專利名稱：特異地檢測內(nèi)毒素的試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種特異地檢測內(nèi)毒素的試劑，它含有固定在不溶載體上的內(nèi)毒素敏感的凝血因子，一種包括該試劑的內(nèi)毒素檢測藥盒，一種用所說試劑特異檢測內(nèi)毒素的方法和一種制備所說試劑的工藝方法。
采用鱟血細(xì)胞(變形蟲狀細(xì)胞)提取物(即鱟變形蟲狀細(xì)胞溶胞產(chǎn)物，以下簡稱為溶胞產(chǎn)物)檢測內(nèi)毒素(以下叫作Et)的方法，稱為鱟試驗(yàn)，已為公眾所知。參予檢測的溶胞產(chǎn)物的反應(yīng)，叫作鱟反應(yīng)。鱟試驗(yàn)具有高檢出敏感性，而且廣泛地用于藥物、水測定法、臨床試驗(yàn)等熱原檢查工作中。鱟試驗(yàn)基于痕量內(nèi)毒素存在下溶胞產(chǎn)物的凝結(jié)作用。最近的生物學(xué)研究闡明了這樣一個(gè)事實(shí)，即鱟反應(yīng)由幾種凝結(jié)因子的分步活化組成(參見TakanoriNakamura等，NIPPONSAIKINGAKU.ZASSI，38，781-803(1983)。
所說的鱟反應(yīng)現(xiàn)參照

圖1就由Tachypleustridentatus得到的溶胞產(chǎn)物詳細(xì)說明如下。在溶胞產(chǎn)物中加入Et時(shí)，在該溶胞產(chǎn)物中存在的Et-敏感因子(內(nèi)毒素敏感的因子，分子量為123000)被活化。此活化的因子C在特定位點(diǎn)使因子B(分子量;64000)有限水解生成活化的因子B。此活化的因子B使預(yù)凝固酶(分子量;54000)活化，將其轉(zhuǎn)化成凝固酶。此凝固酶使凝固原(Coagulogen，凝血蛋白，分子量19723)在由二硫鍵交聯(lián)的環(huán)中，即在…Arg18和Thr19…以及…Arg46和Gly47…之間的特定位點(diǎn)處有限水解，釋放出由H-Thr19…Arg46-OH所表示的肽C(28氨基酸殘基)，同時(shí)將其余部分轉(zhuǎn)化成凝固素凝膠。因此鱟反應(yīng)由一系列反應(yīng)(由Et引起的級聯(lián)反應(yīng)，以下叫作因子C系統(tǒng)反應(yīng))組成。
上面提到的溶胞產(chǎn)物的級聯(lián)反應(yīng)，不僅由Et，而且還由(1→3)-B-D-葡聚糖(以下簡叫β-葡聚糖)所誘發(fā)。就是說，圖1中的因子G被β-葡聚糖活化，而活化的因子G將預(yù)凝固酶轉(zhuǎn)化成凝固酶，而且凝固酶在凝固作用時(shí)生成凝固素凝膠，其作用方式與上述的由β-葡聚糖引起的級聯(lián)反應(yīng)(以下叫作因子G系統(tǒng)反應(yīng))中的相同。
通過所說的級聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生的凝固酶，也能夠使單獨(dú)地加入該反應(yīng)體系中的合成底物(例如叔丁基羰基-亮氨酸酰-甘氨酸-精氨酸-N硝基-N-苯胺)(Boc-Leu-Ely-Arg-PNA)的酰胺鍵水解，釋放出對硝基苯胺。因此，Et或β-葡聚糖可以通過測量所釋放出的對硝基苯胺之光吸收的方法定量測定。
有人提議使用已除去因子G的溶胞產(chǎn)物，只根據(jù)因子C體系特異測定Et，參見ObayashiT.等在<Clin.Chim.Acta>，149，55-65(1985)中所披露的內(nèi)容。
但是，此方法涉及極其復(fù)雜的制備元因子G體系的操作，其中包括采用其上固定有葡聚糖硫酸鹽親和載體的親和色譜法分步分離溶胞產(chǎn)物以便除去β-葡聚糖敏感的因子(即凝血因子G)，以及重新構(gòu)成因子C、因子B和預(yù)凝固酶。采用得到的無因子G的體系和凝固酶的合成底物進(jìn)行Et的特異檢測。人們還知道，同時(shí)使用Et-敏感的因子(即因子C)和活化的因子C的合成肽底物(例如叔丁氧基羰基-纈氨酰-脯氨酰-精氨酸-對硝基-N-苯胺，以下用Boc-Val-Pro-Arg-PNA表示)作特異的Et檢定，參見NakamuraT.等在<Eur.J.Biochem.>，154，511-521(1986)中所述。此技術(shù)也需要分離和提純的一些復(fù)雜操作。
上面提到明鱟檢測技術(shù)，基于使用部分或全部溶胞產(chǎn)物的液相反應(yīng)體系。
待分析的樣品常常含有干擾鱟試驗(yàn)的各種物質(zhì)，因而需要作預(yù)處理使干擾物質(zhì)失活或除去。例如，重金屬或鹽容以高濃度存在時(shí)，則會強(qiáng)烈干擾此鱟反應(yīng)，故不能獲知準(zhǔn)確的Et水平。在這些情況下，必須用蒸餾水將樣品稀釋到不產(chǎn)生干擾時(shí)為止，但是可以允許的稀釋程度受此鱟試驗(yàn)的最低檢出限所限制)。此外，還時(shí)常遇到這樣一些情況，即樣品呈混濁或有色狀，甚至加以稀釋之后仍不能分析。血樣或乳樣品需要一些復(fù)雜的預(yù)處理。因此，在這些情況下分析Et涉及有待解決的許多問題。
除了液相反應(yīng)體系之外，人們還知道采用將溶胞產(chǎn)物固定在聚苯乙烯制微板的孔中的一種體系，參見<J.Clin.Microbiol.>，17，1050-1053(1983)。但是，由于不僅此Et-敏感的凝血因子，而且β-葡聚糖敏感的因子都同時(shí)被固定，所以此體系也不能用于Et特異檢測。還有人提出一種試紙，它是用溶胞產(chǎn)物和合成底物浸潤后干燥制成的(JP-A-62-134563，短語“JP-A”在本文中指審查后公開的日本專利申請)。但是，由于用溶胞產(chǎn)物浸漬過的濾紙未經(jīng)洗滌，所以其中含有溶胞產(chǎn)物的全部成分，因而不適于Et特異檢測。
本發(fā)明的目的之一在于提供特異檢測內(nèi)毒素用試劑，其中包含由鱟變形蟲狀細(xì)胞得到的、固定在不溶載體上的內(nèi)毒素敏感的因子，該試劑與內(nèi)毒素具有特異反應(yīng)而與β-葡聚糖不反應(yīng)，借以能夠在高度可靠性條件下定性和定量測內(nèi)毒素。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種包括上面提到試劑的特異檢測內(nèi)毒素的藥盒。
本發(fā)明的又一目的在于提供一種經(jīng)過簡易操作制備上面提到的試劑的方法。
本發(fā)明的進(jìn)一步目的在于提供一種利用上面提到的試劑簡易而快速檢測內(nèi)毒素用方法。
