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一種用于診斷肺癌的蛋白質(zhì)芯片的制作方法

文檔序號(hào):5883635閱讀:339來源:國(guó)知局
專利名稱:一種用于診斷肺癌的蛋白質(zhì)芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種用于診斷肺癌的蛋白質(zhì)芯片,以及由此蛋白質(zhì)芯片衍生的診斷試劑盒。本發(fā)明進(jìn)一步提供了蛋白質(zhì)芯片以及由此蛋白質(zhì)芯片衍生的診斷試劑盒在肺癌診斷、健康人群或高危人群肺癌篩查中的應(yīng)用。確切地說是本發(fā)明涉及一種可用于血清學(xué)檢測(cè)診斷人肺癌的蛋白質(zhì)芯片,該方法通過檢測(cè)12種抗原在被檢人血液樣品中的各自的相應(yīng)抗體的含量,并聯(lián)合分析這12種抗原相應(yīng)抗體檢測(cè)的結(jié)果,來判定被檢人是否患有肺癌。本發(fā)明還涉及由此蛋白質(zhì)芯片衍生的診斷試劑盒,這些診斷試劑盒均采用或包含了此蛋白質(zhì)芯片。另外,本發(fā)明提供了此蛋白質(zhì)芯片及衍生的診斷試劑盒在肺癌診斷、健康人群或高危人群肺癌篩查中的應(yīng)用。
背景技術(shù)
人肺癌是人類常見腫瘤之一,發(fā)病率高、死亡率高,目前肺癌的死亡率仍然在85%以上,嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。肺癌死亡率高的最重要的原因是肺癌的診斷率低,早期肺癌病人無體征,因而到醫(yī)院就診的病人絕大多數(shù)是中晚期病人。提高早期肺癌、肺癌的診斷率,將亞臨床肺癌或隱匿性肺癌從人群中篩查出來,對(duì)于提高肺癌的治愈率及降低死亡率具有重大的意義。
目前肺癌的診斷主要分為2類侵入性診斷和非侵入性診斷。侵入性診斷包括穿刺活檢、手術(shù)探查等創(chuàng)傷性手段;非侵入性診斷包括各種影像學(xué)診斷手段(如X光胸片、CT、核磁共振、PET等)、細(xì)胞學(xué)檢查,以及各種體液中某些肺癌或腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)。肺癌的侵入性診斷痛苦大,病人不愿意接受,一般只用于臨床的鑒別診斷和確診。肺癌最常用的診斷手段還是非侵入性診斷,在目前尤其是指影像學(xué)診斷和細(xì)胞學(xué)診斷。
40年前胸部X光片就已作為早期肺癌的診斷和篩查手段之一,盡管這種技術(shù)費(fèi)時(shí),費(fèi)用也高于細(xì)胞學(xué)檢查,但確實(shí)能發(fā)現(xiàn)一些痰檢陰性的早期肺癌。我國(guó)云錫肺癌高發(fā)現(xiàn)場(chǎng)1992-1997年6年對(duì)10481高危人群普查6年的結(jié)果表明,普查痰檢陽性率為31.74%,X光胸片的陽性檢出率為63.64%,優(yōu)于痰細(xì)胞學(xué),但其陽性預(yù)測(cè)值(33.05%)卻低于痰細(xì)胞學(xué)的陽性預(yù)測(cè)值(62.01%)。此外X光片通常只能檢出大于1.5cm病灶的肺癌,而對(duì)更早期的肺癌、隱匿性、可疑肺癌及癌前病變均不能檢出。自70年代英國(guó)科學(xué)家Housfield發(fā)明CT用于肺癌的診斷以來,相繼又發(fā)展了多種先進(jìn)的影像設(shè)備和技術(shù),如螺旋CT、高分辨CT、肺血管和支氣管動(dòng)脈DSA造影,以及近幾年發(fā)展起來的PET。這些先進(jìn)的影像設(shè)備和技術(shù)都有各自的優(yōu)勢(shì)和不足,以及不同的用途。對(duì)早期肺癌的檢出率也有所提高。近年來美國(guó)、日本一些發(fā)達(dá)國(guó)家將螺旋CT技術(shù)用于人群早期肺癌的篩查。1993年美國(guó)的早期肺癌普查方案對(duì)1000例自愿者高危人群采用低劑量螺旋CT篩查,發(fā)現(xiàn)233例有1-6個(gè)非鈣化結(jié)節(jié),其中27例確診肺癌,早期肺癌23例(85%),而同期X光片漏診率為83%。日本1998年報(bào)道了采用螺旋CT普查人群早期肺癌,并與傳統(tǒng)的痰細(xì)胞學(xué)和X光片技術(shù)進(jìn)行了比較。結(jié)果在螺旋CT篩查的9452人中,肺癌的檢出率為0.37%,而在26338人痰檢和X光片檢測(cè)中,肺癌的檢出率僅為0.16%,前者是后者的2.3倍。同時(shí)發(fā)現(xiàn)低劑量螺旋CT對(duì)周圍型早期肺癌的檢出明顯好于中央型。近幾年發(fā)展起來的另一種新技術(shù)PET對(duì)肺癌診斷的敏感性和準(zhǔn)確性又有進(jìn)一步的提高。美國(guó)、日本、德國(guó)、加拿大等各國(guó)報(bào)道的結(jié)果顯示,PET在分辨惡性與良性非鈣化結(jié)節(jié)的敏感性、特異性均高于螺旋CT,可達(dá)85%和90%。但是,PET不能檢出小于1.5cm的肺癌病灶,在早期肺癌的診斷上無顯著優(yōu)勢(shì),且設(shè)備價(jià)格更昂貴。螺旋CT在我國(guó)大中城市的醫(yī)院均有,但其檢測(cè)費(fèi)昂貴(800-1000元/人份),在現(xiàn)階段我國(guó)的國(guó)情下不可能作為篩查人群的技術(shù)。綜上所述,除X光胸片以外的所有影像學(xué)設(shè)備和技術(shù),在我國(guó)目前的國(guó)情下均不可能用于人群早期肺癌的篩查和診斷,但在確診早期肺癌中有一定的意義。本研究將利用低劑量螺旋CT技術(shù)對(duì)高危人群篩查出來的陽性病例的邊緣型早期肺癌確診。