一種去除多肽中的內(nèi)毒素的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種去除多肽中的內(nèi)毒素的方法。該方法包括下述步驟：將多肽粗品溶解于水中，超濾濃縮得到濃縮液，依次加入磷酸鹽水溶液和鈣鹽水溶液，調(diào)節(jié)pH值為8～9，離心，即可；所述的多肽粗品為玻璃酸酶粗品、絨促性素粗品、尿促性素粗品或促皮質(zhì)素粗品。本發(fā)明的在多肽生產(chǎn)過程中去除內(nèi)毒素的方法，在不影響多肽活性、收率的前提下，有效地去除多肽生產(chǎn)中含有的內(nèi)毒素污染物，目前已經(jīng)應(yīng)用于多肽原料藥生產(chǎn)，內(nèi)毒素含量符合2010版中國藥典要求。
【專利說明】一種去除多肽中的內(nèi)毒素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，具體涉及一種去除多肽中的內(nèi)毒素的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]內(nèi)毒素產(chǎn)生于革蘭氏陰性細菌的細胞外壁，其主要成份是脂多糖(LPS)及類脂A，是熱原的活性部分。它們的相對分子質(zhì)量一般為I萬~2.5萬，在水溶液中形成締合體，相對分子質(zhì)量可達50萬~100萬。其具有耐熱性和化學穩(wěn)定性，不易被除滅。注入人體的注射劑中含有熱原量達I μ g/kg就可引起不良反應(yīng)，發(fā)熱反應(yīng)通常在注入I小時后出現(xiàn)，可使人體產(chǎn)生發(fā)冷、寒顫、發(fā)熱、出汗、惡心、嘔吐等癥狀，有時體溫可升至40°C以上，嚴重者甚至昏迷、虛脫，如不及時搶救，可危及生命。因此，在生物制品生產(chǎn)過程中，需要有嚴格的工藝控制策略對內(nèi)毒素進行去除或限量控制。
[0003]目前，水溶液中常用的內(nèi)毒素去除方法主要有如下幾種:
[0004]1、超濾 [0005]內(nèi)毒素具有較大的相對分子質(zhì)量，因此，可選用超濾膜去除水中的內(nèi)毒素。在使用超濾方法去除內(nèi)毒素時需要根據(jù)被處理藥物的相對分子質(zhì)量、特性選擇超濾膜的孔徑及材質(zhì)，因此該方法不具備通用性。另外，內(nèi)毒素并不以單一分子存在，而是以相對分子質(zhì)量不等的集聚體存在，因此大小不一，這也給超濾法去除內(nèi)毒素帶來了挑戰(zhàn)。
[0006]2、活性炭吸附法
[0007]活性炭吸附是一種較早用于內(nèi)毒素去除的方法，但是，由于活性炭選擇性差，在吸附內(nèi)毒素的同時吸附有效活性成分，影響產(chǎn)品收率。
[0008]3、化學降解法
[0009]化學降解法是指用強酸、強堿或氧化劑等使內(nèi)毒素降解以達到去除內(nèi)毒素的目的，這種方法有可能造成有效成分的降解或失活，因此，該方法的使用需結(jié)合產(chǎn)品的理化性質(zhì)。
[0010]4、離子交換色譜法
[0011]離子交換色譜法是根據(jù)內(nèi)毒素帶有部分負電荷的性質(zhì)，用陰離子交換色譜來去除內(nèi)毒素，但這種方法不適合于溶液中存在其它帶負電荷物質(zhì)的情況。
[0012]蛋白質(zhì)種類較多，其分離純化步驟各不相同，不同終產(chǎn)品對內(nèi)毒素含量要求也有差異，因此，去除內(nèi)毒素的方法和效果無法完全通用。多肽作為一種活性蛋白類藥物，其具有易失活、不穩(wěn)定的特點，在內(nèi)毒素去除過程中保證其本身性質(zhì)及有效活性成分不受影響至關(guān)重要，這也是本領(lǐng)域長期以來存在的、難以克服的技術(shù)難題。