就是說，本發(fā)明提供出一種用于特異檢測內(nèi)毒素的試劑，其中包括一種不溶性載體，該載體上至少固定有一種鱟變形蟲狀細(xì)胞源的內(nèi)毒素敏感的因子而且與β-葡聚糖不顯示反應(yīng)。
本發(fā)明還提供出于用特異檢測內(nèi)毒素的干式分析元件，其中包括一種試劑層，此試劑層含有固定在其上至少一種Et敏感因子的不溶性載體以及活化的Et敏感因子的底物或凝固酶的底物。
本發(fā)明還提供出一種特異檢測內(nèi)毒素的藥盒，其中至少包括(a)上面提到的試劑和(b)活化的內(nèi)毒素敏感因子的底物或凝固酶底物。
本發(fā)明進(jìn)一步提供這樣一種特異檢測內(nèi)毒素的方法，其中包括將樣品溶液與上面提到的試劑接觸，使樣品中的內(nèi)毒素至少與所說試劑中的內(nèi)毒素敏感的因子反應(yīng)，并且測定底物變化;或者提供這樣一種特異檢測內(nèi)毒素的方法，其中包括將樣品溶液與上面提到的試劑接觸，使樣品溶液與不溶性載體分離，必要時(shí)洗滌不溶性載體，進(jìn)一步使不溶性載體單獨(dú)與鱟變形蟲狀細(xì)胞溶胞產(chǎn)物接觸或同時(shí)與鱟變形蟲狀細(xì)胞溶胞產(chǎn)物和凝固酶底物接觸，并且測定所說溶胞產(chǎn)物或所說底物變化。
本發(fā)明而且還提供出制備上述試劑用的一種工藝方法，其中包括在不溶性載體上物理或化學(xué)固定鱟變形蟲狀細(xì)胞源的至少一種內(nèi)毒素敏感因子。更具體講，本發(fā)明提供出(1)一種工藝方法，其中包括使鱟變形蟲狀細(xì)胞溶胞產(chǎn)物或含它的液體與一種不溶性載體接觸，此載體可特異吸附內(nèi)毒素敏感因子而不能吸附(1→3)-β-葡聚糖敏感因子，以便在該不溶性載體上吸附在所說的溶胞產(chǎn)物中的至少一種Et-敏感因子，從載體上除去殘留的溶胞產(chǎn)物或液體得到一種基本上不含β-葡聚糖敏感因子并且與Et有特異反應(yīng)能力的不溶性載體;
(2)一種工藝方法，其中包括處理鱟變形蟲狀細(xì)胞溶胞產(chǎn)物除去(1→3)-β-D-葡聚糖敏感的凝血因子得到一種溶胞產(chǎn)物，此溶胞產(chǎn)物基本上不含(1→3)-β-D-葡聚糖敏感因子但是含內(nèi)毒素敏感因子;使得到的溶胞產(chǎn)物與不溶性載體接觸，以便物理或化學(xué)固定至少一種內(nèi)毒素敏感因子于所說的不溶性載體上;以及(3)一種工藝方法，其中包括向鱟變形蟲狀細(xì)胞溶胞產(chǎn)物中加入(1→3)-β-葡聚糖敏感因子活化抑制劑，然后使所說的溶胞產(chǎn)物與不溶性載體接觸，以便將所說的溶胞產(chǎn)物中至少一種內(nèi)毒素敏感因子化學(xué)或物理固定在所說的不溶性載體上。
附圖1是說明鱟試驗(yàn)機(jī)理的流程圖。
本發(fā)明的試劑包含其上至少固定有一種Et敏感因子的不溶性載體使該因子特異地與Et反應(yīng)并且設(shè)計(jì)得在樣品中可能存在的β-葡聚糖和圖1中的因子G(術(shù)語“因子G”下文中有時(shí)用作β-葡聚糖因子)之間不引起反應(yīng)。這樣一來，Et可以由適當(dāng)?shù)牡孜锏淖兓右远繙y定。在此意義上，因子G可以存在于本發(fā)明的試劑之中，只要按照本發(fā)明工藝方法3用因子G活化抑制劑等抑制凝血因子G的活化即可。欲加使用的因子活化抑制劑包括于WO90/02951中描述的多聚葡糖苷和JP-A102064中所述的抗體等等。
必須的條件是本發(fā)明的試劑應(yīng)當(dāng)含有至少一種固定在其不溶性載體上的Et-敏感因子(即因子C)。除了因子C之外，此試劑還含有參預(yù)由因子C的內(nèi)毒素誘發(fā)的活化作用而觸發(fā)的級聯(lián)反應(yīng)的一種或多種其它成分，即因子B、預(yù)凝固酶和凝固原。
可以用于本發(fā)明的不溶載體，用Et-敏感因子固定化法(無論用物理方式或化學(xué)方式)、Et分析法、試劑結(jié)構(gòu)法等等加以適當(dāng)選擇。
術(shù)語“固定化”在本文中使用時(shí)是指假如以Et敏感因子為例，定將Et敏感因子用物理或化學(xué)結(jié)合在不溶性載體之上，從而使所說的Et-敏感因子基本上不溶于Et檢測液體反應(yīng)體系中而基本上維持其對Et的反應(yīng)活化。
Et-敏感因子等在不溶載體上的物理或化學(xué)結(jié)合，可以按酶固定化的已知傳統(tǒng)技術(shù)進(jìn)行，例如按在KOTEIKAKOSO，107頁，Kodansha株氏會社(1975)和OYOKOSOGAKU，28-31頁，Kodansha株氏會社(1980)上所述的方法進(jìn)行。本文所說的物理結(jié)合，是指通過將不溶載體和內(nèi)毒素敏感因子等培養(yǎng)給定時(shí)間的方法產(chǎn)生的結(jié)合。此方法在上面引證的文獻(xiàn)中以“物理吸附”或“離子結(jié)合”的形式提到過。本文所說的化學(xué)結(jié)合是指因采用交聯(lián)劑或通過在不溶性載體和Et-敏感的凝血因子等之間因其化學(xué)活化的官能團(tuán)的反應(yīng)而形成的不可逆結(jié)合。這些化學(xué)結(jié)合法在上面引證的文獻(xiàn)中以“共價(jià)結(jié)合”的形式提到過。
在不溶性載體上固定至少一種Et-敏感因子的方法，取決于載體的種類。本發(fā)明的固定化方法包括(1)一種方法，其中包括使鱟變形蟲狀細(xì)胞溶胞產(chǎn)物或含此產(chǎn)物的液體，與特異吸附至少一種Et-敏感因子但是卻不能吸附(1→3)β-葡聚糖敏感因子的不溶性載體接觸，以便獲得一種其上物理吸附有至少一種Et-敏感因子而且基本上不含(1→)-β-葡聚糖敏感因子的不溶性載體，使之能夠與Et特異反應(yīng)(工藝方法1);(2)一種方法，其中包括處理鱟變形蟲狀細(xì)胞溶胞產(chǎn)物以除去β-葡聚糖敏感因子，得到含至少一種內(nèi)毒素敏感因子但基本上不含β-葡聚糖敏感因子(因子G)的溶胞產(chǎn)物，并且使此溶胞產(chǎn)物與不溶性載體接觸以便將至少一種Et-敏感因子物理固定或化學(xué)(共價(jià)結(jié)合)固定在所說載體上(工藝方法2);以及(3)一種方法，其中包括向鱟變形蟲狀細(xì)胞溶胞產(chǎn)物中加入β-葡聚糖敏感因子活化抑制劑，并且使此溶胞產(chǎn)物與不溶性載體接觸，以便在所說載體上物理固定或化學(xué)固定至少一種Et-敏感因子(工藝方法3)。Et敏感因子的固定化，可以按照和上面提到過的同樣方式以物理或化學(xué)法進(jìn)行。