支氣管纖維鏡檢在肺癌診斷中的應(yīng)用,主要是用于痰檢和X光胸片發(fā)現(xiàn)異常或CT發(fā)現(xiàn)非鈣化結(jié)節(jié)的病例,通過支纖鏡檢確定病變,并取活檢組織或洗液,再進(jìn)一步進(jìn)行病理或細(xì)胞學(xué)確診。通常對(duì)于有經(jīng)驗(yàn)的大夫,支纖鏡檢可發(fā)現(xiàn)約30-40%的早期癌,難以檢出癌前病變和原位癌。近年來Xillix公司研制了熒光支氣管鏡,利用自發(fā)熒光技術(shù),在442nm蘭色氦鎘激光照射下正常組織發(fā)出綠色自身熒光,癌變組織和不典型增生則發(fā)出棕色或棕紅色光,有助于確定活檢部位,發(fā)現(xiàn)早期肺癌,并有助于判斷手術(shù)范圍,同時(shí)還能檢出癌前病變。美國(guó)、加拿大報(bào)道的結(jié)果顯示,其原位癌和癌前病變檢出率是普通白光支纖鏡的幾倍。但這一設(shè)備價(jià)格昂貴,對(duì)操作人員專業(yè)水平要求很高,檢測(cè)費(fèi)也貴,是痛苦有創(chuàng)性檢測(cè)技術(shù),對(duì)中心型早期肺癌和癌前病變,檢出率較高,對(duì)周圍型肺癌檢出率低。因此這一技術(shù)和設(shè)備也不可能作為篩查人群的技術(shù)方法。
早在30年代,痰細(xì)胞學(xué)檢測(cè)技術(shù)在國(guó)內(nèi)外已用于肺癌的診斷,由于檢測(cè)方法的簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì),后來也作為人群篩查早期肺癌的技術(shù)方法,但其陽性檢出率低。中晚期病人的檢出率為60-80%,而早期肺癌的檢出率僅有10-20%。美國(guó)NCI的肺癌早期發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)中,不足10%的肺癌是由細(xì)胞學(xué)單獨(dú)發(fā)現(xiàn)。云錫肺癌高發(fā)現(xiàn)場(chǎng)不斷改進(jìn)痰檢方法,其在1992-1997年6年間普查中,痰檢陽性率平均為31.74%,可見漏診率仍很高。其原因(1)該技術(shù)對(duì)痰中能排出癌細(xì)胞的中心型肺癌檢出率較高,而對(duì)周圍型肺癌診斷用處不大。在云錫普查中,339例痰檢陽性的病例中,216例為中心型(占63%)。原因(2)普通痰細(xì)胞涂片質(zhì)量差,鏡檢難度大。原因(3)操作者判斷的誤差大,其次痰樣本獲取的質(zhì)量差異大。近年來國(guó)外發(fā)展一種新的痰細(xì)胞學(xué)檢測(cè)技術(shù)(ThinPrep即液基超薄細(xì)胞電腦掃描技術(shù)),目前已發(fā)展出第三代自動(dòng)化設(shè)備AutocytePrep and AutoPap系統(tǒng),該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是能將粘稠的痰處理稀化,能制備出質(zhì)量很高的超薄細(xì)胞片,從而提高痰檢的檢出率,同時(shí)能自動(dòng)收集痰中幾乎所有的脫落細(xì)胞進(jìn)行鏡檢或各種分子標(biāo)志物的自動(dòng)檢測(cè),數(shù)據(jù)分析處理,對(duì)早期肺癌診斷的敏感性可提高到40-60%。另一個(gè)重要的優(yōu)點(diǎn)是能提高癌前病變的檢出率,但該技術(shù)需價(jià)格昂貴的進(jìn)口設(shè)備,每份標(biāo)本處理的試劑費(fèi)為100元人民幣,操作人員需較高的專業(yè)水平。國(guó)外主要在大醫(yī)院里應(yīng)用,用于人群早期肺癌篩查的報(bào)道甚少。國(guó)內(nèi)目前僅有幾個(gè)大城市的極少醫(yī)院有此設(shè)備,開展了這項(xiàng)技術(shù)。因此,在我國(guó)現(xiàn)有國(guó)情下不可能用于大人群篩檢。此外該技術(shù)對(duì)于周圍型和邊緣型早期肺癌檢出率較低。
隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展,在研究肺癌病因的同時(shí),也在分子水平上對(duì)肺癌發(fā)生發(fā)展有了更多的了解。已有的研究表明在肺癌發(fā)生發(fā)展的多階段過程中,細(xì)胞形態(tài)的惡性生物學(xué)改變伴隨著其分子水平的多種基因參與和改變,它們包括癌基因的擴(kuò)增、過度表達(dá)、突變和抑癌基因的缺失、突變、易位、重排等等多種基因的改變。到目前為止,已報(bào)道的與肺癌發(fā)生相關(guān)的基因異常改變約有十余種。最常見的癌基因改變有ras家族、myc家族、HER2、Bcl-2的過度表達(dá)等等。同時(shí)發(fā)現(xiàn)P53、Rb、CDKN2、DuTT1、FHIT、BAP-1等抑癌基因的突變、缺失、轉(zhuǎn)導(dǎo)、易位及甲基化等改變。細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的分析,還發(fā)現(xiàn)多個(gè)染色體上某些基因的改變與肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。近年來還發(fā)現(xiàn)端粒酶,hnRNPA2/B1有較高的癌變預(yù)測(cè)意義。為檢測(cè)這些基因的改變,相繼建立和發(fā)展起來多種分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù),如各種PCR技術(shù)(RT-PCR.PCR-SSCP.PCR-RFLPs),各種核酸雜交技術(shù)(Southern、Northern、比較基因組雜交技術(shù)等),以及近年來發(fā)展起來的熒光原位雜交技術(shù)(FISH)和微衛(wèi)星多態(tài)性分析技術(shù)等。但這些技術(shù)對(duì)肺癌的診斷均需依賴于病灶組織或病變細(xì)胞的獲得,陽性樣本的獲取均有較大的難度,而且難于在肺癌的早期階段采集到所需的標(biāo)本,使這些技術(shù)在肺癌的早期診斷中難以發(fā)揮相應(yīng)的作用。加之這些技術(shù)需要特殊試劑和儀器、操作復(fù)雜、價(jià)格昂貴、其敏感性、特異性和準(zhǔn)確性尚難以定論,目前國(guó)內(nèi)外均未將這些技術(shù)作為人群普查篩檢早期肺癌的手段和方法。