在多肽中的內(nèi)毒素去除方法選擇過程中，超濾法因多肽分子量較大而無法應(yīng)用，活性炭吸附法專一性不強，化學降解法極易造成多肽失活，色譜法耗時較長，不利于多肽性質(zhì)的穩(wěn)定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于為了克服了現(xiàn)有技術(shù)中多肽中的內(nèi)毒素無法去除徹底、易造成多肽失活、耗時較長的缺陷，而提供了一種去除多肽中的內(nèi)毒素的方法。本發(fā)明的方法將超濾與磷酸鈣沉淀聯(lián)合使用，可以有效除去內(nèi)毒素，且不會影響多肽的活性，適用于大規(guī)模條件下除去蛋白質(zhì)中的內(nèi)毒素。
[0014]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問題的:
[0015]本發(fā)明提供了一種去除多肽中的內(nèi)毒素的方法，其包括下述步驟:將多肽粗品溶解于水中，超濾濃縮得到濃縮液，依次加入磷酸鹽水溶液和鈣鹽水溶液，調(diào)節(jié)pH值為8~9，離心，即可；所述的多肽粗品為玻璃酸酶粗品、絨促性素粗品、尿促性素粗品或促皮質(zhì)素粗品O
[0016]其中，所述的 多肽粗品可為本領(lǐng)域常規(guī)的多肽粗品，例如玻璃酸酶粗品是新鮮牛睪丸通過分離、絞碎成漿、酸液泡制、扯漿、鹽析所得到的玻璃酸酶粗品，絨促性素粗品是孕婦尿經(jīng)吸附劑吸附、沉淀、過濾所得到的絨促性素粗品，促皮質(zhì)素粗品是豬腦垂體經(jīng)丙酮浸泡脫水、分離前葉再真空干燥，置球磨機中球磨，過篩，干燥得到的促皮質(zhì)素粗品。
[0017]其中，所述的絨促性素粗品較佳地進行下述前處理:加入醋酸鈉緩沖液溶解，離心，上清液依次加入聚乙二醇辛基苯基醚、磷酸三丁酯，攪拌，上述溶液通過SpfT柱層析進行純化，洗脫液過濾后加入乙醇，靜置，離心，即可。
[0018]其中，所述的促皮質(zhì)素粗品較佳地進行下述前處理:加入丙酮和鹽酸，離心，即可。
[0019]其中，所述的超濾濃縮采用的超濾膜較佳地為德國賽多利斯公司的Hydrosart超濾膜，截留相對分子質(zhì)量是5kDa或lOkDa。
[0020]其中，所述的超濾濃縮得到的濃縮液的體積較佳地為超濾濃縮前體積的0.1~
0.3 倍。
[0021]其中，所述的磷酸鹽可為本領(lǐng)域常規(guī)的可溶于水的各種磷酸鹽，較佳地為磷酸鈉和/或磷酸鉀。
[0022]其中，所述的鈣鹽可為本領(lǐng)域常規(guī)的可溶于水的各種鈣鹽，較佳地為醋酸鈣和/或氯化鈣。
[0023]其中，所述的磷酸鹽水溶液與所述的濃縮液的體積比較佳地為(0.1~0.2):1。
[0024]其中，所述的鈣鹽水溶液與所述的磷酸鹽水溶液的體積比較佳地為(0.5~0.7):
1
[0025]其中，所述的磷酸鹽水溶液的濃度較佳地為0.2~0.5mol/L。
[0026]其中，所述的鈣鹽水溶液的濃度較佳地為0.8~1.5mol/L。
[0027]其中，所述的磷酸鹽與所述的鈣鹽的摩爾比較佳地為1:(0.5~2)，更佳地為1:
1.5。
[0028]其中，所述的離心的轉(zhuǎn)速較佳地為3000~4000rpm。
[0029]其中，所述的離心較佳地為冷凍離心10~30min，冷凍離心的溫度較佳地為4~10。。。
[0030]在符合本領(lǐng)域常識的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實例。
[0031]本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。
[0032]本發(fā)明的積極進步效果在于:
[0033](I)本發(fā)明先通過超濾方法大大減少了多肽操作體積，同時，使多肽溶液中內(nèi)毒素得到富集，有利于后續(xù)磷酸鈣沉淀內(nèi)毒素及透析、凍干，提高生產(chǎn)效率。