在工藝方法1中使用的載體，包括聚酰胺型不溶性載體(包含一種主鏈的結(jié)晶線型高聚物，其中各單元通過酸的酰胺鍵互相結(jié)合而且是用二胺和二羧酸的縮聚法或者用w-氨基酸或其相應(yīng)的內(nèi)酰胺，如尼龍6和尼龍66的縮聚法合成的)和纖維素型不溶性載體，如纖維素，纖維素酯(如乙酸纖維素和硝酸纖維素)，具有氨乙基、溴乙?；?、二氧磷基、羧甲基或類似取代基的纖維素衍生物以及羧甲基纖維素的酰肼衍生物。Et-敏感因子等在這些載體上的固定化可以按這樣一種方法進(jìn)行，即使溶胞產(chǎn)物或含溶胞產(chǎn)物的液體(如溶胞產(chǎn)物、葡聚糖、二份金屬鹽和各種緩劑的混合物)與所說載體在適于Et-敏感因子等在其上被吸附的條件下，例如0～40℃溫度下接觸幾秒鐘至幾天的時(shí)間?？梢岳萌魏我阎墓桃灰航佑|手段。例如使溶胞產(chǎn)物通過濾紙類載體或使之通過裝填有載體顆粒的柱，將溶胞產(chǎn)物置于微板狀載體的孔中經(jīng)過預(yù)定時(shí)間后放出溶胞產(chǎn)物，或者將任意形狀的載體加到溶胞產(chǎn)物中并振蕩此混合物或使該混合物放置給定時(shí)間后用通常的固液分離手段(如過濾、離心、吸濾和傾瀉)除去溶胞產(chǎn)物。
加入葡聚糖于待接觸的溶胞產(chǎn)物之中，增進(jìn)Et-敏感因子的吸附作用。欲加入的葡聚糖的平均分子量，一般為5000～5，000，000，優(yōu)選10，000～100，000。
能夠用于工藝方法2和3中并通過接觸能夠簡單地將Et-敏感因子固定在其上的不溶載體，包括聚酰胺、纖維素、聚苯乙烯、聚丙烯和二氧化硅型不溶性載體;以及通過化學(xué)手段將Et-敏感因子等固定在其上的那些不溶性載體，其中包括聚酰胺、纖維素、瓊酯糖、聚丙烯酰胺、葡聚糖和乙烯基聚合物類(包含甲基丙烯酸縮水甘油酯和乙二醇二甲基丙烯酸酯的多孔性共聚物)。所說的化學(xué)固定化法，按照所用載體的種類從已知的化學(xué)固定法中適當(dāng)選擇，已知的化學(xué)固定法包括例如由利用載體的芳氨基的重氮偶合反應(yīng)組成的重疊化法、用CNBr活化載體的羥基然后使之與肽結(jié)合的CNBr法、使載體的肼衍生物等經(jīng)歷肽結(jié)合的酸疊氮化物法、包括利用載體的活性官能團(tuán)(如鹵素)使蛋白質(zhì)烷基化的烷基化法以及包括用對游離氨基有活性的交聯(lián)劑(如戊二醛)連接載體和蛋白質(zhì)的游離氨基的交聯(lián)法等。例如，甲酰基-Cellulofine(它是具有導(dǎo)入到其中的甲?；囊环N纖維素凝膠載體)或FMP活化的Cellulofine(它是具有導(dǎo)入到其中的FMP的Cellulofine，F(xiàn)MP是2-氟-1-甲基吡啶鎓甲苯-4-磺酸的縮寫)，兩種物質(zhì)均由Seikagaku公司出售，被用作載體;而且該載體的甲?；唤Y(jié)合到Et-敏感因子等的氨基上，或者Et-敏感因子等的FMP和氨基或硫醇基經(jīng)過取代反應(yīng)生成促胺或硫醚鍵合。
利用方法2或3的吸附作用制備具有固定在其上的Et-敏感的凝血因子之載體時(shí)，可以按照與針對方法1所述基本相同的方式進(jìn)行在不溶性載體和溶胞產(chǎn)物或無β-葡聚糖敏感因子的溶胞產(chǎn)物之間的接觸操作。
即使在使用能夠特異吸附和固定Et-敏感因子的不溶性載體時(shí)，可以采用上面提到的無β-葡聚糖敏感因子的溶胞產(chǎn)物通過化學(xué)手段進(jìn)行固定化操作。
可以在本發(fā)明中使用的不溶性載體，可以呈任何形式，例如膜狀(濾紙、空心纖維、管或薄膜等等)、粒狀、膠乳狀、片狀、粒狀和微板狀。
所說的溶胞產(chǎn)物包括按通常方式由鱟(例如LimulusPolyphemus，Tachypleustridentatus，Tachypleusqiqas和Carcinoscorpiusrotundicauda)的血淋巴制備的變形蟲狀細(xì)胞的提取物(參見例如J.Biochem.，80，1011-1021，(1976))。在方法2中，可以按任何已知方法對溶胞產(chǎn)物進(jìn)行處理，以便制備基本上不含β-葡聚糖敏感因子(因子G)的無β-葡聚糖敏感因子的溶胞產(chǎn)物。例如，用凝膠過濾法、使用肝素或葡聚糖固定化的親水和吸附劑的親合色譜法，使用具有磺丙基的離子交換樹脂的離子交換色譜法和類似的方法將溶胞產(chǎn)物加以分級分離，參見JP-B-3-23869(本文中所用的術(shù)語“JP-B”是指經(jīng)審查公告的日本專利申請);NakamuraT.等的Eur.J.Biochem.，154，511-521(1986);Clin.Chim.Acta.，149，55-65(1985)和JP-A-3-75565中所述。
能夠按本發(fā)明加以檢測的樣品不受具體限制，而且本發(fā)明的Et檢測法可以用于需要檢查其Et含量或Et是否存在的任何樣品;例如可以檢測的生物樣品、藥物和醫(yī)用水。本發(fā)明的Et檢測法特別適用于混濁或含顏料的樣品，例如可以直接檢測乳汁和尿液而無需作任何專門的預(yù)處理。
利用本發(fā)明試劑的Et檢測法，是通過測定由Et造成的因子C的變化，或由Et活化因子C所觸發(fā)的因子C的變化轉(zhuǎn)換為所涉及的酶反應(yīng)所產(chǎn)生的底物變化來完成的。可以在本發(fā)明中使用的底物不受具體限制;適用的底物實(shí)例包括合成肽底物和天然底物，例如凝固原。
上面提到的因子C的變化，是在Et作用下因子C變成活化的因子C的變化;而因子C體系的變化，是通過因子C的鏈?zhǔn)交罨?，?jīng)由因子B和預(yù)凝固酶所產(chǎn)生的級聯(lián)反應(yīng)內(nèi)的變化。因此測定因子C體系的變化就意味定量或定性測定如此活化的因子中任何因子的酶活性。