目前大約已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了60余種肺癌生物標(biāo)志物,它們或與人肺癌直接相關(guān),或與不同種類的肺癌相關(guān),或與肺癌預(yù)后相關(guān),或與肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān),或與肺癌臨床分期相關(guān),或與肺癌耐藥相關(guān)等等。這些抗原包括ACE、ADH、AFP、AgNORs、ANP、AHH、blood group antigens、BN/GRP、CA125、CA19-9、CA242、CA50、Cadherins、Clcitonin、Cathepsin B、CC10、CEA、Cholecystokinin-B/gastrin receptor、CK-BB、c-N-L-myc、Cyclin D1、CYFRA 21-1、CYFRA21.1、CYP1A1/GSTM1、EGFR、Epithelial glycoprotein 1、Epithelial glycoprotein 2、Ferritin、Gangliosidefucosyl-GM1(FucGM1)、Glutathione-S-transferase、HER2、Heterogeneous nuclearribonucleoprotein A2/B1、H-K-N-ras、IGF-I、IL-2R、Integrins、Ki-67、Lewis antigens、Le-y、MMP-9、MUC1、NCAM、NeuAc、NSE、P53、PCNA、Peptid hormones ACTH、Phosphopyruvate Hydratase、pro GRP、p21、SCC抗體、sialyl SSEA-1、SLX、TA-4、Telomerase、TGF-a、胸苷激酶、TPA、鐵傳遞蛋白、uPA等等。Kulpa,J,Wojcik,E.,Radkowski,A.,Kolodziejski,L.,and StasiK,Z.CYFRA 21-1,TPA-M,TPS,SCC-Ag和CEA在鱗狀細(xì)胞肺癌病人和化工產(chǎn)業(yè)工人對(duì)照人群中的情況.抗癌癥研究2000,20(6D)5035-5040.Nguyen,V.N.,Mirejovsky,T.,Melinova,L.,and Mandys,V.CD44和它的v6剪接變體在肺癌中與NCAM,CEA,EMA和UP1以及預(yù)后因子相關(guān).贅生物,2000,47(6)400-408.Alatas,F(xiàn).,Alatas,O.,Metintas,M.,Colak,O.,Harmanci,E.,andDemir,S.CEA,CA 15-3,CA 19-9,CYFRA21-1,NSE和TSA試驗(yàn)在胸水中的診斷價(jià)值.肺癌,2001,31(1)9-16.Foa,P.,F(xiàn)ornier,M.,Miceli,R.,Seregni,E.,Santambrogio,L.,Nosotti,M.,Massaron,S,Cataldo,L.,Oldani,S.,Iurlo,A.,Caldiera,S.,and Bombardieri,E.,在可切除性非小細(xì)胞肺癌中術(shù)前CEA,NSE,SCC,TPA和CYFRA 21.1血清水平可作為預(yù)后指標(biāo).生物標(biāo)志物國(guó)際期刊,1999,14(2)92-98.Graziano,S.L.,Kern,J.A.,Herndon,J.E.,Tatum,A.,Brisson,M.L.,Memoli,V.,Sugarbaker,D.,Skarin,A.T.,Kreisman,H.,and Green,M.R.IIIA期非小細(xì)胞肺癌化療前后神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志,HER2和CEA的分析癌癥和淋巴瘤組B研究.肺癌,1998,21(3)203-211.Abe,S.肺癌的分子生物學(xué)預(yù)后指標(biāo)。日本Geka Gakkai雜志,1997,98(1)2-7.Fukuda,M.and Oka,M.[血清腫瘤標(biāo)志物在肺癌診斷中的作用和不足].日本Rinsho,1996,54(6)1610-1615.Moro,D.,Villemain,D.,Vuillez,J.P.,Delord,C.A.,andBrambilla,C.CEA,CYFRA21-1和SCC在非小細(xì)胞肺癌中.肺癌,1995,13(2)169-176.Giovanella,L.,Ceriani,L.,Bandera,M.,Beghe,B.,andRoncari,G.血清標(biāo)志物CEA,NSE,TPS和CYFRA 21.1在肺癌中應(yīng)用的評(píng)估.生物標(biāo)志物國(guó)際期刊,1995,10(3)156-160.Niklinski,J.and Furman,M.肺癌的臨床腫瘤標(biāo)志物.歐洲癌癥期刊Prev.,1995,4(2)129-138.)。這些肺癌相關(guān)生物標(biāo)志物中,多數(shù)屬于位于胞漿的類型,另外的AFP、CA125、CA19-9、CA242、CA50、Cadherins、Cholecystokinin-B/gastrin receptor、Epithelial glycoprotein 1、Epithelialglycoprotein 2、HER2、CEA、Integrins、Lewis antigens、MUC1、NCAM等標(biāo)志物位于肺癌細(xì)胞表面,大致分為三大類,受體類、細(xì)胞表面粘附分子和細(xì)胞表面糖蛋白類。總的來說,這些標(biāo)志物單獨(dú)診斷肺癌的意義不是太高,但聯(lián)合檢測(cè)仍具有一定的診斷、判斷預(yù)后的意義。例如,NSE在小細(xì)胞肺癌中的陽性率為60-85%,CEA達(dá)50-60%,而HER2僅達(dá)30-50%。
