這樣生產(chǎn)的細胞生物體量用于接種較大規(guī)格的培養(yǎng)。這個階段能持續(xù)I到3個月。
[0136]b)轉(zhuǎn)移到生物反應器，包括激發(fā)階段[0137]然后，在5到20%PVC之間。種植一次性使用的袋式生物反應器(600升總?cè)莘e，300
升總培養(yǎng)容積)。
[0138]生物反應器特別配備了:
[0139]-搖臂系統(tǒng)，用于細胞攪拌和充氧，也用于培養(yǎng)溫度調(diào)節(jié)；這是特別選擇的，因為與常規(guī)生物反應器的剪切相比，它在植物細胞的易碎性方向更加適合；
[0140]-配備不同傳感器(氧，pH和溫度)的控制塔，用于培養(yǎng)步驟的跟蹤和調(diào)節(jié)；
[0141]-用于細胞培養(yǎng)的一次性無菌袋，配備不同傳感器(pH，氧)；用于取樣或接種無菌流體的氣體供應和交換系統(tǒng)的過濾器。
[0142]在生物反應器中培養(yǎng)10-15天后，培養(yǎng)達到大約30到45%的PCV。然后添加缺乏的培養(yǎng)基，以觸發(fā)二次代謝物的生產(chǎn)，這里包括苯乙醇糖苷。新鮮培養(yǎng)基的添加量是10到50%的最終培養(yǎng)體積。3-5天后，培養(yǎng)停止于35-50%的PCV，這時培養(yǎng)物中的苯乙醇糖苷大約是每升2克。
[0143]生物反應器的這個階段總共持續(xù)2到3個星期。
[0144]c)提取物的回收
[0145]這個后續(xù)步驟的目的是，生產(chǎn)水性和澄清的提取物。
[0146]實現(xiàn)細胞溶菌，導致在液相中釋放二次代謝物。這個溶菌通過酸化來進行。然后進行級聯(lián)過濾；首先是深入的，隨后是無菌過濾，以獲得本發(fā)明的水性提取物。這個步驟旨在讓提取物穩(wěn)定。
[0147]以這種植物細胞培養(yǎng)方法獲得的提取物是透明的，無色到淡黃色，與“經(jīng)典”植物提取物的亮黃色截然不同。對于化妝品配料或其它當中提取物的直接后續(xù)配制，這是一個優(yōu)點。
[0148]這個過程有變體存在，包括:
[0149]I)對于感興趣分子的提取:
[0150]-細胞溶菌步驟能通過生物體熱處理來執(zhí)行，例如通過將蒸汽注入生物體內(nèi)。它也能通過將細胞與微珠一起研磨來進行。
[0151]-在細胞溶菌步驟后，可以提純原始提取物，以增大其中感興趣分子的濃度。據(jù)此，首先通過過濾或離心分離取出生物體。接著，讓獲得的澄清液相與專門針對它與感興趣分子的親和性而選擇的吸附樹脂接觸。然后，將這些樹脂裝入玻璃色譜柱。利用合適的混合物洗提樹脂，產(chǎn)品的洗出物被濃縮。
[0152]-根據(jù)本發(fā)明的提取物的回收能使用脂質(zhì)體來實施。
[0153]2)關于感興趣分子的激發(fā)模式:
[0154]感興趣化合物的激發(fā)也能通過下列方式完成:向培養(yǎng)物中添加微生物餾分；添加生物起源的分子，比如，殼聚糖、茉莉酸酸甲酯、茉莉酸、水楊酸；添加非生物起源的分子，比如多效唑；給培養(yǎng)運用不同的溫度，不同的pH值，和/或通過非代謝糖誘導的滲透應力，比如甘露醇；使用常量元素和糖更加激烈的貧化環(huán)境；向培養(yǎng)物中添加吸附樹脂。除了激發(fā)感興趣化合物的生產(chǎn)以外，樹脂還能捕捉它們。
[0155]3)對于細胞株創(chuàng)建階段的替代，也能使用已經(jīng)根據(jù)本發(fā)明制備并保存的細胞株。在此情況下，創(chuàng)建細胞株的步驟被取代。而是變成一個常規(guī)步驟，從瓊脂和液體培養(yǎng)基中首先存在的所述細胞株進行未分化植物細胞的放大。
[0156]本發(fā)明方法也能利用球花屬的其它物種來實現(xiàn)。
[0157]B)實現(xiàn)本發(fā)明的組分的配方示例；它是一種“活性成分”，化妝品工業(yè)的原材料
[0158]活性成分是含有心葉球花植物源提取物的化妝品組分，溶解在從皮膚學上可以接受的培養(yǎng)基或胞間質(zhì)中。這種活性成分打算用于化妝品工業(yè)，用于制備化妝品，比如霜劑、凝膠等(參見下面給出的草本制劑示例)。
[0159]在上述示例A)中獲得的水性提取物可能更好是以20到80%的比例混合任何親水的胞間質(zhì)，作為凝膠、水性緩沖劑、甘油或生理上可以接受的其它短鏈多元醇。
[0160]例如，也為了實現(xiàn)研究和下文展示的草本制劑，最選使用不超過33%的提取物。
[0161]當然，沒有賦形劑的純提取物也能用作活性成分。
[0162]C)離體和ex-vivo (還愿物)研究
[0163] 申請人:已經(jīng)展示了下面展示的球花屬提取物的多個明顯化妝品效應。
[0164]按照上面的示例B)制備的不超過33%的水性提取物進行離體試驗，顯示了各種化妝品活性，涉及皮膚生理學的若干區(qū)域。這些試驗全部是利用2%的此類心葉球花提取物進行的。