可以按已知方式完成使用合成肽底物的測定。例如，可以利用具有已知可檢測基因的合成肽。可以作為合成肽底物使用的，是在下列文獻(xiàn)中記載的那些US4188264、JP-B-59-19532、JP-B61-54400、JP-B-63-26871、JP-B3-66319、JP-B-3-11760、JP-B-4-40340、JP-A-58-77850、JP-A-62-289767、JP-A-3-220456、WO79/00602、WO82/02382、EP-A-0000063、EP-A-0018112等等。典型實(shí)例包括活化的因子C的底物，例如Boc-Val-Pro-Arg-PNA和Boc-Leu-Gly-Arg-PNA;凝固酶的底物，例如合成肽(如甲氧-羧基-D-六氫酪氨酰-Gly-Arg，N-端基被保護(hù)的Leu-Gly-Arg，Ile-Glu-Ala-Arg等等)，其中C-端基精氨酸的羰基被顯色殘基所取代[例如對硝基苯胺、對-(N，N-二乙氨基)苯胺、對-(N-乙基-N-β-羥乙基)苯胺等]，或被發(fā)熒光的殘基所取代(如F-氨甲基香素等)或被發(fā)光的殘基或通過酰氨鍵含的氨所取代。活化的因子C、凝固酶或其它因子的酰胺酶活性，可通過測定上述因子對合成肽底物的作用所形成的反應(yīng)產(chǎn)物加以測量。更具體，講本發(fā)明中所用的Et檢測包括;(A)一種涉及使用活化因子C的肽合成底物的方法和(B)一和涉及使用凝固酶的肽合成底物的方法。按照方法(A)，使含Et的樣品與本發(fā)明試劑接觸以活化因子C，然后使活化的因子C與所說的底物在或無樣品液(A-1)存在下接觸，或者樣品同時(shí)與試劑和底物接觸，使因子C活化并且該活化的因子C同時(shí)使底物分解(A-2)。在方法(B)的情況下，必要的條件是;所說的反應(yīng)體系不僅應(yīng)當(dāng)含有固定的因子C而且還應(yīng)當(dāng)含有因子B和預(yù)凝固酶使之通過所說的級聯(lián)反應(yīng)誘發(fā)預(yù)凝固酶的活化。這些其它的因子既可以通過分部分離單獨(dú)制備的那些，也可以是從中除去因子G的溶胞放產(chǎn)物或者其中的因子G基本上被阻止活化的溶產(chǎn)物。在樣品從不溶性載體上除去的情況下，因子被Et活化后使活化的因子C與其它因子接觸，此時(shí)該其它因子可以是像含因子G的普通溶產(chǎn)物。因此，方法(B)包括方法下述的方法(B-1)、(B-2)和(B-3);(B-1)使含Et的樣品與本發(fā)明試劑接觸以便活化因子C并且在不從此體系中除去樣品的條件下使活化的因子C與經(jīng)分部分離的其它因子，或者與其中因子G被阻止活化的溶胞產(chǎn)物和底物接觸;(B-2);使樣品和本發(fā)明的試劑接觸活化因子C，然后將產(chǎn)品從該重金屬中移出，將活化的因子C與溶胞產(chǎn)物接觸;(B-3);使樣品同時(shí)與所說試劑的分部分離的其它因子或其中的因子G被止活化的溶胞產(chǎn)物接觸，使預(yù)凝固酶經(jīng)歷級聯(lián)反應(yīng)的活化作用與底物因凝固酶的分解作用同時(shí)發(fā)生。
使所說的合成肽底物如此經(jīng)歷由活化的因子C或其它的活化的因子(如凝固酶)造成的分解作用。必要時(shí)，分解產(chǎn)物可以進(jìn)一步經(jīng)歷向其它染料等的轉(zhuǎn)化過程。如此釋放出的染料、熒光物質(zhì)。發(fā)光物質(zhì)或氨借助于分光光度計(jì)、熒光光度計(jì)、化學(xué)發(fā)光分析儀、氨檢測電極等加以測定(參見JD-A-62-148860或JP-A-3-75565)。必要時(shí)，可以通過將測得值與基于標(biāo)準(zhǔn)Et制劑的測量結(jié)果進(jìn)行比較的方法測定或檢出Et。
在上述方法A-2或B-3中，所說的試劑可以呈所謂干式化學(xué)分析法作Et-專門分析用的干型分析元件形式，其中包括一種試劑層，此試劑層中包含;其上至少固定有一種Et敏感因子的不溶性載體，一種經(jīng)活化的Et敏感因子的底物或凝固酶的底物，以及必要時(shí)還有一種進(jìn)行因子體系反應(yīng)所必須的其它部分，其中包括由鱟變形蟲狀細(xì)胞衍生得到的成分、二份金屬鹽、緩沖液等等。
此干型分析元件可以呈任何書已知的形式而且可以按已知方法制備，例如按US-3，992，158、4，042，335和4，258，001，JP-A-55-164356、JP-A-62-134563和Clin、chem，24，1343(1978)等之中所方法。除了試劑層之外，該元件還可以包括擴(kuò)展層，顯色層、檢測層、阻光層、膠粘劑層、過濾層、吸水層、膠底層、裝釘層和類似的已知層。這些層可以層疊在透明性底物上。本發(fā)明的干型分析元件優(yōu)選包括透明底層，例如聚(對苯二甲酸二乙酯)膜，其上述的試劑層面且還有顯色層。使用此干式分析元件的Et檢測可以如下進(jìn)行;將樣品溶液滴在該元件的顯色層上，在大約37℃下保濕此元件約30分鐘，同反射分光計(jì)從底物側(cè)測定顏色變化。所說的顯色層可以含二氧鈦?zhàn)鳛榉瓷鋵印?br> 可以使用凝固原作為凝固酶的底物來代替上面提到的合成肽底物。在這種情況下，可以通過目測或光學(xué)檢測由酶反應(yīng)形成的凝度來測定因子C體系的變化，參見Stanley.W.Watson等編<EndotoxinsandTeirDetectionwifhtheLimulusAmoebocyteLysateTest>，161-171頁，AlanR.Liss，Inc.(1982);chem.Pharm.Bull，36(8)，3012-3019頁(1988)和J.parenteralsci.Technol，40(6).284-286頁(1988)。
用本發(fā)明的試劑進(jìn)行Et檢測時(shí)，必要的條件是;反應(yīng)當(dāng)含活化凝血因子C有效的二價(jià)金屬鹽?？梢詫⒋硕r(jià)金屬鹽加到底物溶液中或持分析的樣品中等，也可以事先將其吸附在不溶性載體上。適用的二價(jià)金屬鹽實(shí)例，包括鎂、鈣、鍶、等堿土金屬的氫鹵酸鹽，氯化物或硫酸鹽。
按照本發(fā)明，可以在不降低其活性的條件下，將溶胞產(chǎn)物中的Et敏感因子物理或化學(xué)固定在不溶性載體上，固定有Et敏感因子的這種載體提供了一種與內(nèi)毒素特異反應(yīng)的試劑。
本發(fā)明提供出一種含有在其上固定有內(nèi)毒素敏感凝血因子的不溶性載體的，特異性地分析內(nèi)毒素用試劑。含有各種干擾反應(yīng)的物質(zhì)的樣品，可以用試劑測定而不涉及像傳統(tǒng)的方法中所需的任何復(fù)雜的預(yù)處理。此外，本發(fā)明的試劑長時(shí)間穩(wěn)定地保持其對內(nèi)毒素的靈敏度。
現(xiàn)在參照實(shí)施例更詳細(xì)地說明本發(fā)明，但是應(yīng)當(dāng)想到本發(fā)明并不受其限制。
實(shí)施例12.7升Tachypleustridentatus的血淋巴在4℃和1500轉(zhuǎn)/分(rpm)下離心10分鐘，將重60克的沉積物(變形蟲狀細(xì)胞)分成20克三份，每份中加入200ml0.02Mtris-hcl緩沖液(PH8.Q)，將混合物在均化器中(由KinematicaCo制造的產(chǎn)品，商品名是“polytronRPTIO”)充分均化后，萃取，然后在冷卻下于10000×G下離心30分鐘，得到550ml上清液(溶胞產(chǎn)物)。