以上方法均是直接檢測(cè)樣品中發(fā)生改變的抗原、蛋白或基因。與以上檢測(cè)方法明顯不同,近年來發(fā)現(xiàn)腫瘤病人血液中含有針對(duì)腫瘤抗原或自身抗原的抗體,某些抗原的相應(yīng)抗體在正常人和腫瘤病人中的分布呈現(xiàn)一定的特異性,可能具有一定的診斷價(jià)值。但目前發(fā)現(xiàn)的這些種類的抗原在腫瘤病人當(dāng)中陽性率低,單獨(dú)應(yīng)用或少數(shù)幾種聯(lián)合應(yīng)用時(shí)診斷的靈敏度和準(zhǔn)確度都不夠,不能作為一種新的診斷方法。目前根據(jù)研究該類抗原的權(quán)威組織統(tǒng)計(jì)(http://www2.licr.org/CancerImmunomeDB/SerexSearchDB.php),在小細(xì)胞肺癌中,這類抗原已發(fā)現(xiàn)5個(gè),分別是DRCTNNB1A、ID4、SOX1、SOX2、ZIC2;而在非小細(xì)胞肺癌當(dāng)中,尚未直接分離到這種抗原。在其他腫瘤中,也發(fā)現(xiàn)了可以與肺癌交叉反應(yīng)的這類抗原,如NY-ESO-1、CEA等,但肺癌陽性率低,不具有單獨(dú)的診斷肺癌的意義。
綜上所述,上述眾多的肺癌診斷技術(shù)中,目前國(guó)外常用的肺癌篩檢診斷技術(shù)為痰細(xì)胞學(xué)檢查、X光片和螺旋CT等技術(shù),其檢出率仍不高,國(guó)內(nèi)常用的仍然是檢出率較低的痰細(xì)胞學(xué)和X光片技術(shù)。因此,研究開發(fā)易于在人群篩查中廣泛推廣應(yīng)用的簡(jiǎn)便、快速、高效、經(jīng)濟(jì)、無創(chuàng)無痛的早期肺癌篩查早診技術(shù)是國(guó)內(nèi)外攻克肺癌早診“關(guān)口”的難點(diǎn)和重點(diǎn)。從血液中檢測(cè)各種分子標(biāo)志物的技術(shù)方法,具有簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、快速、無創(chuàng)無痛易于接受的特點(diǎn),優(yōu)于上面所述的各種技術(shù),但是目前尚缺乏敏感性和特異性均較高的檢查指標(biāo)。肺癌涉及的多種基因及分子的改變均難以在血清中檢出。但目前尚未見到任何關(guān)于采用多種蛋白質(zhì)抗原檢測(cè)血清中相應(yīng)抗體的含量,并以此判斷被檢人是否患有肺癌的報(bào)道。目前也尚未見到多蛋白樣品的蛋白質(zhì)芯片用于檢測(cè)人血清中相應(yīng)抗體含量的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
因此,為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足,本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種新的可用于診斷人肺癌的蛋白質(zhì)芯片,該蛋白質(zhì)芯片包含但不是僅僅包含序列號(hào)1-12特定的蛋白質(zhì)抗原,通過該蛋白質(zhì)芯片可以檢測(cè)被檢人血液(血清、血漿或全血成分)中這些特定的抗原的相應(yīng)抗體的含量,聯(lián)合分析這種抗原相應(yīng)抗體檢測(cè)的結(jié)果,可以用來判定被檢人是否患有肺癌。
本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一類由上述蛋白質(zhì)芯片衍生制成的診斷肺癌的試劑盒。
本發(fā)明的第三個(gè)目的在于所述的診斷人肺癌的蛋白質(zhì)芯片及其衍生的診斷試劑盒在肺癌診斷、健康人群或高危人群肺癌篩查中的應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面,本發(fā)明提供了一種新的可用于診斷人肺癌的蛋白質(zhì)芯片,所述蛋白質(zhì)芯片的特征在于1)包含,但不僅僅包含,以下序列號(hào)抗原的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)(1)序列號(hào)1所示氨基酸序列的MAGEA1抗原片段;(2)序列號(hào)2所示氨基酸序列的MATK抗原片段;(3)序列號(hào)3所示氨基酸序列的MAGEA3抗原片段;(4)序列號(hào)4所示氨基酸序列的CCT8抗原片段;(5)序列號(hào)5所示氨基酸序列的TP53抗原片段;(6)序列號(hào)6所示氨基酸序列的ZNF258抗原片段;(7)序列號(hào)7所示氨基酸序列的PRC1抗原片段;(8)序列號(hào)8所示氨基酸序列的C14orf104抗原片段;(9)序列號(hào)9所示氨基酸序列的EEF1A1抗原片段;(10)序列號(hào)10所示氨基酸序列的ZIC2抗原片段;(11)序列號(hào)11所示氨基酸序列的SOX2抗原片段;以及(12)序列號(hào)1所示氨基酸序列的S100A10抗原片段。
通過檢測(cè)人的血液樣品來檢測(cè)樣品中所述的序列號(hào)1-12蛋白質(zhì)的相應(yīng)抗體的含量,以通過聯(lián)合分析各蛋白質(zhì)相應(yīng)抗體的檢測(cè)結(jié)果可以判斷被檢人是否為肺癌。
