一種痕量內(nèi)毒素的快速檢測方法和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種痕量內(nèi)毒素的快速檢測方法，可直接靈敏高通量地檢測多種樣品中痕量內(nèi)毒素，并提供相應(yīng)的試劑盒，該試劑盒人工抗體的96孔酶標(biāo)板、內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液、兔抗內(nèi)毒素多克隆抗體(一抗)、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體(二抗)和化學(xué)發(fā)光試劑組成。該方法將集特異性樣品預(yù)處理和ELISA檢測于一體，人工抗體耐高溫、酸堿和有機(jī)溶劑，可高效特異性分離和富集樣品中的痕量內(nèi)毒素，ELISA則可特異快速地檢測所富集的內(nèi)毒素，結(jié)合高靈敏度的化學(xué)發(fā)光法，有效提高ELISA檢測內(nèi)毒素的靈敏度、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，從而能靈敏、快速、高通量地檢測各種樣品中痕量內(nèi)毒素。
【專利說明】一種痕量內(nèi)毒素的快速檢測方法和試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子印跡和免疫分析領(lǐng)域，具體涉及一種可特異性吸附內(nèi)毒素的分子印跡人工抗體(MIP)的制備，以及該MIP與ELISA方法聯(lián)合使用，建立一種集特異性樣品預(yù)處理和ELISA檢測于一體，直接靈敏高通量地檢測多種樣品中痕量內(nèi)毒素的新型酶聯(lián)免疫分析方法:MIP-ELISA法。并提供相應(yīng)的試劑盒。
技術(shù)背景
[0002]內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要組成成分，位于細(xì)胞壁的最外層，在細(xì)菌死亡菌體裂解或者人工破壞細(xì)菌結(jié)構(gòu)的情況下則會釋放出來。人體對內(nèi)毒素極為敏感，極微量(l_5ng/kg體重)的內(nèi)毒素即可使機(jī)體體溫升高，產(chǎn)生內(nèi)毒素休克，播散性血管內(nèi)凝血等癥狀，嚴(yán)重威脅人群健康。由于內(nèi)毒素廣泛存在空氣、土壤和水等與人類生活密切相關(guān)的環(huán)境中，因此，監(jiān)測生物和環(huán)境中的內(nèi)毒素含量對保障人類健康具有重要意義。
[0003]目前，檢測內(nèi)毒素的方法主要有鱟試驗(yàn)法和酶聯(lián)免疫法等。鱟試驗(yàn)法具有快速、簡便、靈敏度高和易推廣等優(yōu)點(diǎn)，是目前檢測內(nèi)毒素的金標(biāo)準(zhǔn)。但該方法仍然有以下兩個主要缺點(diǎn):(1)鱟試驗(yàn)法的檢測結(jié)果易受樣品本身的顏色及濁度影響；(2)制備鱟試劑需要捕殺大量的受保護(hù)動物鱟。基于此，人們開始研究鱟試驗(yàn)法的替代方法。酶聯(lián)免疫法(ELISA)應(yīng)用較為廣泛，由于抗體的特異性和酶的放大作用，ELISA具有特異性高、準(zhǔn)確性高、操作簡便快速和高通量等優(yōu)點(diǎn)，但是其靈敏度(100ng/mL)較當(dāng)試驗(yàn)法(0.01-lng/mL)低,可以直接檢測含高濃度內(nèi)毒素(如發(fā)熱病人血清)的樣本，但對于環(huán)境中的低濃度內(nèi)毒素，往往需要進(jìn)行樣品預(yù)處理后才能檢測。這一缺點(diǎn)限制了 ELISA在環(huán)境樣品檢測中的應(yīng)用。
[0004]針對ELISA需要進(jìn)行樣品預(yù)處理以提高檢測靈敏度較的需要，如果能將特異性樣品預(yù)處理和ELISA檢測結(jié)合于一體，不僅可以提高ELISA檢測的靈敏度，也因?yàn)闃悠奉A(yù)處理去除了干擾物質(zhì)，可同時提高ELLISA檢測的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。天然抗體對溫度、有機(jī)溶劑耐受性差，保存和反應(yīng)條件嚴(yán)苛，無法用于樣品預(yù)處理。分子印跡技術(shù)是20世紀(jì)90年代興起的新型功能材料制備技術(shù)，所制備的人工抗體(又稱分子印跡聚合物，MIP)可特異性識別和結(jié)合靶分子，并能耐受高溫高壓和強(qiáng)酸強(qiáng)堿等特點(diǎn)，已經(jīng)廣泛用于固相萃取、親和層析等樣品預(yù)處理和分析技術(shù)中。將MIP與ELISA技術(shù)結(jié)合，有望建立集特異性樣品預(yù)處理和ELISA檢測于一體的新型檢測方法。