將一份2ml的溶胞產(chǎn)物在室溫下于5秒內(nèi)通過尼龍濾膜(NalgeCo制造的產(chǎn)品，商品名為“NalgenSyringeFilter”，直徑25mm，孔徑0.20μm)，此尼龍濾膜用通過50ml0.02Mtris-HCl緩沖液(PH0.8)的方法洗滌，得到一種其上吸附了Et敏感的凝血因子的尼龍濾膜(以下叫作吸附有Et敏感凝血因子的尼龍濾膜)。
制備了四塊吸附了Et敏感因子的尼龍濾膜，每塊切成3mm×3mm方塊。將該四塊尼龍濾膜分別放入四支試管中，在其中三支內(nèi)各加入0.1ml蒸餾水(以下記作DW)、0.1mlEscherichiaColi0lll∶B4源的Et(由SigmaCo.出售的“Westphal”型)(30pg/管)或0.1ml按下法制備的β-葡聚糖。在第四支試管中加入濃度為上述樣品中二倍的0.05mlEt和0.05mlβ-葡聚糖，使其各自的最終濃度分別為30ng/管和1ng/管。向各試管中加入0.1ml0.3Mtris-HCl緩沖液(PH8.0)，其中含有0.04MMgCl和0.1ml2.2mMBoc-Val-Pro-Arg-PNA，然后在37℃下保溫30分鐘，在保溫的同時(shí)每5分鐘用渦流攪拌機(jī)攪拌10秒鐘。保溫30分鐘后，加入0.3ml1.2M乙酸終止反應(yīng)，在405nm下測量所釋放出對硝基苯胺的光吸收，以便檢查本發(fā)明試劑的反應(yīng)性。得到的結(jié)果列于表1之中。
β-葡聚糖的制備遵循了WO90/02951中描述的方法。將1克Curdlan(Wako化學(xué)公司出售品)懸浮在大約100ml 5nM NaOH水溶液中用5202PZT型超聲波儀(Sonicator ，東京Otake Seisakusho制造品)在20KHz和80瓦下和冰冷卻下超聲處理12分鐘。得到的液體用5M NaOH溶液稀釋到最終濃度為0.3M。形成的溶液用凝膠滲透色譜(GPC柱兩支“TSK凝膠G3000PWXL”一支“G2500PWXL”;移動相0.3MNaOH水溶液;流動速度0.5ml/分)分離后，再次色譜分離收集分子量為216000的組份，制備GPC分部分離純化的β-葡聚糖制劑。
表1樣品反應(yīng)活性Et0.384β-葡聚糖0.000Et+β-葡聚糖0.384從表1看出利用使溶胞產(chǎn)物通過包括在聚酰胺膜中的尼龍濾膜的方法制備的，其上吸附有Et敏感因子的不溶性載體，能夠特異測定Et而不受β-葡聚糖干擾。換句話說，包含本發(fā)明之不溶性載體的試劑，據(jù)證明基本不含因子G。
實(shí)施例2將1升LimulusPolyphemus的血淋巴在4℃和1500rpm下離心10分鐘，收集沉積物(變形蟲狀細(xì)胞)重19克。向沉積物中加入190ml0.02M的tris-HCl緩沖液(PH8.0)，然后在“PolytronRPTIO”型均化器中均化和提取。均化液在10000×G條件下離心30分鐘同時(shí)冷卻，得到170ml上清液(溶胞產(chǎn)物)。
將此溶胞產(chǎn)物與等體積15%葡聚糖(分子量40000)水溶液混合(形成的混合物以下叫作LD混合物)。按下述方式制備三張吸附有Et敏感因子的膜。
室溫下于10秒鐘內(nèi)使8ml所說的LD混合物通過纖維素酯濾膜(“SterifilD-GS”，M∶llipore公司生產(chǎn)的商品名，用乙酸纖維素和硝酸纖維素的混合物制造，孔徑0.22μm，直徑47mm)，將濾膜通過50ml0.02Mtris-HCl緩(PH8.0)的方法充分洗滌，得到一種其上吸附有Et敏感因子的纖維素酯濾膜(以下叫作試劑A)。
試劑B和試劑C按照與試劑A相同的方式制備，但是分別使用了乙酸纖維素濾膜(“NalgenFilterware”，Nalgen公司生產(chǎn)產(chǎn)品的商品名，孔徑0.20μm，直徑47mm)和硝酸纖維濾膜(“NalgenFiterware”，Nalge公司產(chǎn)生產(chǎn)品的商品名，孔徑0.20μm，直徑47mm)。
將試劑A、B和C均切成邊長約5mm方塊，并將其分別放在每種試劑的四支試管中。在四支試管中的三支內(nèi)，加入0.1m1DW、0.1mlE.Coli0lll∶B4源的Et(10pg/試管)或0.1mlβ-葡聚糖(10ng/試管)。向其余的那支試管中加入上述樣品二倍濃度的0.05mlEt和0.05mlβ-葡聚糖，使各自的最終深度為10pg/試管和10ng/試管。向每支試管中加入0.1ml0.03M的Tris-HCl緩沖液(PH8.0)，其中含0.08MMgCl和0.1ml1.2mM的Boc-Val-Arg-PNa，然后在振蕩下于37℃保溫30分鐘。30分鐘保溫后，按次序依次加入各為0.5ml的0.04%亞硝酸鈉(0.48M鹽酸溶液)、0.3%氨基磺酸銨和0.07%N-1-萘亞乙基二胺二鹽酸鹽，使釋放出來的對硝基苯胺進(jìn)行重氮偶合。取出形成的有色液體，在545nm下測量光吸收以便檢驗(yàn)本發(fā)明試劑的反光活性。得到的結(jié)果列于表2之中。
表2反應(yīng)活性(△A545nm/30分鐘)試劑材料孔徑Etβ-葡聚糖Et+β-葡聚糖(μm)A纖維素酯0.220.4450.0010.445B乙酸纖維素0.200.4310.0000.431C硝酸纖維素0.200.4210.0000.428表2結(jié)果證明將溶胞產(chǎn)物通過纖維素濾膜(纖維素酯濾膜、乙酸纖維素濾膜或硝酸纖維素濾膜)的方法而制備的。在其上吸附有Et敏感因子的不溶性載體，不含因子G而且能夠在排除β-葡聚糖干擾的條件下進(jìn)行Et特異測定。
實(shí)施例3按照ObayashiT.等人在<Clin.Chim.Acta>，149，55-56頁(1985)上描述的方法，制備了不含因子G的BC組份如下將按實(shí)施例1制備的400ml溶胞產(chǎn)物加到一支其上固定有葡聚糖硫酸酯的SepharoseCL-6B柱中[5x23cm，徑含0.05MNaCl的0.02Mtris-HCl緩沖液(PH8.0)平衡過]，用含0.2MNaCl的0.02Mtris-HCl緩沖液(PH8.0)進(jìn)行提洗，從而分離因子G。然后用含0.45MNaCl的0.02Mtris-HCl緩沖液(PH8.0)進(jìn)行提洗，收集含圖1中所示組份B和C但是基本不含因子G的BC餾份。將40ml所獲得的BC餾份在減壓下濃縮至10ml，在濃縮液中加入0.23克EDTA四鈉鹽防止因子B和C活化。
在聚苯乙烯制的96孔培養(yǎng)微板(microplate)(“ToxipetPlate96F”，Seikagaku公司出品)的每個(gè)孔中放置0.3mlBC組份。4℃下放置3小時(shí)后，吸出殘面的液體，孔中加入0.3mlDW后再將其吸出。用DW的洗滌操作再重復(fù)兩次制備其上吸附有Et敏感因子的微板。