在本發(fā)明中,所述的抗原是指包含上述氨基酸殘基序列的任何多肽、蛋白質(zhì)或融合蛋白質(zhì)。因?yàn)楸景l(fā)明是采用這些蛋白質(zhì)抗原檢測(cè)可以與之結(jié)合的抗體,因此在技術(shù)上是顯而易見的,只要采用包含上述氨基酸殘基序列的任何多肽、蛋白質(zhì)或融合蛋白質(zhì),均可以具有幾乎相同的免疫學(xué)特性,從而也可以用于檢測(cè)可以與這些蛋白質(zhì)抗原結(jié)合的抗體。
本發(fā)明上述的序列號(hào)1至序列號(hào)12所述的12種抗原是經(jīng)采用混合人肺癌原發(fā)病灶組織(包括1例肺腺癌、1例肺鱗癌、1例小細(xì)胞肺癌)建立表達(dá)cDNA文庫,并通過20例自體和異體肺癌病人血清進(jìn)行免疫印跡篩選、削減抑制雜交篩選、去Ig背景篩選后獲得的在肺癌病人血清中存在相應(yīng)抗體的抗原,在篩選完2×106pfu的庫之后,共獲得了50個(gè)可與肺癌病人血清反應(yīng)的蛋白質(zhì)抗原克隆。
將上述抗原的基因克隆入帶有正確讀碼框的原核表達(dá)載體(例如pET30-b(+)),通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá),提取包函體并初步純化,獲得了該肺癌抗原的重組蛋白。采用上述重組蛋白,以適量濃度點(diǎn)于免疫印跡膜上,采用肺癌和正常人血清各20例,并采用酶聯(lián)免疫印跡法檢測(cè),挑選正常人的陽性率與肺癌病人的陽性率有較大差異的克隆。按此方法獲得了16個(gè)與正常人血清反應(yīng)的陽性率與肺癌病人有較大差異的抗原克隆。
將前述獲得的抗原的重組蛋白采用生物芯片點(diǎn)樣機(jī)點(diǎn)樣于醛基化的玻璃基片上,每點(diǎn)的濃度約1-2mg/ml,點(diǎn)樣量約4-10nl。采用免疫熒光的方法檢測(cè)被檢血清中針對(duì)這些抗原的人抗體。共采用上述方法檢測(cè)了400例肺癌病人血清和400例正常人血清,結(jié)果顯示,其中12種抗原在肺癌病人血清和正常人血清中的相應(yīng)抗體存在較大的差異,聯(lián)合分析診斷肺癌的靈敏度可達(dá)88.0%,而準(zhǔn)確度也可達(dá)83.9%。這12種抗原分別是(1)MAGEA1抗原片段,(2)MATK抗原片段,(3)MAGEA3抗原片段,(4)CCT8抗原片段,(5)TP53抗原片段,(6)ZNF258抗原片段,(7)PRC1抗原片段,(8)C14orf104抗原片段,(9)EEF1A1抗原片段,(10)ZIC2抗原片段,(11)SOX2抗原片段,(12)S100A10抗原片段。以上結(jié)果說明采用含上述12種蛋白質(zhì)抗原的蛋白質(zhì)芯片檢測(cè)上述12種抗原血液中相應(yīng)抗體的含量,并且進(jìn)行聯(lián)合分析,判斷被檢人是否患有肺癌對(duì)于肺癌診斷具有較高的靈敏度和特異度,具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值。進(jìn)一步,采用這種蛋白質(zhì)芯片對(duì)400例肺部良性病變的病人的血清進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果該蛋白質(zhì)芯片對(duì)區(qū)分肺部良性病變具有較好的特異性,僅僅有20%的假陽性率,鑒別診斷的效果良好。
綜上所述,本發(fā)明提供了一種新的可用于診斷人肺癌的蛋白質(zhì)芯片,該蛋白質(zhì)芯片可用于聯(lián)合檢測(cè)分析被檢人血液中12種特定抗原相應(yīng)抗體的含量,從而判斷被檢人是否為肺癌患者。該蛋白質(zhì)芯片采用被檢人的血液樣品為檢測(cè)樣品,可采用各種適宜的方法分別檢測(cè)12種特定抗原的相應(yīng)特異性抗體在樣品中的相對(duì)含量,每種抗原相應(yīng)抗體的相對(duì)含量都有一個(gè)相應(yīng)的閾值,被檢血樣高于(或低于)此值的被判斷為陽性,聯(lián)合分析這12種抗原相應(yīng)抗體陽性的總數(shù),當(dāng)被檢人的12種抗原陽性總數(shù)的值大于一個(gè)相應(yīng)的閾值時(shí),該被檢人被判為陽性,即被診斷為肺癌患者。該蛋白質(zhì)芯片經(jīng)在400人的肺癌患者和400人的正常人中驗(yàn)證,其靈敏度為88.0%,準(zhǔn)確度為83.9%。該蛋白質(zhì)芯片的創(chuàng)新之處在于1)檢測(cè)的指標(biāo)是12種抗原的相應(yīng)抗體在被檢人血清中的含量,即被檢人在體內(nèi)自發(fā)產(chǎn)生的針對(duì)這12種抗原的自身抗體的水平,而不是這12種抗原本身在被檢人體內(nèi)的表達(dá)水平。相對(duì)直接檢測(cè)抗原本身來說,抗原的相應(yīng)抗體在肺癌發(fā)生的早期就可以產(chǎn)生,此時(shí)抗原也許尚不能在血液中被檢出,因而比直接檢測(cè)抗原來說可診斷的肺癌可能更?。豢乖南鄳?yīng)抗體更容易進(jìn)入血液循環(huán)而被檢測(cè)到,同時(shí)人體可以對(duì)微量抗原產(chǎn)生相當(dāng)多的相應(yīng)抗體,具有一定的放大作用;另外,人體對(duì)這12種抗原產(chǎn)生相應(yīng)抗體的情況也在一定程度反映了人體抗肺癌免疫反應(yīng)的狀態(tài),在一定程度上加強(qiáng)了檢測(cè)結(jié)果反映被檢人是否患有肺癌的準(zhǔn)確性。2)結(jié)果判定是在聯(lián)合分析12種抗原相應(yīng)抗體檢測(cè)結(jié)果的基礎(chǔ)上做出的,具有更好的靈敏度和準(zhǔn)確度?,F(xiàn)行的肺癌診斷技術(shù)方法目前均采用單一指標(biāo),所以診斷的靈敏度和準(zhǔn)確度往往達(dá)不到很高。