[0005]Piletsky等使用3_氨基苯硼酸,3-噻吩硼酸和苯胺作為功能單體,在聚苯乙烯微板表面成功制備了腎上腺素、莠去津和蛋白質(zhì)的MIP。結(jié)果表明，所合成的MIP對模板分子具有特異性識別和吸附的能力，同時還具有高穩(wěn)定性及重復(fù)性，有望代替天然抗體(Piletsky, SA, Piletska, EV, Bossi, A, et al, Substitut1n of Antibodies AndReceptors with Molecularly Imprinted Polymers in Enzyme-linked And FluorescentAssays.B1sens.B1electron.2001，16 (9):701-707.)。Takeuchi 等在 96 孔酶標(biāo)板內(nèi)制備了以金雞納啶為模板，2-硫代乙基甲基丙烯酸酯為功能單體的MIP，可利用金雞納啶與MIP結(jié)合后熒光的改變，快速測定樣品中金雞納啶濃度(Takeuchi T，Seko A，Matsui J，etal,Molecularly Imprinted Polymer Library on a Microtiter Plate.High-ThroughputSynthesis And Assessment of Cinchona Alkaloid-1mprinted Polymers.1nstrum Sc1.Technol.2001, 29 (I):1_9.)。Ogawa等以丙烯酰賴氨酸和丙烯酰苯基丙氨酸作為功能單體，脂質(zhì)A作為模板分子，在96孔酶標(biāo)板內(nèi)制備了一種水凝膠MIP，對內(nèi)毒素具有良好的特異性識別和吸附能力，有望應(yīng)用于清除水或者蛋白質(zhì)產(chǎn)品中的內(nèi)毒素(Ogawa KI,Hyuga M, Okada T, et al, Development of Lipid A-1mprinted Polymer HydrogelsThat Selectively Recognize Lipopolysaccharides.B1sens.B1electron.2012,38:215-219.)。Takahashi等發(fā)現(xiàn)先將多粘菌素B、聚L-組氨酸或者聚L-賴氨酸包被于聚苯乙烯微板表面，能吸附內(nèi)毒素并可用酶聯(lián)免疫法檢測所吸附的內(nèi)毒素，其中使用聚L-賴氨酸包被之后的吸附效率最高。但是該方法易受PH影響，僅在pH6.5?8.0之間時有較高的吸附效能，且只能吸附較高濃度(大于100ng/mL)的內(nèi)毒素(Takahashi K, Fukada M, KawaiM, et al, Detect1n of Lipopolysaccharide(LPS)And Identificat1n of ItsSerotypeby An Enzyme-Linked Immunosorbent Assay(ELISA)Using Poly-L-lysine.J.Tmmunol.Methods.1992,153(1):67-71.)。ELISA方法也易受樣品顏色、離子、pH等的影響。環(huán)境樣品成分復(fù)雜，含多種可干擾非特異性結(jié)合的因素(如金屬離子、PH變化大)，而且內(nèi)毒素含量低，需要進(jìn)行樣品預(yù)處理后才能使用ELISA方法進(jìn)行檢測。