向此微板的每個(gè)孔中加入0.05ml DW、0.05ml Salmonella typhimurium源Et(Sigma公司出售的“Westphal”型品)(40pg/孔)或0.05mlβ-葡聚糖(40ng/孔)。向其余的孔中加入濃度均為上述樣品中的二倍的0.025ml Et和0.025mlβ-葡聚糖，使各自的最終濃度為40pg/孔和40ng/孔。向每個(gè)孔中加入含有0.03M MgSO4和0.025ml 2.0mM Boc-Leu-Gly-Arg-PNa的0.025ml 0.4M Tris-HCl緩沖液(PH8.0)。蓋上微板放在干型微板恒溫器中37℃下保溫30分鐘。依次加入各為0.05ml的0.04%亞硝酸鈉(1.0M鹽酸溶液)、0.03%氨基磺酸銨和0.07%N-1-萘亞乙基二胺二鹽酸鹽(14%N-1-甲基-2-吡咯烷酮溶液)，使如此釋放出的對硝基苯胺重氨偶合。使用微板讀出器在545nm下(參比波長630nm)測量所得到的有色溶液的光吸收，以便檢查本發(fā)明試劑的反應(yīng)活性。所得到的結(jié)果示于表3中。
表3樣品反應(yīng)活性(△A545nm-630nm/30分)Et0.831β-葡聚糖0.000Et+β-葡聚糖0.831從表3看出使用僅僅通過敏感使含Et敏感因子但基本上不含因子G的組份與聚苯乙烯接觸的方法制備的、其上吸附有Et敏感因子不溶性載體，可以特異分析Et而不受β-葡聚糖的干擾影響。
實(shí)施例4將10ml按實(shí)施例3制備的無因子G但含Et敏感因子的組份(BC組份)加到10克乙烯聚合物顆粒(Tosoh公司出售品，商品名為“TSK凝膠AF-FormylToyoperl650”)中，然后于4℃下攪拌過夜。此乙烯基顆粒用0.1M磷酸鈉緩沖液(PH7.1)充分洗滌，使Et敏感因子固定在此乙烯基聚合物粒(以下叫作固定有Et敏感因子的乙烯基聚合物粒)上。
在四支試管中每支內(nèi)各放入0.05克固定了Et敏感因子的乙烯基聚合物粒。在四支試管的三支內(nèi)各加入0.1mlDW和0.1mlSerratiamarcescens源Et(Sigma公司出售的“Westphal”型)。(20pg/管)或0.1mlβ-葡聚糖(70ng/管)向另一支試管加入深度均為上述樣品二倍的0.05mlEt和0.05mlβ-葡聚糖，使各自的最終濃度為20pg/試管和20pg/試管。向四支試管中各加入含0.002M CaCl2和0.1ml 1.2mM Boc-Leu-Gly-Arg-PNA的0.1ml 0.3M Tris-HCl緩沖液(PH8.0)。然后在振蕩下于37℃保溫30分鐘。按照與實(shí)施例1同樣方式使如此釋放出的對硝堪苯胺重氮偶合。取出有色的液體，在545nm下測量光吸收以檢查本發(fā)明試劑的反應(yīng)活性。所得到的結(jié)果匯于表4中。
表4樣品反應(yīng)活性(△A545nm/30分鐘)Et0.402β-葡聚糖0.000Et+β-葡聚糖0.402從表4看出其上固定有Et敏感因子的乙烯基聚合物載體能夠特異地檢測Et而不受β-葡聚糖的影響。
實(shí)施例5使用在實(shí)施例3中制備的吸附有Et敏感因子的聚苯乙烯微板，向一孔中加入0.05ml DW、0.05ml E.Coli 0114∶B4源Et(60pg/孔)的Et、0.05ml從健康人體無菌收集的乳汁、其中加有Et的使最終濃度為60pg/孔的0.05ml人乳或0.05ml其中加有Et和β-葡聚糖使各自的最終濃度為60pg/孔和60ng/孔的人乳汁。向各孔中加入0.05ml含0.01M MgCl2的0.2M tris-HCl緩沖液(PH8.0)，然后振蕩。蓋上微板后放入干型微板恒溫器中37℃下保溫30分鐘，使Et敏感因子活化。從孔中抽出殘留的液體，向孔中加入0.3mlDW后吸出之。用DW洗滌重復(fù)兩次。向每個(gè)孔中加入0.1ml含0.4mMBoc-Val-Pro-Arg-PNA的0.05Mtris-HCl緩沖液(PH8.0)，然后在37℃下保溫10分鐘。按照實(shí)施例3相同的方式使如此釋放出的對硝基苯胺重氮偶合。岡微板讀出器在545nm(參比波長630nm)測量所形成有色液體的光吸收，以便檢查本發(fā)明試劑的反應(yīng)活性。所得到的結(jié)果匯于下表5中。
表5樣品反應(yīng)活性(△A545nm-630nm/10分)Et0.746乳汁0.008乳汁+Et0.754乳汁+Et+β-葡聚糖0.754從表5可以看出即使是白色混濁的樣品(按照傳統(tǒng)的液相反應(yīng)體系不能作Et檢測的體系)可以按本發(fā)明用吸附有Et敏感因子的載體加以檢測，以簡單而特異地測定Et并不受β-葡聚糖影響。
用上面制備的試劑檢測患有革蘭氏陰性細(xì)胞感染引起的乳腺炎的奶牛乳汁時(shí)，測到相當(dāng)高的Et值。因此，用本試劑用Et檢查能夠診斷革蘭氏陰性菌的感染。
實(shí)施例6使用了按實(shí)施例3制備的吸附有Et敏感因子的聚苯乙烯微板。向每個(gè)孔中加入0.05ml DW、0.05ml E.Coli 0111∶B4源Et(50pg/孔)、0.05ml β-葡聚糖(50ng/孔)或0.05ml由0.025mlEt和0.025ml β-葡聚糖(其深度均為上述樣品中的二倍，使各自的最終深度為50pg/孔和50ng/孔)的混合物。向每個(gè)孔中加入0.05ml含0.01M MgCl2的0.2M tris-HCl緩沖液(PH8.0)，然后在37℃下培養(yǎng)30分鐘從而活化Et敏感因子。從孔中抽出殘留的液體后，加入0.3ml DW于孔中并將其吸收。用DW的洗滌操作重復(fù)兩次。向每個(gè)孔中加入0.2ml鱟變形蟲狀細(xì)胞溶胞產(chǎn)物(LAL)凝膠試劑(由Seikagakcl公司出售和Cape Cod公司生產(chǎn)的產(chǎn)品“Pyrotel”)，然后在37℃下培養(yǎng)30分鐘。在660nm下測量濁度的增加，以便檢查本發(fā)明試劑的反應(yīng)活性。得到的結(jié)果匯于下表6中。
表6樣品反應(yīng)活性(△A660nm/30分鐘)Et0.174β-葡聚糖0.002Et+β-葡聚糖0.176從表6可以看出固定有Et敏感因子的聚苯乙烯載體和LAL試劑并用，能夠方便地由LAL的膠凝(濁度增加)特異性地測定Et而不受β-葡聚糖的影響。