本發(fā)明所采用的12種抗原單獨(dú)檢測(cè)肺癌的靈敏度和準(zhǔn)確度都不是很高,但聯(lián)合分析之后該方法診斷肺癌的靈敏度和準(zhǔn)確度都大大提高,達(dá)到了一個(gè)臨床可接受的水平。多標(biāo)志物聯(lián)合分析的觀點(diǎn)與現(xiàn)在公認(rèn)的肺癌發(fā)生是一個(gè)多基因、多過程參與的觀點(diǎn)是相一致。3)該蛋白質(zhì)芯片所采用的12種抗原中有7種(MATK抗原片段、CCT8抗原片段、ZNF258抗原片段、PRC1抗原片段、C14orf104抗原片段、EEF1A1抗原片段、S100A10抗原片段)目前尚未見到肺癌病人體內(nèi)存在相應(yīng)抗體的報(bào)道,也尚未見到其用于診斷、檢測(cè)肺癌的報(bào)道。
根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面,提供一類由上述蛋白質(zhì)芯片衍生的診斷肺癌的試劑盒,這類診斷肺癌的試劑盒可用于非侵入性地診斷人肺癌。這類診斷試劑盒采用了但不是僅僅采用本發(fā)明提供的新的蛋白質(zhì)芯片,實(shí)際上,這些試劑盒可以在本領(lǐng)域共知的范圍內(nèi),加上其它一些對(duì)照以便進(jìn)行結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)化判斷,或是在本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)芯片所包含的12種蛋白質(zhì)抗原的基礎(chǔ)上,再增加其它的檢測(cè)指標(biāo)來聯(lián)合判斷。另外,由本發(fā)明提供的肺癌診斷方法衍生的試劑盒也可以采用本領(lǐng)域共知的范圍內(nèi)的多種技術(shù)手段來檢測(cè)各抗原相應(yīng)抗體的含量,實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的,例如免疫熒光、免疫印跡、放射免疫、酶聯(lián)免疫吸附等,檢測(cè)抗原相應(yīng)抗體的手段的不同并不會(huì)影響對(duì)該被檢人是否為肺癌患者的判斷。
根據(jù)本發(fā)明提供的新的診斷人肺癌的蛋白質(zhì)芯片,很容易獲得由該蛋白質(zhì)芯片衍生的各種診斷試劑盒。本發(fā)明提供的可用于肺癌診斷的蛋白質(zhì)芯片的核心關(guān)鍵在于該芯片上所包含的12種蛋白質(zhì)抗原的種類(蛋白質(zhì)具體的氨基酸序列),從而可以通過該蛋白質(zhì)芯片檢測(cè)這12種特定抗原相應(yīng)抗體在被檢人血液中的含量,從本技術(shù)領(lǐng)域的普通專業(yè)知識(shí)很容易推出,采用何種技術(shù)手段檢測(cè)抗原相應(yīng)抗體的含量,以及采用何種抗原的存在形式(天然抗原、重組蛋白抗原、合成多肽)來檢測(cè)均不會(huì)影響該方法對(duì)被檢人是否患有肺癌的判斷;并且,在任何肺癌診斷試劑盒中只要包含了檢測(cè)本發(fā)明所述方法的12個(gè)抗原的相應(yīng)抗體的檢測(cè)指標(biāo),該試劑盒檢測(cè)肺癌的靈敏度和特異度就應(yīng)該至少達(dá)到本發(fā)明涉及的方法的靈敏度和準(zhǔn)確度,額外地增加其它肺癌相關(guān)的檢測(cè)指標(biāo)一般均能在本發(fā)明涉及的方法的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高診斷靈敏度和準(zhǔn)確度。下面舉一些簡(jiǎn)單的制備本發(fā)明涉及的肺癌診斷方法衍生的試劑盒的例子,可以通過以下方法獲得衍生試劑盒,但不只限于下列方法。在大腸桿菌中表達(dá)包含有本發(fā)明所述的12種抗原特征氨基酸序列的重組蛋白或重組融合蛋白,純化分離這些目標(biāo)蛋白,使其純度達(dá)到80%以上,在各抗原以及人IgG、人IgM(以上兩種為對(duì)照,以便進(jìn)行橫向參比)中加入適量的生物素化的BSA,以適宜的濃度點(diǎn)樣于經(jīng)醛基化處理的玻璃基片上,抗原將共價(jià)交聯(lián)于基片之上,采用牛血清封閉剩余的交聯(lián)位點(diǎn),干燥后低溫干燥保存,這就是試劑盒中的檢測(cè)玻片;將人IgG及人IgM抗體標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行倍比稀釋,選擇適宜的濃度梯度點(diǎn)樣于經(jīng)醛基化處理的玻璃片基上,抗體標(biāo)準(zhǔn)品將共價(jià)交聯(lián)于基片之上,采用牛血清封閉剩余的交聯(lián)位點(diǎn),干燥后低溫干燥保存,這就是試劑盒中的檢測(cè)校正玻片;將含10%牛血清的PBS(0.01mol/Lm,pH7.4)無菌過濾裝瓶,這就是樣品稀釋液;將含0.02%Tween20的PBS(0.01mol/Lm,pH7.4)無菌過濾裝瓶,這就是洗滌液;將含有適宜稀釋度的鏈霉親和素-Cy5熒光標(biāo)記二抗、鏈霉親和素-Cy3熒光標(biāo)記二抗、羊抗人IgG-Cy5熒光標(biāo)記二抗及羊抗人IgM-Cy3熒光標(biāo)記二抗裝瓶,這就是熒光二抗。以上五種成分即可組裝成一種由本發(fā)明所述方法衍生的肺癌診斷試劑盒,應(yīng)用時(shí),在檢測(cè)玻片的點(diǎn)樣區(qū)加入熒光標(biāo)記的鏈霉親和素37℃下保濕孵育1小時(shí),采用洗滌液洗滌3次。將被檢人血清取2μl,以樣品稀釋液稀釋至20μl,取10μl加在檢測(cè)玻片上覆蓋點(diǎn)樣區(qū),37℃下保濕孵育1小時(shí);而取10ul的稀釋液加在檢測(cè)校正玻片上覆蓋點(diǎn)樣區(qū)。