[0006]為準(zhǔn)確測定復(fù)雜環(huán)境樣品中的痕量內(nèi)毒素，需要靈敏度高，特異性好的方法。將MIP與ELISA方法聯(lián)合使用，即可利用MIP的特異性吸附能力，特異高效快速分離和富集樣品中痕量的內(nèi)毒素，去除主要的干擾物，顯著提高ELISA檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性。目前尚無集樣品預(yù)處理和ELISA檢測于一體的方法報道，因此集特異性樣品預(yù)處理和ELISA檢測于一體的MIP-ELISA快速檢測方法，不僅可用于快速準(zhǔn)確檢測內(nèi)毒素，也有望用于其它污染物的快速檢測上，在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)和環(huán)境等領(lǐng)域?qū)⒂休^大的應(yīng)用價值。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的任務(wù)是提供一種痕量內(nèi)毒素的快速檢測方法(MIP-ELISA法)，該方法集特異性樣品預(yù)處理和ELISA檢測內(nèi)毒素于一體，在保證ELISA檢測特異性的同時，提高了ELISA檢測的靈敏度和穩(wěn)定性，具有靈敏、快速、高通量等特點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)對生物和環(huán)境等復(fù)雜樣品中痕量內(nèi)毒素的準(zhǔn)確定量。
[0008]本發(fā)明的另一個任務(wù)是提供痕量內(nèi)毒素的快速檢測試劑盒。
[0009]實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案是:
[0010]本發(fā)明提供的一種痕量內(nèi)毒素的快速檢測方法(MIP-ELISA法)，包括以下步驟:
[0011]步驟一、合成人工抗體:內(nèi)毒素與多巴胺按質(zhì)量濃度比為1: 2-8的比例混合溶于PH8.0的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)緩沖溶液中，將混合溶液加于96孔酶標(biāo)板孔內(nèi)，在室溫下暴露于空氣中反應(yīng)24-72小時；使用含3%乙酸和0.1 %十二烷基硫酸鈉的水溶液反復(fù)震蕩洗滌酶標(biāo)板2-8次，每次20-60min，再使用三蒸水震蕩洗滌2_8次，即可得到附著于酶標(biāo)板表面的MIP ；
[0012]步驟二、檢測樣品(試劑盒檢測)，包括以下步驟a至d:
[0013]步驟a:向上述含有MIP的酶標(biāo)板孔內(nèi)加入100 μ L待測樣品，20_40°C作用l_5h后以磷酸鹽緩沖液(組分為氯化鈉Sg，氯化鉀0.2g，磷酸氫二鈉1.44g，磷酸二氫鉀0.24g，0.005%吐溫20100 μ L，三蒸水定容至lOOOmL，pH = 7.4)洗滌2-8次；
[0014]步驟b:將兔抗內(nèi)毒素多克隆抗體用抗體稀釋液以1: 100~1: 2000進(jìn)行稀釋，然后每孔加入100 μ L，20-40°C作用l-5h后以磷酸鹽緩沖液洗滌2_8次；
[0015]步驟c:將辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體用抗體稀釋液以1: 500~1: 5000進(jìn)行稀釋，然后每孔加入100μ L, 20-40 °C作用l-5h后以磷酸鹽緩沖液洗漆2-8次；
[0016]步驟d:每孔加入化學(xué)發(fā)光試劑200μ L，立即使用多功能酶標(biāo)儀檢測發(fā)光強(qiáng)度，其中化學(xué)發(fā)光試劑由摩爾濃度為5X 10_4mol/L的魯米諾(Luminol) ,4X 10_3mol/L的過氧化氫(H2O2)及4X10_4mol/L的對碘苯酚(PIP)組成。
[0017]本發(fā)明提供的痕量內(nèi)毒素的快速檢測試劑盒，由含人工抗體的96孔酶標(biāo)板、內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液、兔抗內(nèi)毒素多克隆抗體(一抗)、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體(二抗)和化學(xué)發(fā)光試劑組成，所述的化學(xué)發(fā)光試劑由5X ΙθΛιοΙ/L的魯米諾(Luminol)、4X10-3mol/L的過氧化氫(H202)及4X 10_4mol/L的對碘苯酚(PIP)組成。