實(shí)施例7使用了按實(shí)施例3制備的吸附有Et敏感因子的聚苯乙烯微板。向一孔中各加入0.05ml DW、Salmonella abortus同源Et(Walldolf，Pyroquant Diagnostik GmbH出售的“Novo-Pyrexal.內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)NPI”)(10pg/孔)、1mg/ml核黃素溶液，其中加有Et至最終濃度為10pg/孔的相同的核黃素溶液或其中加有Et和β-葡聚糖使各自的最終濃度為10pg/孔和30ng/孔的同樣的核黃素溶液。向每個(gè)孔中加入0.05ml其中含0.01M MgCl2的0.2 tris-HCl緩沖液(PH8.0)然后振蕩。蓋好此微板放入干式微板恒溫器中37℃下培養(yǎng)30分鐘，使Et敏感因子活化。從孔中吸出殘面的液體，向孔中加入0.3ml DW后將其吸出。用DW的洗滌操作再重復(fù)兩次。向每個(gè)孔中加入0.2ml生色的LAL試劑(Seikagaku生產(chǎn)和出售的“Toxicolor”)，此試劑是利用向LAL中加入生色的合成底物(Boc-Leu-Gly-Arg-PNA)的方法制備的。將此微板放在裝有恒溫器的微板讀出裝置(Seikagaku公司出售品，“Well Reader SK601”)上后，在37℃下培養(yǎng)30分鐘。在405nm下(參見波長492nm)連續(xù)測量即對釋出對硝基苯胺的消光(動力學(xué)分析法)以檢查本發(fā)明試劑的反應(yīng)活化。所得到的結(jié)果匯于下表之中。
表7樣品反應(yīng)活性(△A405nm-492nm/30分鐘)Et0.226核黃酸0.003核黃酸+Et0.229核黃酸+Et+β-葡聚糖0.229從表7可以看出即使是不能像傳統(tǒng)的液相反應(yīng)體系那樣用生色的合成底物作Et分析體系的黃色樣品例如核黃素，也能按本發(fā)明用吸附有Et敏感因子的載體加以檢測，靈敏度高和方便地測定Et而不受β-葡聚糖的影響。
實(shí)施例8把實(shí)施例1制備的三個(gè)吸附有Et敏感因子的尼龍濾膜分別放入三個(gè)培養(yǎng)皿中，在每個(gè)尼龍濾膜的中心滴三種混合物，這些混合物含0.05ml(其中含0.01M MgCl2和0.8mM Boc-Val-Pro-Arg-PNA的)0.2M tris-HCl緩沖液(PH8.0)和DW、E.Coli 0111∶B4源Et(1ng/ml)或β-葡聚糖(100ng/ml)各0.05ml。蓋好培養(yǎng)皿在培養(yǎng)器中37℃下培養(yǎng)60分鐘。用目視法觀察黃色，得到的結(jié)果匯于下表8中。
表8樣品反應(yīng)活性DW-Et+β-葡聚糖-從表8可以看出，使用其上吸附有Et敏感因子的膜狀不溶性載體可以簡易而快速地檢測Et而不受β-葡聚糖影響。
實(shí)施例9向溶胞產(chǎn)物中加入按WO90/02951中所述的方法用Curdlan制備的β-葡聚糖凝血因子活化抑制劑(分子量5800)。將所得到的混合物加到ToxipetPlate96F的每個(gè)孔中使此板吸附Et敏感因子。
按照與實(shí)施例3相同的方式分析了與實(shí)施例3所用相同的樣品，結(jié)果Et被特異測定而來受β-葡聚糖影響。
實(shí)施例10本例的藥盒由下列三種元件組成1.盛有25片在無Et的0.02Mtris-HCl緩沖液(PH8.0)中浸過的，吸附有Et敏感因子的尼龍濾膜的小瓶;
2.盛有4.1mg無Et的生色合成肽底物(Boc-Val-Pro-Arg-PNA乙酸鹽)的小瓶;
3.盛有5.5ml無Et的含0.02M MgCl2的0.15Mtris-HCl緩沖液(PH8.0)的小瓶。
使用時(shí)，在一片吸附有Et敏感因子的尼龍濾液膜上加入0.1ml樣品，向其中加入將生色的合成肽底物小瓶內(nèi)容物全部溶于緩沖液小瓶內(nèi)容物(5.5ml)中制備的溶液0.2ml，然后在37℃下培養(yǎng)。
實(shí)施例11本例的藥盒由下列三種元件組成1.在無Et的0.02Mtris-HCl緩沖液中(PH8.0)浸泡過的用聚苯乙烯制造的、96孔吸附有Et敏感因子的微板;
2.盛有3.0mg無Et的生色合成的肽底物(Boc-Leu-Gly-Arg-PNA鹽酸鹽)的小瓶;
3.盛有5.0ml含0.015M MgSO4的無Et的、0.2M tris-HCl緩沖液(PH8.0的小瓶。
使用時(shí)，將0.05ml待分析的樣品加到微板的每個(gè)孔中，向其中加入將生色的合成肽底物小瓶內(nèi)容物全部溶解在緩沖液小瓶全部內(nèi)容物(5.0ml)的方法制備的溶液0.05ml，然后在37℃下培養(yǎng)。
實(shí)施例12本例的藥盒由下列五種元件組成1.由聚苯乙烯制作訴、在無Et的0.02Mtris-HCl緩沖液(PH8.0)中浸泡過的96孔吸附有Et敏感因子的微板;
2.盛有5.0ml的無Et的0.2M含0.01M MgCl2的tris-HCl緩沖液(緩沖液A)的小瓶;
3.盛有100ml無Et蒸餾水的小瓶;
4.盛有2.7mg無Et的生色合成肽底物(Boc-Vol-Pro-Arg-PNA乙酸鹽)的小瓶;
5.盛有10ml無Et的0.05Mtris-HCl緩沖液(PH8.0)(緩沖液B)的小瓶。
使用時(shí)，將0.05ml樣品加到微板的各孔中，向其中加入0.05ml緩沖液A在37℃活化。吸出此液體，用蒸餾水洗孔。然后向孔中加入0.1ml利用水發(fā)色合成肽底物瓶全部內(nèi)容物溶于全部緩沖液B(10ml)中的方法制備的溶液，使此體系反應(yīng)。
實(shí)施例13本例的藥盒由下列三部分組成1.由聚苯乙烯制成的、于無Et的0.02Mtris-HCl緩沖液中(PH8.0)浸泡過的吸附有Et敏感因子的96孔微板;
2.盛有5.0ml無Et的其中含0.01M MgCl2的0.2M tris-HCl緩沖液(PH8.0)的小瓶;
3.盛有100ml無Et蒸餾水的小瓶。
使用時(shí)，將0.05ml待檢測的樣品加到微孔板的各孔中，向其中加入0.05ml緩沖液于37℃活化。從孔中吸出液體，孔用蒸餾水洗滌。然后向孔中加入LAL、市售LAL凝膠試劑、LAL和適當(dāng)?shù)暮铣呻牡孜锏慕M合物或市售的適于合成肽底物法使用的LAL試劑等等，接著按照所用的試劑選擇適當(dāng)?shù)姆椒ā?br> 實(shí)施例14本例的藥盒由下列三部分組成1.50片吸附有Et敏感因子的尼龍濾膜;
2.盛有1.5mg無Et的生色用合成肽底物(Boc-Val-Pro-Arg-PNA乙酸鹽)的小瓶;
3.盛有2.7ml無Et的其中含0.01M MgCl2的0.2M tris-HCl緩沖液(PH8.0)的小瓶。
使用時(shí)，將0.05ml由溶解合成肽底物于全部緩沖液(2.7ml)中的方法制備的底物溶液滴在一片吸附有Et敏感因子的尼龍濾膜上，在其上再滴加0.05ml樣品，然后在37℃使此體系反應(yīng)。