采用洗滌液洗滌3次,加入與鏈霉親和素標(biāo)記熒光不同的抗人IgG或人IgM熒光二抗(例如,鏈霉親和素為Cy-3標(biāo)記,則加入羊抗人IgG-Cy5熒光標(biāo)記二抗),37℃下保濕孵育1小時(shí),采用洗滌液洗滌5次,干燥后在激光共聚焦芯片讀片機(jī)上讀取各點(diǎn)樣點(diǎn)熒光的顏色和強(qiáng)度。各抗原點(diǎn)樣點(diǎn)的熒光強(qiáng)度代表了相應(yīng)抗體的相對(duì)含量,生物素化的BSA與鏈霉親和素反應(yīng)的熒光強(qiáng)度可作為抗原抗體反應(yīng)的內(nèi)參照,人IgG、IgM的熒光強(qiáng)度可作為各被檢人橫向參比的對(duì)照,而由不同稀釋度的人IgG或IgM抗體標(biāo)準(zhǔn)品的熒光強(qiáng)度繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線可作為抗體含量的量化標(biāo)準(zhǔn)和批間反應(yīng)的對(duì)照。按預(yù)先確定好的各抗原的閾值分析各抗原熒光強(qiáng)度的數(shù)據(jù),可判斷被檢人該抗原相應(yīng)抗體是否為陽性,累加12種抗原的陽性數(shù),再根據(jù)預(yù)先確定的陽性數(shù)閾值即可判斷該被檢人是否為肺癌患者。在上述衍生試劑盒的基礎(chǔ)上,可再增加檢測(cè)指標(biāo),例如,將癌胚抗原(CEA)額外作為1種抗原也點(diǎn)于玻片上,就可以衍生出另外一種試劑盒,并可能增加該試劑盒診斷肺癌的靈敏度和準(zhǔn)確度。
根據(jù)本發(fā)明的第三方面,本發(fā)明還提供了所述的診斷人肺癌的蛋白質(zhì)芯片及其衍生的診斷試劑盒在肺癌診斷、健康人群或高危人群肺癌篩查中的應(yīng)用。
針對(duì)臨床上被懷疑為肺癌的被檢者,可抽取其血液樣品,采用本發(fā)明所涉及的診斷人肺癌的蛋白質(zhì)芯片及其衍生的診斷試劑盒,檢測(cè)被檢人血液中所述的12種抗原相應(yīng)抗體的含量,進(jìn)而判斷被檢者是否為肺癌患者。由于檢測(cè)方法或試劑盒的各種對(duì)照的差異,判斷被檢者是否為肺癌的標(biāo)準(zhǔn)并不是唯一的,一旦被檢者被采用本發(fā)明判斷涉及的診斷方法或由該方法衍生的試劑盒判斷為患有肺癌,則應(yīng)高度懷疑被檢者為實(shí)際肺癌患者,并采用各種檢測(cè)手段進(jìn)行各種臨床確診,如臨床不能發(fā)現(xiàn)病灶,則應(yīng)密切隨訪監(jiān)測(cè)被檢者肺癌發(fā)生發(fā)展的情況。
對(duì)于普通的健康人群或醫(yī)學(xué)上定義的肺癌高危人群,則可以采用本發(fā)明所涉及的診斷人肺癌的蛋白質(zhì)芯片及其衍生的診斷試劑盒對(duì)他們進(jìn)行普查篩檢,抽取被檢人群的血液樣本,按上述方法判定其是否患有肺癌,一旦被檢者被采用本發(fā)明判斷涉及的診斷方法或由該方法衍生的試劑盒判斷為患有肺癌,則應(yīng)采用各種檢測(cè)手段進(jìn)行各種臨床確診,如臨床不能發(fā)現(xiàn)病灶,則應(yīng)密切隨訪監(jiān)測(cè)被檢者肺癌發(fā)生發(fā)展的情況。
總的來說,利用本發(fā)明提供的新的診斷人肺癌的蛋白質(zhì)芯片及其衍生的診斷試劑盒,則可以非常方便、快捷、無創(chuàng)、高效地診斷或普查篩檢肺癌疑似患者或肺癌高危人群,以及參加檢測(cè)的正常健康人群。
下面將結(jié)合多種實(shí)施例來說明如何實(shí)施本發(fā)明所述的新的診斷人肺癌的蛋白質(zhì)芯片,如何由該蛋白質(zhì)芯片衍生出相應(yīng)的試劑盒,以及如何用上述新的診斷人肺癌的蛋白質(zhì)芯片及其衍生的診斷試劑盒診斷、普查、篩檢肺癌疑似患者、肺癌高危人群以及健康人群。
具體實(shí)施例方式
以下將參照實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明,其中實(shí)施例1制備新的診斷人肺癌的蛋白質(zhì)芯片并檢測(cè)被檢血清樣本本發(fā)明涉及的新的診斷人肺癌的蛋白質(zhì)芯片可以通過多種具體的技術(shù)實(shí)施,下面就進(jìn)行較詳細(xì)的描述將本方法涉及的12種抗原吸附或共價(jià)交聯(lián)于適宜的固相支持物上。這12種抗原可以是提純的天然蛋白,或是重組表達(dá)的蛋白,或是重組表達(dá)的含有各抗原特征氨基酸序列的重組融合蛋白,或是直接合成的各抗原特征氨基酸序列的多肽。所指的固相支持物可以是玻片、免疫印跡膜、免疫吸附所用的各種微孔板等。可以采用靜電作用的方式將抗原直接吸附于固相支持物上,也可以采用共價(jià)交聯(lián)的方式交聯(lián)于固相支持物上。具體舉例為,取適量生物素化的BSA加入到這12種純化后的抗原重組蛋白中,然后加入終濃度為0.05%的Tween-20,充分混勻后以1mg/ml-2mg/ml的濃度點(diǎn)樣于醛基化的玻璃基片表面,此時(shí)這12種抗原被以共價(jià)交聯(lián)的方式交聯(lián)于玻片表面,即已經(jīng)制備成功可用于診斷人肺癌的蛋白質(zhì)芯片。然后再采用牛血清封閉玻片表面的其它未交聯(lián)的反應(yīng)位點(diǎn)。
封閉后首先將Cy3或者Cy5標(biāo)記的鏈霉親和素與吸附或共價(jià)交聯(lián)這12種抗原的固相支持物表面混合孵育。經(jīng)通常免疫學(xué)技術(shù)采用的各種洗滌劑洗滌后,加入被檢血樣品與固相支持物表面混合孵育,使得被檢血樣品中的這12種抗原的相應(yīng)抗體與固相支持物表面的抗原結(jié)合,從而間接地吸附于固相支持物表面。再經(jīng)通常免疫學(xué)技術(shù)采用的各種洗滌劑洗去非特異吸附的雜蛋白,在固相支持物表面留下相應(yīng)的人抗體和熒光標(biāo)記的鏈霉親和素。具體舉例,將1∶80稀釋的Cy5標(biāo)記的鏈霉親和素或者1∶800稀釋的Cy3標(biāo)記的鏈霉親和素與已封閉的玻片37度保濕孵育1小時(shí)后,采用0.01mol/L的pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗玻片3次。然后將1∶10稀釋的被檢血清與上述已封閉后的玻片室溫保濕孵育1小時(shí),棄被檢血清,采用0.01mol/L的pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗玻片3次。
