專利名稱：一種細(xì)菌內(nèi)毒素檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥物領(lǐng)域，特別涉及一種細(xì)菌內(nèi)毒素檢測方法。
背景技術(shù)：
細(xì)菌內(nèi)毒素是G-菌細(xì)胞壁上的特有結(jié)構(gòu)，其主要成分是脂多糖，具很強的熱原活性。當(dāng)細(xì)菌內(nèi)毒素通過消化道進(jìn)入人體時并不產(chǎn)生危害，但內(nèi)毒素通過注射等方式進(jìn)入血液時，則可導(dǎo)致不同程度的內(nèi)毒素血癥。因此，對于注射劑及其生產(chǎn)中所用的原輔料都應(yīng)進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素的控制，以確保產(chǎn)品質(zhì)量，保障用藥安全。細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測常用方法是家兔熱原法和鱟試劑法，目前運用較多的是鱟試劑法。采用該方法進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢測之前，須進(jìn)行干擾實驗，排除供試品對鱟試劑實驗的干擾，確保該方法的準(zhǔn)確度。對于非水溶性供試品，由于其與細(xì)菌內(nèi)毒素檢測用水不能互溶，混合后一段時間出現(xiàn)分層，導(dǎo)致難以有效檢測。目前多采用的方法是在分層以前取供試品與細(xì)菌內(nèi)毒素檢測用水的混合物，或者通過離心取水相部分進(jìn)行干擾實驗，但是取供試品與細(xì)菌內(nèi)毒素檢測用水的混合物進(jìn)行干擾實驗需要稀釋更大的倍數(shù)才能排除干擾甚至不能排除干擾；離心方法存在操作復(fù)雜、容易造成二次污染，出現(xiàn)假陽性，同時不能確保油相中的細(xì)菌內(nèi)毒素完全溶解在水相中，在進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢測時，容易出現(xiàn)假陰性等缺點。對于含有這類非水溶性原料的藥品，雖然能夠與水互溶，在采用細(xì)菌內(nèi)毒素檢測用水稀釋時，仍然存在細(xì)菌內(nèi)毒素在供試品中分散不均勻?qū)е赂蓴_不能成立的情況。商君等，“油劑普魯卡因青霉素注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法的研究”，中國獸藥雜志2000,34 (1):20 22，采用在樣品中加入適量無菌、內(nèi)毒素合格的0.lmol/L氫氧化鈉、1%吐溫-80溶液，并用0.lmo l/L鹽酸調(diào)節(jié)樣品液的pH值，解決了油劑普魯卡因青霉素注射液的溶解問題，但是該方法操作復(fù)雜，并且經(jīng)研究，不能廣泛應(yīng)用于常用的非水溶性藥品。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種新的細(xì)菌內(nèi)毒素檢測方法。本發(fā)明細(xì)菌內(nèi)毒素檢測方法，它包括如下步驟:(I)配制細(xì)菌內(nèi)毒素檢測用分散液:取甘油、陰離子表面活性劑和非離子表面活性齊U，溶于注射用水或細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水中，去內(nèi)毒素，得分散液，其中，甘油濃度為0.1 2% (v/v),陰離子表面活性劑濃度為0.05 0.5% (w/v)，非離子表面活性劑濃度為0.1 1% (v/v);(2)檢測:以步驟(I)制備的分散液取代細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，按照細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法檢測待檢樣品。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水:系指內(nèi)毒素含量小于0.015EU/ml(用于凝膠法)或0.005EU/ml (用于光度測定法)且對內(nèi)毒素試驗無干擾作用的滅菌注射用水(詳見《中華人民共和國藥典(2010版)第二部》附錄XI E細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法)；
細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，指《中華人民共和國藥典(2010版)第二部》附錄XI E規(guī)定的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法。其中，步驟(I)中，所述陰離子表面活性劑HLB值為I 20。優(yōu)選地，所述陰離子表面活性劑的HLB值為12 20。其中，步驟(I)中，所述陰離子表面活性劑包括油酸、油酸鈉或者油酸三乙醇胺中的一種或者多種。其中，步驟(I)中，所述非離子表面活性劑的HLB值為I 20。優(yōu)選地，所述非離子表面活性劑的HLB值為13.3 16.7。步驟(I)中，所述非離子表面活性劑包括聚山梨酯類系列中的一種或者多種。步驟(I)中，所述甘油濃度為1% (v/v)，陰離子表面活性劑濃度為0.1% (w/v)，非離子表面活性劑濃度為1% (v/v)。步驟(I)中，去內(nèi)毒素采用的方法是:用孔徑為IOOnm微孔濾膜將溶液過濾。本發(fā)明細(xì)菌內(nèi)毒素檢測方法 ，可以有效排除非水溶性供試品對鱟試劑實驗的干擾，準(zhǔn)確度高，檢測步驟簡單。以下通過實施例形式的具體實施方式
，對本發(fā)明的上述內(nèi)容作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實施例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。


圖1內(nèi)毒素檢測報告，其中，管號1-8:標(biāo)準(zhǔn)曲線；9_10:離心法制備供試品溶液；11-12:陽性對照；13-14:實施例1分散液作為溶劑制備的供試品溶液I ;15-16:實施例1分散液對照樣品的制備I ;17_18:實施例2分散液作為溶劑制備的供試品溶液2 ； 19-20:實施例2分散液對照樣品2 ；21-22:實施例3分散液作為溶劑制備的供試品溶液3 ；23~24:實施例3分散液對照樣品3 ；25-26:實施例4分散液作為溶劑制備的供試品溶液4 ；27~28:實施例4分散液對照樣品4 ；29-30:實施例5分散液作為溶劑制備的供試品溶液5 ;31_32:實施例5分散液對照樣品5。