[0034](2)在磷酸鈣沉淀多肽中的內(nèi)毒素技術(shù)方案中，磷酸鹽與鈣鹽的摩爾比為1:1.5時恰好完全反應(yīng)生成磷酸鈣沉淀，用以吸附內(nèi)毒素，后續(xù)經(jīng)離心操作除去沉淀復合物。過量的磷酸鹽或鈣鹽水溶液不利于多肽穩(wěn)定性，并且會影響后續(xù)終產(chǎn)品質(zhì)量符合標準(如熾灼殘渣)。整個磷酸鈣沉淀內(nèi)毒素操作工序耗時30-60分鐘，極大降低了對多肽活性的影響。
[0035](3)本發(fā)明的在多肽生產(chǎn)過程中去除內(nèi)毒素的方法，在不影響多肽活性、收率的前提下，有效地去除多肽生產(chǎn)中含有的內(nèi)毒素污染物，目前已經(jīng)應(yīng)用于多肽原料藥生產(chǎn)，內(nèi)毒素含量符合2010版中國藥典要求。
【具體實施方式】
[0036]下面通過實施例的方式進一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說明書選擇。
[0037]實施例1
[0038]玻璃酸酶粗品1220g，批號090122，購自烏魯木齊天山區(qū)立信生化制品廠，玻璃酸酶粗品是新鮮牛睪丸通過分離、絞碎成漿、酸液泡制、扯漿、鹽析所得，其比活不得低于250U/mg。上述粗品投入不銹鋼桶，按照原料(總效價):純化水(體積)=I億U:800ml溶解，即加入4°C純化水2800ml，攪拌I小時至完全溶解，溶解后的溶液過濾，濾液用1kD的超濾膜(型號:Hydrosart德國賽多利斯公司)進行超濾濃縮,超濾后溶液體積為530ml。緩慢加入60ml0.4mol/L的4°C磷酸鈉溶液，攪拌，再緩慢加入36mllmol/L4°C醋酸鈣溶液，攪拌，用2.5M NaOH 調(diào)節(jié)pH至8.40，攪拌10分鐘后用3000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速冷凍離心20分鐘。上清液置冰浴中，加入0.6g活性炭，攪拌30分鐘，3000rpm離心30分鐘，得上清液。上清液用2M鹽酸調(diào)節(jié)pH至6.5，裝盤凍干機(上海東富龍科技股份有限公司)凍干，得成品Y0201341g。
[0039]玻璃酸酶內(nèi)毒素檢測均按照2010版中國藥典二部XIE “細菌內(nèi)毒素檢查法”。即采用鱟試劑法來檢測或量化由革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的細菌內(nèi)毒素，以判斷供試品中細菌內(nèi)毒素是否符合規(guī)定。
[0040]表1玻璃酸酶內(nèi)毒素檢測結(jié)果
[0041]
?Μ I內(nèi)毒素含量(Ευ/ι單位)I陰性對照I陽性對照
Y0201 0.000010--++
[0042]參照2010版藥典玻璃酸酶相關(guān)標準，該批次玻璃酸酶符合規(guī)定(2010版藥典規(guī)定，每I單位玻璃酸酶中含內(nèi)毒素的量應(yīng)小于0.20EU)。其中，陰性對照物為注射用水、陽性對照物為細菌內(nèi)毒素工作標準品(購自中國食品藥品檢定研究院)。
[0043]實施例2
[0044]玻璃酸酶粗品1400g，批號090123，購自烏魯木齊天山區(qū)立信生化制品廠，玻璃酸酶粗品是新鮮牛睪丸通過分離、絞碎成漿、酸液泡制、扯漿、鹽析所得，其比活不得低于250U/mg。上述粗品投入不銹鋼桶，按照原料(總效價):純化水(體積)=I億U:800ml溶解，即加入4°C純化水3300ml，攪拌I小時至完全溶解，溶解后的溶液過濾，濾液用5kD的超濾膜(型號:Hydrosart德國賽多利斯公司)進行超濾濃縮,超濾后溶液體積為650ml。緩慢加入70ml0.4mol/L的4°C磷酸鈉溶液，攪拌，再緩慢加入42mllmol/L4°C醋酸鈣溶液，攪拌，用2.5M NaOH調(diào)節(jié)pH至8.60，攪拌10分鐘后用3000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速冷凍離心20分鐘。上清液置冰浴中，加入0.7g活性炭，攪拌30分鐘，3000rpm離心30分鐘，得上清液。上清液用2M鹽酸調(diào)節(jié)pH至6.5，裝盤凍干機(上海東富龍科技股份有限公司)凍干，得成品Y0202368go