[0018]本發(fā)明提供的痕量內(nèi)毒素的快速檢測試劑盒的使用方法如下:
[0019]步驟一:向含有MIP的酶標(biāo)板孔內(nèi)加入10yL待測樣品，20-40°C作用l_5h后以磷酸鹽緩沖液(組分為氯化鈉Sg，氯化鉀0.2g，磷酸氫二鈉1.44g，磷酸二氫鉀0.24g，
0.005%吐溫20100 μ L，三蒸水定容至lOOOmL，pH = 7.4)洗滌2-8次。
[0020]步驟二:將兔抗內(nèi)毒素多克隆抗體用抗體稀釋液以1: 100~1: 2000進(jìn)行稀釋，然后每孔加入100μ L，20-40°C作用l_5h后以磷酸鹽緩沖液洗滌2_8次。
[0021]步驟三:將辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體用抗體稀釋液以1: 500~I: 5000進(jìn)行稀釋，然后每孔加入100μL，20-40τ:作用l-5h后以磷酸鹽緩沖液洗滌2-8次。
[0022]步驟四:每孔加入化學(xué)發(fā)光試劑200μ L，立即使用多功能酶標(biāo)儀檢測發(fā)光強(qiáng)度，其中化學(xué)發(fā)光試劑由摩爾濃度為5Χ 10_4mol/L的魯米諾(Luminol)，4X 10_3mol/L的過氧化氫(H202)及4X10_4mol/L的對碘苯酚(PIP)組成。
[0023]本發(fā)明所建立的MIP-ELISA法，其中MIP是一種分子印跡聚合物，具有與內(nèi)毒素大小和形狀相匹配的立體空腔，并具有特定的非共價結(jié)合鍵，能在室溫下特異性地結(jié)合內(nèi)毒素，因而可快速且有效地分離和吸附內(nèi)毒素，有效去除樣品中的其它雜質(zhì)和復(fù)雜樣品基質(zhì)對檢測結(jié)果的干擾。同時耐受酸、堿、有機(jī)溶劑和溫度，非常適合用于樣品預(yù)處理；此外，MIP所結(jié)合的內(nèi)毒素還能與天然抗體結(jié)合。利用MIP的仿生識別能力，建立MIP-ELISA法，一方面可利用包被抗體MIP的特異性吸附能力和高耐受性，選擇性分離富集樣品中痕量內(nèi)毒素后，再使用ELISA方法測定所富集的內(nèi)毒素。集選擇性樣品預(yù)處理和靈敏快速的ELISA于一體，復(fù)雜樣品無需經(jīng)過其他預(yù)處理即可直接進(jìn)行檢測，結(jié)合高靈敏度的化學(xué)發(fā)光方法，提高了檢測靈敏度，特別適合用于復(fù)雜樣品中痕量內(nèi)毒素的快速檢測。
[0024]本發(fā)明提供的MIP-ELISA法集特異性樣品預(yù)處理和ELISA檢測于一體，可直接靈敏高通量地檢測多種樣品中痕量內(nèi)毒素。本發(fā)明以MIP為包被抗體，特異性分離和富集痕量內(nèi)毒素后，然后加入一抗(兔抗內(nèi)毒素多克隆抗體)與富集的內(nèi)毒素形成抗原-抗體結(jié)合物，最后加入二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體)，增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光法(ECL)直接檢測包括自來水、江水和醫(yī)院污水等各種樣品中痕量內(nèi)毒素含量。
[0025]眾所周知，ELISA具有檢測快速，高通量等特點(diǎn)，但是因?yàn)轱@色法ELISA靈敏度(lOOng/mL)和化學(xué)發(fā)光法ELISA靈敏度(50ng/mL)較低而限制了其在痕量內(nèi)毒素檢測方面的應(yīng)用。本發(fā)明所建立的MIP-ELISA方法，一方面利用MIP的特異性樣品預(yù)處理能力，分離和富集了樣品中的痕量內(nèi)毒素，同時采用高靈敏度的發(fā)光法進(jìn)行檢測，有效提高了檢測的靈敏度。本方法在直接上樣100 μ L進(jìn)行檢測的情況下，其靈敏度比利用多克隆抗體的ELISA高了 5?10倍，達(dá)到了 10ng/mL。此外，經(jīng)MIP樣品預(yù)處理的樣品，一方面有效去除了干擾物，另一方面通過濃縮樣品，進(jìn)一步提高ELISA檢測的靈敏度、準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。MIP-ELISA集特異性樣品預(yù)處理與ELISA檢測于一體，可用于生物和環(huán)境中痕量內(nèi)毒素的準(zhǔn)確監(jiān)測。相似的方法也可用于其他痕量污染物的快速檢測上。