具體實施例方式實施例1本發(fā)明檢測方法及有效性驗證一、檢測方法1、分散液配制(I)試劑選擇陰離子表面活性劑選擇油酸鈉，其HBL值為18 ;非離子表面活性劑選擇聚山梨酯-80，其HBL值為15。(2)實驗器具及試劑熱原的去除所有用的實驗器具，包括碘量瓶、容量瓶、藥匙、燒杯在250°C下干烤2h，去除其中的熱原；油酸鈉放置于除去熱原的碘量瓶中，在150°C下干烤2h。(3)分散液的配制稱取已經(jīng)在150°C干烤2h的油酸鈉0.lg，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢測用水配制的1%甘油溶液在已經(jīng)去除熱原的燒杯中溶解，配制成濃度為0.1%的油酸鈉溶液，然后加入1%聚山梨酯-80，使得整個體系各原料的配比為:油酸鈉0.1% (w/v)，甘油1% (v/v)、聚山梨酯-801%(v/v),最后用細(xì)菌內(nèi)毒素檢測用水配制的0.lmol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH在6_8左右。(4)分散液溶液的內(nèi)毒素去除將得到的溶液用孔徑為IOOnm微孔濾膜將溶液過濾到已除熱原的碘量瓶中。2、以步驟I制得的分散液取代細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，按照細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法檢測待檢樣品，即可。

二、分散液溶液細(xì)菌內(nèi)毒素含量驗證實驗按照細(xì)菌內(nèi)毒素檢測用水的要求將該分散液溶液的細(xì)菌內(nèi)毒素限值定為0.015EU/ml。采用兩個不同生產(chǎn)廠家的鱟試劑對該溶液進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素干擾實驗，建立該分散液細(xì)菌內(nèi)毒素驗證方法為采用靈敏度為0.015EU/ml的鱟試劑對該溶液進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢測。a、細(xì)菌內(nèi)毒素限值的確定按照細(xì)菌內(nèi)毒素檢測用水的要求將該分散液溶液的細(xì)菌內(nèi)毒素限值定為0.015EU/ml。b、供試品的干擾試驗鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗按《中國藥典》2010年版二部附錄XI E “細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”，對所用兩個廠家鱟試劑的靈敏度進(jìn)行復(fù)核。根據(jù)鱟試劑靈敏度的標(biāo)示值(X )，將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解，在旋渦混合器上混勻15分鐘，然后制成2入、A ,0.5A ,0.25 A四個濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每稀釋一步均在旋渦混合器上混勻30秒鐘。按檢查法項下試驗，每一濃度平行做4支，同時，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水做2支陰性對照管，如最大濃度2.0 A管均為陽性，最低濃度0.25 A管均為陰性，陰性對照管均為陰性，按下式計算反應(yīng)終點濃度的幾何均值，即為鱟試劑靈敏度的測定值(、C)。A c=lg_1( E X/4)式中X為反應(yīng)終點濃度的對數(shù)值(lg)。反應(yīng)終點濃度是系列濃度遞減的內(nèi)毒素溶液中最后一個呈陽性結(jié)果的濃度。復(fù)核結(jié)果見表I。表I鱟試劑靈敏度復(fù)核結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種細(xì)菌內(nèi)毒素檢測方法，其特征在于:它包括如下步驟: (1)配制細(xì)菌內(nèi)毒素檢測用分散液:取甘油、陰離子表面活性劑和非離子表面活性劑，溶于注射用水或細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水中，調(diào)pH至6 8，去內(nèi)毒素，得分散液，其中，甘油濃度為0.1 2% (v/v),陰離子表面活性劑濃度為0.05 0.5% (w/v)，非離子表面活性劑濃度為 0.1 1% (v/v)； (2)檢測:以步驟(I)制備的分散液取代細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，按照細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法檢測待檢樣品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于:步驟(I)中，所述陰離子表面活性劑HLB值為I 20。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測方法，其特征在于:所述陰離子表面活性劑的HLB值為12 20。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于:步驟(I)中，所述陰離子表面活性劑包括油酸、油酸鈉 或者油酸三乙醇胺中的一種或者多種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于:步驟(I)中，所述非離子表面活性劑的HLB值為I 20。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測方法，其特征在于:所述非離子表面活性劑的HLB值為13.3 16.7。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于:步驟(I)中，所述非離子表面活性劑包括聚山梨酯類系列中的一種或者多種。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的檢測方法，其特征在于:步驟(I)中，所述甘油濃度為1%(v/v),陰離子表面活性劑濃度為0.1% (w/v)，非離子表面活性劑濃度為1% (v/v)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的檢測方法，其特征在于:步驟(I)中，去內(nèi)毒素采用的方法是:用孔徑為IOOnm微孔濾膜將溶液過濾。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種細(xì)菌內(nèi)毒素檢測方法，它包括如下步驟(1)配制細(xì)菌內(nèi)毒素檢測用分散液取甘油、陰離子表面活性劑和非離子表面活性劑，溶于注射用水或細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水中，去內(nèi)毒素，得分散液，其中，甘油濃度為0.1～2%(v/v)，陰離子表面活性劑濃度為0.05～0.5%(w/v)，非離子表面活性劑濃度為0.1～1%(v/v)；(2)檢測以步驟(1)制備的分散液取代細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，按照細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法檢測待檢樣品。本發(fā)明細(xì)菌內(nèi)毒素檢測方法準(zhǔn)確度高，操作簡單。
文檔編號G01N33/579GK103245785SQ201310116759
公開日2013年8月14日 申請日期2013年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月7日
發(fā)明者朱雪梅, 楊秋艷, 楊軍, 王利春, 王晶翼, 梁隆, 沈鑫, 程志鵬 申請人:四川科倫藥業(yè)股份有限公司