`[0165]對比試齡
[0166]首先，與整個植物的水醇提取物相比，通過細胞培養(yǎng)獲得的提取物已經(jīng)顯示出優(yōu)越性。這些第一批試驗的執(zhí)行方法是，將兩種物質(zhì)進行比較。一種是按照上面的示例B)制備的水性提取物，不超過33%，稀釋到2% ;另一種是整個植物的水醇提取物。在苯乙醇糖苷中處于相當?shù)臐舛取?br> [0167]1)BSA的非酶糖化
[0168]這個樣品試驗以離體形式再現(xiàn)了常規(guī)皮膚蛋白質(zhì)承受的應力:通過非酶糖化現(xiàn)象造成的它們功能改變。
[0169]使用的研究模型是牛血清清蛋白(BSA);它與生理還原糖(即果糖)接觸，給出兩個分子之間的自發(fā)的和緩慢的反應。此反應能通過溫度來加速。在本試驗中，BSA和果糖在沒或沒有試驗產(chǎn)品存在的條件下培養(yǎng)，溫度50° C，持續(xù)7天。糖化最終產(chǎn)物具有天然熒光，能使用突光計(λ ex=360nm和λ em=460nm)來量化。
[0170]使用0.03%的氨基胍作為糖化抑制的正對照物。
[0171]數(shù)據(jù)在下面的表1中給出。
[0172]表1:
[0173]
糖化抑制|%變化，相對于對照物
心葉球花水醇植物提取物~+8% (dns*)
【權利要求】
1.一種將Globularia (球花)屬的植物源提取物用于皮膚和/或附器的非治療性化妝品處理的方法。
2.根據(jù)權利要求1的方法，其特征在于:物種是心葉球花。
3.根據(jù)權利要求1或2的方法，其特征在于:提取物是通過離體植物培養(yǎng)獲得的。
4.根據(jù)權利要求3的方法，其特征在于:提取物是從未分化細胞的植物培養(yǎng)獲得的。
5.根據(jù)前面任何一項權利要求的方法，其特征在于:提取物是從葉子中獲得的。
6.根據(jù)前面任何一項權利要求的方法，其特征在于:用于通過刺激解毒反應和/或細胞再生、預防和/或處理皮膚老化以有利于毒物刺激類響應，。
7.根據(jù)前面任何一項權利要求的方法，其特征在于:用于改善面色的透明度和光亮度。
8.根據(jù)前面任何一項權利要求的方法，其特征在于:用于預防或處理過敏性和反應性皮膚。
9.根據(jù)前面任何一項權利要求的方法，其特征在于:用于預防或處理發(fā)紅。
10.根據(jù)前面任何一項權利要求的方法，其特征在于:用于預防蛋白質(zhì)糖化。
11.根據(jù)前面任何一項權利要求的方法，其特征在于:用于增加和/或維持皮膚干細胞的數(shù)量。
12.根據(jù)前面任何一項權利要求的方法，其特征在于:用于增加和/或維持皮膚大分子，尤其是膠原蛋白和彈性蛋白。
13.根據(jù)前面任何一項權利要求的方法，其特征在于:用于增大真皮的體積。
14.根據(jù)前面任何一項權利要求的方法，其特征在于:用于預防和/或處理細線和皺紋。
15.根據(jù)前面任何一項權利要求的方法，其特征在于:用于定型皮膚。
16.根據(jù)前面任何一項權利要求的方法，其特征在于:用于預防脫發(fā)和/或刺激頭發(fā)再生。
17.通過離體植物培養(yǎng)獲得球花屬植物源提取物的方法，包括來自未分化植物細胞的系: -預培養(yǎng)步驟，設計用于增大生物體量； -生物反應器中的培養(yǎng)步驟；包括增殖階段，隨后跟著激發(fā)階段；以及 -所述提取物的回收步驟； 其中，生物反應器步驟中的激發(fā)階段利用蔗糖和常量營養(yǎng)素缺乏的培養(yǎng)基來實現(xiàn)；在提到的所述提取物的回收步驟中，包括酸性PH細胞溶菌。
18.根據(jù)權利要求17的方法能夠獲得的植物源提取物。
19.根據(jù)權利要求18的提取物，其特征在于:植物物種是心葉球花。
20.根據(jù)權利要求19的提取物，其特征在于:從細胞株中獲得、在編號DSM25009之下記錄的提取物。
21.由心葉球花提取物構成的局部組分。
22.根據(jù)權利要求21的組分，用于根據(jù)權利要求2到16的化妝品使用。
23.根據(jù)權利要求21或22的組分，其特征在于:提取物是通過離體植物培養(yǎng)獲得的。
24.根據(jù)權利要求23的組分，其特征在于:提取物是從未分化細胞的植物培養(yǎng)獲得的。
25.根據(jù)權利要求24的組分，其特征在于:提取物是符合權利要求18到20的提取物。
【文檔編號】A61K8/99GK103796633SQ201280006894
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2012年1月30日 優(yōu)先權日:2011年1月31日
【發(fā)明者】阿爾諾·佛尼亞, 克萊爾-瑪麗·格瑞佐, 菲利普·蒙東, 卡羅琳·艾勒·摩根 申請人:賽德瑪公司