[0045]玻璃酸酶內(nèi)毒素檢測均按照2010版中國藥典二部XIE “細菌內(nèi)毒素檢查法”。即采用鱟試劑法來檢測或量化由革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的細菌內(nèi)毒素，以判斷供試品中細菌內(nèi)毒素是否符合規(guī)定。
[0046]表2玻璃酸酶內(nèi)毒素檢測結(jié)果
[0047]
【權(quán)利要求】
1.一種去多肽中的內(nèi)毒素的方法，其包括下述步驟:將多肽粗品溶解于水中，超濾濃縮得到濃縮液，依次加入磷酸鹽水溶液和鈣鹽水溶液，調(diào)節(jié)PH值為8~9，離心，即可；所述的多肽粗品為玻璃酸酶粗品、絨促性素粗品、尿促性素粗品或促皮質(zhì)素粗品。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的絨促性素粗品進行下述前處理:加入醋酸鈉緩沖液溶解，離心，上清液依次加入聚乙二醇辛基苯基醚、磷酸三丁酯，攪拌，上述溶液通過Spff柱層析進行純化，洗脫液過濾后加入乙醇，靜置，離心，即可； 所述的促皮質(zhì)素粗品進行下述前處理:加入丙酮和鹽酸，離心，即可。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的超濾濃縮采用的超濾膜為德國賽多利斯公司的Hydrosart超濾膜,截留相對分子質(zhì)量是5kDa或1kDa ； 和/或，所述的超濾濃縮得到的濃縮液的體積為超濾濃縮前體積的0.1~0.3倍。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的磷酸鹽為磷酸鈉和/或磷酸鉀； 和/或，所述的鈣鹽為醋酸鈣和/或氯化鈣。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的磷酸鹽水溶液與所述的濃縮液的體積比為(0.1~0.2):1 ； 和/或，所述的鈣鹽水溶液與所述的磷酸鹽水溶液的體積比為(0.5~0.7):1。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的磷酸鹽水溶液的濃度為0.2~0.5mol/L； 和/或，所述的鈣鹽水溶液的濃度為0.8~1.5mol/L。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的磷酸鹽與所述的鈣鹽的摩爾比為1:(0.5 ~2)。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的磷酸鹽與所述的鈣鹽的摩爾比為1:1.5。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的離心的轉(zhuǎn)速為3000~4000rpm。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的離心為冷凍離心10~30min;所述的冷凍離心的溫度較佳地為4~10°C。
【文檔編號】C07K1/30GK104031900SQ201410299464
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年6月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月26日
【發(fā)明者】黃臻輝, 周建華, 周偉潔, 琚姝, 王克平, 孫源遠 申請人:上海第一生化藥業(yè)有限公司