專利名稱：赤潮毒素失去記憶性貝毒的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用抗失去記憶性貝毒的單克隆抗體與失去記憶性貝毒抗原結(jié)合，而分析檢測環(huán)境樣品中的失去記憶性貝毒含量的快速方便檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
目前失去記憶性貝毒的分析方法有生物小鼠法、高效液相色譜法和免疫化學(xué)方法。生物小鼠法是將藻或貝等生物組織的萃取液注射進(jìn)小鼠腹腔內(nèi)，根據(jù)小鼠死亡時間，對照標(biāo)準(zhǔn)表，查得失去記憶性貝毒的含量，該方法誤差大、重現(xiàn)性差、費時麻煩；高效液相色譜法是將藻或貝等生物組織的萃取液經(jīng)前處理后，進(jìn)行液相色譜分離，結(jié)合紫外或質(zhì)譜檢測器，經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)品的值對照，計算得出失去記憶性貝毒的含量，該方法準(zhǔn)確、成熟，并能分析鑒定不同的異構(gòu)體，但缺點是前處理麻煩，儀器昂貴，需要專門的分析技術(shù)人員，不適合現(xiàn)場及大批量樣品的分析；免疫化學(xué)方法是通過免疫動物制得特異性抗體(多克隆抗體或單克隆抗體)，利用抗體對失去記憶性貝毒的結(jié)合反應(yīng)，按照酶聯(lián)免疫分析方法制成檢測試劑盒，用于失去記憶性貝毒的分析檢測，該方法簡便、快速，可同時分析大批量樣品，國外有售成品試劑盒，但價格昂貴。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決失去記憶性貝毒的現(xiàn)場、快速、大批量樣品的分析問題，本技術(shù)發(fā)明提供一種國產(chǎn)、利用抗失去記憶性貝毒的單克隆抗體研制的間接競爭酶聯(lián)免疫分析失去記憶性貝毒的試劑盒，價格比同類進(jìn)口試劑盒便宜5-10倍，適于現(xiàn)場、快速、大批量樣品的檢測。
本技術(shù)發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是用水溶性碳二亞胺方法，將失去記憶性貝毒的主要成分軟骨藻酸(DA)偶聯(lián)到血藍(lán)蛋白(KLH)上，加佐劑免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾細(xì)胞和SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選穩(wěn)定分泌抗軟骨藻酸單克隆抗體(MAb-DA)的細(xì)胞株，擴(kuò)大培養(yǎng)，小鼠體內(nèi)誘生腹水，蛋白G柱純化，制得抗軟骨藻酸的單克隆抗體，用合成的軟骨藻酸-卵清蛋白(DA-OVA)包被96孔酶標(biāo)板，加入DA標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，再加入Mab-DA，包被抗原DA與自由的DA競爭抗體Mab-DA，自由的DA和抗體復(fù)合物被洗去，與包被抗原DA結(jié)合的抗體Mab-DA再與酶標(biāo)記的二抗結(jié)合，經(jīng)底物顯色，終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測定各孔的吸光值(OD)，OD值越大，樣品中自由的DA含量越少，對照標(biāo)準(zhǔn)品回歸的方程，計算樣品DA的含量。
本技術(shù)發(fā)明的有益效果是利用得到的陽性細(xì)胞可大量制得抗軟骨藻酸的單克隆抗體，所研制的試劑盒成本低廉、價格便宜，該試劑盒的靈敏度可達(dá)10ng/mL。
具體實施例方式
以過量的碳二亞胺和DA與KLH反應(yīng)的方法，制得高分子比的DA-KLH偶聯(lián)物，多次免疫，得到免疫良好的脾細(xì)胞，融合后，應(yīng)盡早檢測，篩選分泌抗體能力強(qiáng)的細(xì)胞株以得到優(yōu)良的抗體，選擇合適的包被比例(1∶1000)和抗體稀釋度(1∶8000)，以得到最佳的檢測靈敏度(10ng/mL)。
權(quán)利要求
一種快速簡易分析檢測赤潮毒素失去記憶性貝毒的試劑盒，在包裝盒內(nèi)有已包被檢測抗原的可拆96孔酶標(biāo)板、濃縮洗液、特異性檢測抗體、酶標(biāo)二抗、失去記憶性貝毒標(biāo)準(zhǔn)品、稀釋液、顯色劑、終止液，其特征是按說明書制得的待分析樣品和系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品分別加在不同孔中與檢測抗體反應(yīng)，經(jīng)孵育、洗滌，順序與酶標(biāo)二抗、顯色液和終止液反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測得各孔的吸光值，將標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值回歸分析得到方程，計算得出樣品中的毒素含量。
全文摘要
一種能夠快速靈敏檢測環(huán)境樣品中的赤潮毒素失去記憶性貝毒的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。它是利用合成的高分子比的抗原DA－KLH，經(jīng)多次免疫BLAB/c鼠，通過細(xì)胞融合，篩選、誘生腹水和蛋白柱提純得到特異性的抗軟骨藻酸(失去記憶性貝毒的主要成分)的單克隆抗體，選擇1∶1000的包被比例和1∶8000的抗體稀釋度，研制出間接競爭酶聯(lián)免疫分析赤潮毒素失去記憶性貝毒軟骨藻酸的檢測試劑盒，該試劑盒成本低廉、價格便宜，操作簡便快速，適合大批量樣品的分析，靈敏度可達(dá)10ng/ml。
文檔編號G01N33/531GK1892224SQ200510081658
公開日2007年1月10日 申請日期2005年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月6日
發(fā)明者劉仁沿, 許道艷, 梁玉波 申請人:國家海洋環(huán)境監(jiān)測中心