雖然本發(fā)明參照其實(shí)施例的方法作了詳細(xì)說明，但是對本領(lǐng)域中普遍技術(shù)人員來冰，顯然可以在不違背本發(fā)明的思想和范圍情況下作出各種變化和改進(jìn)。
權(quán)利要求
1.一種用于毒素特異檢測的試劑，其中包含固定在其上的至少一種由鱟變形蟲狀細(xì)胞得到而且與(1→3)-β-D-葡聚糖無反應(yīng)活性的內(nèi)毒素敏感因子的不溶性載體。
2.按照權(quán)利要求1所述的試劑，其中所說的不溶性載體包括至少一種由下列選出的化合物聚酰胺、纖維素、聚苯乙烯、聚丙烯、二氧化硅、瓊酯糖、聚丙烯酰胺、葡聚糖和乙烯基聚合物，而且不溶于檢測內(nèi)毒素用的反應(yīng)溶液中。
3.按照權(quán)利要求1所述的試劑，其中所說的不溶性載體選自聚酰胺化合物和纖維素化合物。
4.一種用于內(nèi)毒素特異檢測的試劑，它是利用將鱟屬變形蟲狀細(xì)胞溶胞產(chǎn)物或含溶胞產(chǎn)物的液體施于一種不溶性載體上的方式得到的，所說的不溶性載體特異吸附至少一種內(nèi)毒素的凝血因子而不能吸附(1→3)-β-D-葡聚糖凝血因子，以便將所說溶胞產(chǎn)物中至少一種內(nèi)毒素敏感因子吸附在所說的不溶性載體上并且從所說載體除去殘留的溶胞產(chǎn)物或液體，得到一種基本不含(1→3)-β-D-葡聚糖因子而且對內(nèi)毒素有特異活性的不溶性載體。
5.權(quán)利要求1或4中所述的試劑，其中所說的試劑包含對于活化內(nèi)毒素敏感因子有效的二價(jià)金屬鹽。
6.一種用于毒素特異分析的干型分析元件，其中包括試劑層，該試劑層包含其上至少固定一種源自鱟屬變形蟲狀細(xì)胞的內(nèi)毒素敏感因子的并與(1→3)-β-D-葡聚糖不反應(yīng)的不溶性載體，以及活化的內(nèi)毒素敏感因子的底物或凝固酶的底物。
7.一種用于內(nèi)毒素特異分析的藥盒，其中包括(a)內(nèi)毒素特異分析用試劑，其中包括其上至少固定有一種源于鱟屬變形蟲狀細(xì)胞的內(nèi)毒素敏感因子而且與(1→3)-β-D-葡聚糖不顯示反應(yīng)的不溶性載體，以及(b)活化的內(nèi)毒素敏感因子的底物或凝固酶的底物。
8.權(quán)利要求7所述的藥盒，其中還包括(c)有效活化內(nèi)毒素敏感因子的二價(jià)金屬鹽。
9.一種用于內(nèi)毒素特異檢測的方法，其中包括將樣品溶液施于內(nèi)毒素特異檢測用試劑上，所說的試劑包含其上固定有至少一種源于鱟屬變形蟲狀細(xì)胞的內(nèi)毒素敏感因子而且與(1→3)-β-D-葡聚糖不顯示反應(yīng)的不溶性載體，以便使樣品中的內(nèi)毒素至少與所說試劑中的內(nèi)毒素敏感因子反應(yīng)，并且測定活化的內(nèi)毒素敏感因子之底物或凝固酶之底物的變化。
10.權(quán)利要求9中所述的方法，其中使所說的樣品溶液與所說的試劑在有效活化內(nèi)毒素敏感因子之二價(jià)金屬鹽存在下反應(yīng)。
11.一種用于內(nèi)毒素特異檢測的方法，包括施加樣品溶液于內(nèi)毒素特異檢測的試劑上，所說的試劑包含其上至少固定有一種源于鱟屬變形蟲狀細(xì)胞的內(nèi)毒素敏感因子而且與(1→3)-β-D-葡聚糖不顯示反應(yīng)的不溶性載體;從不溶性載體上除去殘余的樣品溶液;使不溶性載體與鱟屬變形蟲狀細(xì)胞溶胞產(chǎn)物單獨(dú)進(jìn)一步接觸或與鱟屬變形蟲狀細(xì)胞溶胞產(chǎn)物和凝固酶的合成肽底物共同進(jìn)一步接觸，并且測定所說的溶胞產(chǎn)物的變化或所說的底物的變化。
12.權(quán)利要求11所述的方法，其中的所說的樣品溶液，在有效活化內(nèi)毒素敏感因子之二價(jià)金屬鹽存在下施加在試劑上。
13.一種制備內(nèi)毒素的特異檢測用試劑的工藝方法，包括在不溶性載體上物理或化學(xué)固定至少一種源于鱟屬變形蟲狀細(xì)胞的內(nèi)毒素敏感的凝血因子。
14.一種制備內(nèi)毒素特異檢測用試劑的工藝方法，包括將水鱟屬變形蟲狀細(xì)胞溶胞產(chǎn)物或含溶胞產(chǎn)物的液體施于不溶性載體上，所說的載體特異吸附有至少一種內(nèi)毒素敏感因子但是不能吸附(1→3)-β-D-葡聚糖敏感因子，以便使所說溶胞產(chǎn)物中至少一種內(nèi)毒素敏感因子吸附在所說的不溶性載體上，并且從所說的載體除去殘留的溶胞產(chǎn)物或流體，以得到一種基本不含(1→3)-β-D-葡聚糖敏感因子而且與內(nèi)毒素具有特異反應(yīng)的不溶性載體。
15.按照權(quán)利要求14所說的方法，其中所說的不溶產(chǎn)物選自聚酰胺化合物和纖維素化合物。
16.按照權(quán)利要求14所說的方法，其中在葡聚糖存在下進(jìn)行所說的接觸處理。
17.一種制備內(nèi)毒素特異檢測試劑用工藝方法，包括使鱟屬變形蟲狀細(xì)胞溶胞產(chǎn)物經(jīng)受除去(1→3)-β-D-葡聚糖敏感因子的處理，以便得到一種基本上不含(1→3)-β-D-葡聚糖因子但含內(nèi)毒素因子的溶胞產(chǎn)物，施加此得到的溶胞產(chǎn)物于不溶性載體上以便物理或化學(xué)固定至少一種內(nèi)毒素敏感因子于所說的不溶性載體上。
18.一種制備內(nèi)毒素特異檢測試劑用工藝方法，包括向鱟屬變形蟲裝細(xì)胞溶胞產(chǎn)物中加入(1→3)-β-D-葡聚糖敏感因子活化抑制劑，然后將此溶胞產(chǎn)物施于不溶性載體上以便物理或化學(xué)固定所說溶胞產(chǎn)物中至少一種內(nèi)毒素敏感因子于所說的不溶性載體上。
全文摘要
披露出1)一種用固相反應(yīng)特異檢測內(nèi)毒素用試劑，其中包括其上至少固定一種鱉屬變形蟲狀細(xì)胞源的內(nèi)毒素敏感因子的不溶性載體；2)用固相反應(yīng)特異檢測內(nèi)毒素的藥盒，至少包含所說試劑和活化的因子的合成底物或凝固酶的合成底物；3)分析內(nèi)毒素的方法，包括使樣品溶液與所說試劑接觸，使樣品中的內(nèi)毒素與所說試劑中的因子反應(yīng)并測定底物的變化；以及4)制備所說試劑用工藝方法，包括使鱉屬變形蟲狀細(xì)胞源的至少一種內(nèi)毒素敏感因子物理或化學(xué)固定在不溶性載體上。即使混濁或有色，樣品中的內(nèi)毒素均能方便而快速地加以測定而不受(1→3)-β-D-葡聚糖影響。
文檔編號G01N33/579GK1091832SQ9311927
公開日1994年9月7日 申請日期1993年9月14日 優(yōu)先權(quán)日1992年9月14日
發(fā)明者田中重則, 田村弘志, 大木誠 申請人:生化學(xué)工業(yè)株式會社