[0026]本發(fā)明對MIP-ELISA法及相應(yīng)試劑盒的檢測靈敏度、特異性和穩(wěn)定性進(jìn)行了分析:
[0027]靈敏度分析:利用本發(fā)明MIP-ELISA法對系列濃度梯度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測，分析本發(fā)明方法對內(nèi)毒素檢測的線性范圍及檢測靈敏度，并與標(biāo)準(zhǔn)方法鱟試劑法、間接競爭性ELISA(icELISA)法進(jìn)行比較
[0028]特異性分析:利用本發(fā)明MIP-ELISA法檢測不同濃度的革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌裂解液中的內(nèi)毒素含量，判斷本方法對不同細(xì)菌所產(chǎn)內(nèi)毒素的檢測特異性和準(zhǔn)確性，并與標(biāo)準(zhǔn)方法鱟試劑法、icELISA法進(jìn)行比較。其特征在于，所述的革蘭氏陰性菌是大腸桿菌、明亮發(fā)光桿菌、綠膿桿菌，革蘭氏陽性菌是金黃色葡萄球菌。
[0029]穩(wěn)定性分析:測定本發(fā)明MIP-ELISA法對內(nèi)毒素加標(biāo)的江水樣品檢測的日間偏差(連續(xù)測定6天)和日內(nèi)偏差(I天內(nèi)測6次)，以樣品的加標(biāo)回收率和日內(nèi)及日間精密度來分析MIP-ELISA的穩(wěn)定性。測定試劑盒批次間偏差出批次)，以批次間精密度來分析以MIP-ELISA法為基礎(chǔ)所建立的試劑盒的穩(wěn)定性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖1a在96孔酶標(biāo)板的孔內(nèi)(BI?F12)合成的MIP。圖1b未經(jīng)任何處理的96孔酶標(biāo)板。從圖1a可以看出MIP在孔內(nèi)呈黑色膜狀。
[0031]圖2a MIP-ELISA法測定內(nèi)毒素的標(biāo)準(zhǔn)曲線。縱坐標(biāo)為不同內(nèi)毒素濃度下所產(chǎn)生的發(fā)光強(qiáng)度；橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品內(nèi)毒素濃度。隨著的內(nèi)毒素濃度增加，其發(fā)光強(qiáng)度增強(qiáng)，發(fā)光強(qiáng)度與所加內(nèi)毒素濃度成正比，變化值與內(nèi)毒素濃度在10ng/mL?105ng/mL范圍內(nèi)存線性關(guān)系，表明MIP-ELISA的檢測靈敏度為10ng/mL。
[0032]圖2b icELISA法測定內(nèi)毒素的標(biāo)準(zhǔn)曲線?？v坐標(biāo)為不同內(nèi)毒素濃度下所產(chǎn)生的發(fā)光強(qiáng)度；橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品內(nèi)毒素濃度。隨著的內(nèi)毒素濃度增加，其發(fā)光強(qiáng)度增強(qiáng)，發(fā)光強(qiáng)度與所加內(nèi)毒素濃度成正比，變化值與內(nèi)毒素濃度在50ng/mL?105ng/mL范圍內(nèi)存線性關(guān)系，表明icELISA的檢測靈敏度為50ng/mL。
[0033]圖3MIP-ELISA、icELISA與標(biāo)準(zhǔn)鱟試劑法對四種細(xì)菌樣品的檢測結(jié)果比較圖。從圖中可以看出，本發(fā)明MIP-ELISA法、鱟試劑法、icELISA法均可準(zhǔn)確測量革蘭氏陰性菌所產(chǎn)生的內(nèi)毒素，而不產(chǎn)生內(nèi)毒素的革蘭氏陽性菌則無法測到內(nèi)毒素。三種方法測定的內(nèi)毒素含量結(jié)果無顯著性差異(P > 0.05)。
[0034]圖4MIP-ELISA、icELISA與標(biāo)準(zhǔn)鱟試劑法對三種實(shí)際水樣的檢測結(jié)果比較圖。從圖中可以看出，本發(fā)明MIP-ELISA法可以檢測出自來水和江水中內(nèi)毒素的含量，檢測結(jié)果與鱟試劑法相當(dāng)(P > 0.05，測定結(jié)果無顯著性差異)，而icELISA法無法檢測出，說明本發(fā)明方法的靈敏度高于icELISA法。
[0035]圖5為本發(fā)明痕量內(nèi)毒素快速檢測方法的流程圖。

【具體實(shí)施方式】
[0036]實(shí)施例1:MIP-ELISA法的靈敏度分析
[0037]將系列濃度梯度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品(10，50，100，1000，10000，100000ng/mL)分別加入到含人工抗體的酶標(biāo)板孔內(nèi)，每孔100μ L，20-40°C作用l_5h后以磷酸鹽緩沖液洗滌2-8次。然后每孔加入100 μ L兔抗大腸桿菌內(nèi)毒素多克隆抗體(用抗體稀釋液以1: 100?I: 2000進(jìn)行稀釋)，20-40°C作用l_5h后以磷酸鹽緩沖液洗滌2-8次。每孔再加入100 μ L辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體(用抗體稀釋液以1: 500?1: 5000進(jìn)行稀釋)，20-40°C作用l_5h后以磷酸鹽緩沖液洗滌2-8次。最后每孔加入增強(qiáng)發(fā)光工作液200 μ L (摩爾濃度為 5*l(T4mol/L 的 Luminol，4*l(T3mol/L 的 H2O2 及 4*l(T4mol/L 的 PIP)，立即使用多功能酶標(biāo)儀檢測發(fā)光強(qiáng)度。
[0038]從圖2a可以看出，MIP-ELISA法隨著的內(nèi)毒素濃度增加，發(fā)光強(qiáng)度增大，發(fā)光強(qiáng)度與所加內(nèi)毒素濃度成正比，在10ng/mL?105ng/mL范圍內(nèi)，內(nèi)毒素濃度與發(fā)光強(qiáng)度存在線性關(guān)系，最低內(nèi)毒素檢出濃度為10ng/mL。說明MIP-ELISA的檢測靈敏度為10ng/mL。從圖2b可以看出，icELISA法發(fā)光強(qiáng)度與所加內(nèi)毒素濃度成正比，在50ng/mL?105ng/mL范圍內(nèi)，內(nèi)毒素濃度與發(fā)光強(qiáng)度存在線性關(guān)系，最低內(nèi)毒素檢出濃度為50ng/mL,說明icELISA的檢測靈敏度為50ng/mL。由此可以得出，MIP-ELISA法的靈敏度高于icELISA法，可以方便地用于低濃度內(nèi)毒素的檢測。
[0039]實(shí)施例2:MIP-ELISA法的特異性分析
[0040]利用MIP-ELISA方法測定各種細(xì)菌所產(chǎn)生的內(nèi)毒素含量，并與標(biāo)準(zhǔn)方法鱟試劑法、icELISA法進(jìn)行比較。培養(yǎng)3種革蘭氏陰性菌(大腸桿菌、明亮發(fā)光桿菌、綠膿桿菌)，以及I種革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌)。將4種細(xì)菌菌液(均為105cfu/mL)在沸水中煮2.5h滅活，使細(xì)菌中的內(nèi)毒素失活釋放出來。按實(shí)施例1所建立的MIP-ELISA法測定各種細(xì)菌裂解液中的內(nèi)毒素含量，革蘭氏陰性菌——大腸桿菌、明亮發(fā)光桿菌和綠膿桿菌中的內(nèi)毒素濃度分別為 99.15 ±2.79ng/mL, 112.63 ±3.68ng/mL, 113.74 ±3.58ng/mL，革蘭氏陽性菌——金黃色葡萄球菌的檢測結(jié)果為陰性。同時使用標(biāo)準(zhǔn)鱟試劑法(定量鱟試劑，廈門市鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司)和icELISA法，檢測同樣的樣本。鱟試劑法測定這4種細(xì)菌中的內(nèi)毒素濃度分別為 110.1±8.41ng/mL, 111.8±7.65ng/mL, 112.2±3.6ng/mL 和陰性結(jié)果；icELISA法測定這4種細(xì)菌中的內(nèi)毒素濃度分別為104.2±6.58ng/mL，115.1±4.97ng/mL，116.8±7.36ng/mL和陰性結(jié)果。三種方法測定的內(nèi)毒素含量結(jié)果接近(P >0.05，測定結(jié)果無顯著性差異，圖3)，顯示MIP-ELISA可以準(zhǔn)確檢測革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的內(nèi)毒素，但對不同的內(nèi)毒素?zé)o鑒別能力。
[0041 ] 實(shí)施例3:MIP-ELISA法及相應(yīng)試劑盒的穩(wěn)定性分析
[0042](I)方法穩(wěn)定性。將所采集的江水(武漢長江)靜置于容器內(nèi)，使其自然沉降24h以去除大顆粒及懸浮物，將不同濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品(10，50，100ng/mL)分別加入到沉降后的江水樣品中，按實(shí)施例1所建立的MIP-ELISA法測定未加標(biāo)和加標(biāo)的江水樣品中內(nèi)毒素含量，其中內(nèi)毒素的加標(biāo)回收率在83.6%?101.7%,日內(nèi)偏差為2.1?4.0%,日間偏差為1.6?4.6%，均小于5% (η = 6)。同時使用icELISA檢測同樣的樣本，其中內(nèi)毒素的加標(biāo)回收率在79.3%?92.5%，日內(nèi)偏差為4.2?7.1%,日間偏差為3.9?8.6% (η =6)。說明MIP-ELISA具有較好的穩(wěn)定性，而單純利用天然抗體的icELISA檢測穩(wěn)定性較差。
[0043](2)試劑盒批次間穩(wěn)定性。制備不同批次的試劑盒，按實(shí)施例1所建立的MIP-ELISA法檢測系列濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品(10，50，100，1000,10000,100000ng/mL)，建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，其中各批次試劑盒的批次間偏差為2.5%?3.7% (η = 6)，說明本試劑盒具有較好的穩(wěn)定性，能滿足批量檢測痕量內(nèi)毒素的需要。
[0044]實(shí)施例4:MIP-ELISA法測定自來水中的內(nèi)毒素含量
[0045]按實(shí)施例1所建立的MIP-ELISA法測定采集的自來水樣品中內(nèi)毒素含量，并與標(biāo)準(zhǔn)方法鱟試劑法、icELISA法進(jìn)行比較。MIP-ELISA法測定自來水中的內(nèi)毒素含量為18.15±2.62ng/mL，標(biāo)準(zhǔn)鱟試劑法的檢測結(jié)果為16.52±2.73ng/mL，兩種方法的測定結(jié)果無顯著性差異(P > 0.05),而icELISA法無法測定自來水中的內(nèi)毒素含量,說明icELISA法由于靈敏度較低，無法測定低濃度的內(nèi)毒素(圖4)，說明利用本方法可準(zhǔn)確地測定自來水中的內(nèi)毒素含量。
[0046]實(shí)施例5:MIP-ELISA法測定江水中的內(nèi)毒素含量
[0047]將所采集的江水(武漢長江)靜置于容器內(nèi)，使其自然沉降24h以去除大顆粒及懸浮物，按實(shí)施例1所建立的MIP-ELISA法測定沉降后的江水中的內(nèi)毒素含量，并與標(biāo)準(zhǔn)方法鱟試劑法、icELISA法進(jìn)行比較。MIP-ELISA法的檢測結(jié)果為52.63±2.94ng/mL，標(biāo)準(zhǔn)鱟試劑法的檢測結(jié)果為48.31 ±3.58ng/mL,兩種方法的測定結(jié)果無顯著性差異(p > 0.05),而icELISA法則無法測定江水中的內(nèi)毒素含量，顯示icELISA法由于靈敏度較低，無法測定低濃度的內(nèi)毒素(圖4)，說明利用本方法可準(zhǔn)確地測定江水中的內(nèi)毒素含量。
[0048]實(shí)施例6:MIP-ELISA法測定醫(yī)院污水中的內(nèi)毒素含量
[0049]將所采集的處理后的醫(yī)院污水靜置于敞口的容器內(nèi)，使其暴露于空氣24h以除去氯氣，按實(shí)施例1所建立的MIP-ELISA法測定醫(yī)院污水中的內(nèi)毒素含量，并與標(biāo)準(zhǔn)方法鱟試劑法、icELISA法進(jìn)行比較。MIP-ELISA法的檢測結(jié)果為99.31 ± 1.86ng/mL，標(biāo)準(zhǔn)鱟試劑法的檢測結(jié)果為102.57±3.53ng/mL，icELISA法的檢測結(jié)果為104.72±4.92ng/mL，三種方法測定的醫(yī)院污水中的內(nèi)毒素含量結(jié)果接近(P > 0.05，測定結(jié)果無顯著性差異，圖4)，說明MIP-ELISA法不僅可檢測江水和自來水中低濃度的內(nèi)毒素，對醫(yī)院污水中高濃度的內(nèi)毒素也可準(zhǔn)確檢測。而icELISA由于受檢測靈敏度限制，只能檢測醫(yī)院污水中高濃度的內(nèi)毒素，對江水和自來水中低濃度的內(nèi)毒素則無法檢測，因此MIP-ELISA法提高了 icELISA方法的靈敏度。
【權(quán)利要求】
1.一種痕量內(nèi)毒素的快速檢測方法，包括以下步驟: 步驟一、合成人工抗體:內(nèi)毒素與多巴胺按質(zhì)量濃度比為1: 2-8的比例混合溶于PH8.0的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)緩沖溶液中，將混合溶液加于96孔酶標(biāo)板孔內(nèi)，在室溫下暴露于空氣中反應(yīng)24-72小時；使用含3%乙酸和0.1 %十二烷基硫酸鈉的水溶液反復(fù)震蕩洗滌酶標(biāo)板2-8次，每次20-60min，再使用三蒸水震蕩洗滌2_8次，即可得到附著于酶標(biāo)板表面的MIP ； 步驟二、檢測樣品(試劑盒檢測)，包括以下步驟a至d: a.向上述含有MIP的酶標(biāo)板孔內(nèi)加入ΙΟΟμL待測樣品，20-40°C作用l_5h后以磷酸鹽緩沖液洗滌2-8次； b.將兔抗內(nèi)毒素多克隆抗體用抗體稀釋液以1: 100?1: 2000進(jìn)行稀釋，然后每孔加入100 μ L，20-40°C作用l_5h后以磷酸鹽緩沖液洗滌2_8次； c.將辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體用抗體稀釋液以1: 500?1: 5000進(jìn)行稀釋，然后每孔加入ΙΟΟμ L，20-40°C作用l_5h后以磷酸鹽緩沖液洗滌2_8次； d.每孔加入化學(xué)發(fā)光試劑200μ L，立即使用多功能酶標(biāo)儀檢測發(fā)光強(qiáng)度，其中化學(xué)發(fā)光試劑由摩爾濃度為5Χ 10_4mol/L的魯米諾(Luminol)、4X 10_3mol/L的過氧化氫(H2O2)及4X10_4mol/L的對碘苯酚(PIP)組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的痕量內(nèi)毒素的快速檢測方法，其特征在于，在步驟二中，a步驟中所述的磷酸鹽緩沖液是按以下方法配制成的pH = 7.4的緩沖液:氯化鈉Sg，氯化鉀0.2g，磷酸氫二鈉1.44g，磷酸二氫鉀0.24g，0.005 %吐溫20100 μ L，三蒸水定容至1000mL。
3.一種痕量內(nèi)毒素的快速檢測試劑盒，其特征在于，該試劑盒人工抗體的96孔酶標(biāo)板、內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液、作為一抗的兔抗內(nèi)毒素多克隆抗體、作為二抗的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體和化學(xué)發(fā)光試劑組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的痕量內(nèi)毒素的快速檢測試劑盒，其特征在于，所述的化學(xué)發(fā)光試劑由 5X l(T4mol/L 的魯米諾(Luminol)、4X l(T3mol/L 的過氧化氫(H2O2)及4X l(T4mol/L的對碘苯酚(PIP)組成。
【文檔編號】G01N33/535GK104048953SQ201310075844
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2013年3月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月11日
【發(fā)明者】呂斌, 黃正, 鐘劍, 張夢, 石云 申請人:華中科技大學(xué)