可以采用多種常用免疫學(xué)方法探測(cè)上述存留于固相支持物表面的相應(yīng)人抗體,例如免疫熒光法、免疫酶法、化學(xué)發(fā)光法、放射免疫法、酶聯(lián)免疫吸附法、免疫印跡法等。具體舉例,可采用免疫熒光法。在與Cy3-鏈霉親和素反應(yīng)后的玻片內(nèi)加入羊抗人IgG-Cy5二抗,而在與Cy5-鏈霉親和素反應(yīng)后的玻片內(nèi)加入羊抗人IgM-Cy3二抗,保濕孵育1小時(shí)。棄熒光二抗液,采用0.01mol/L的pH7.4的PBS沖洗玻片3次,去離子水沖洗玻片1次??諝飧稍?,于激光共聚焦芯片掃描儀下讀取635nm和530nm的各點(diǎn)熒光強(qiáng)度和面積。其中635nm下該點(diǎn)的總熒光量(或平均熒光強(qiáng)度)代表被檢血清中該點(diǎn)抗原相應(yīng)的IgG抗體的相對(duì)含量,530nm下該點(diǎn)的總熒光量(或平均熒光強(qiáng)度)代表被檢血清中該點(diǎn)抗原相應(yīng)的IgM抗體的相對(duì)含量。然后進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理首先,將檢測(cè)所得抗原點(diǎn)的熒光強(qiáng)度與點(diǎn)內(nèi)生物素及鏈霉親和素反應(yīng)的熒光強(qiáng)度相除。其次,如果檢測(cè)的抗體類型為IgG,在此步驟將經(jīng)過第一步處理后的數(shù)據(jù)與經(jīng)同樣處理的IgG標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)值相除;如果檢測(cè)的抗體類型為IgM,在此步驟將經(jīng)過第一步處理后的數(shù)據(jù)與經(jīng)同樣處理的孔內(nèi)IgM標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)值相除。第三,將IgG或者IgM標(biāo)準(zhǔn)片的數(shù)據(jù)同樣按照以上兩個(gè)步驟進(jìn)行處理。然后根據(jù)IgG或者IgM抗體的稀釋度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過不同批次標(biāo)準(zhǔn)曲線的不同,對(duì)不同批次的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行校正。然后將第二步的數(shù)據(jù)代入標(biāo)準(zhǔn)曲線的公式計(jì)算抗原在血清中的相應(yīng)抗體含量。參照設(shè)立的對(duì)照并與相應(yīng)的判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較,可以判斷該被檢人的該抗原的相應(yīng)抗體是否為陽性。
確定單個(gè)抗原是否為陽性后,聯(lián)合分析12個(gè)抗原的結(jié)果,計(jì)算總的抗原陽性的個(gè)數(shù),再與相應(yīng)的判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較,凡大于規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)值者即可判斷為肺癌患者。
實(shí)施例2序列號(hào)1-12相應(yīng)抗原的制備編碼本發(fā)明所述的(1)MAGEA1抗原片段,(2)MATK抗原片段,(3)MAGEA3抗原片段,(4)CCT8抗原片段,(5)TP53抗原片段,(6)ZNF258抗原片段,(7)PRC1抗原片段,(8)C14orf104抗原片段,(9)EEF1A1抗原片段,(10)ZIC2抗原片段,(11)SOX2抗原片段,(12)S100A10抗原片段,CCT8抗原片段、EEF1A1抗原片段、S100A10抗原片段、MATK抗原片段、ZNF258抗原片段、SOX2抗原片段、MAGEA3抗原片段、TP53抗原片段的DNA片段已預(yù)先采用EcoR I和Xho I酶克隆在pBluescript SK(+/-)原核克隆載體中。EcoR I和XhoI雙酶切重組表達(dá)載體pET30-b(+),回收約5.4kb的雙酶切片段備用。EcoR I和XhoI雙酶切含各抗原片段基因的pBluescript SK(+/-)載體,回收各抗原相應(yīng)的雙酶切片段,分別克隆入回收的pET30-b(+)表達(dá)載體中。再分別采用EcoR I和Xho I雙酶切篩選重組克隆。采用堿裂解法大量提取質(zhì)粒,以0.1μg的DNA轉(zhuǎn)化BL21大腸桿菌。挑取轉(zhuǎn)化克隆,在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600約0.6,加入終濃度為2mM的IPTG誘導(dǎo)表達(dá),4小時(shí)以后離心收獲菌體。超聲波震蕩破碎菌體,離心收集沉淀,沉淀為含有目的抗原蛋白的包函體。8M尿素溶解沉淀,4度放置12小時(shí)以上,離心去除不溶物,與Ni親和層析柱混合結(jié)合1小時(shí)。結(jié)合后裝柱,采用pH6.5的8M尿素洗滌層析柱20倍柱體積,然后采用pH5.9的8M尿素洗脫層析柱10倍柱體積,分部收集,最后采用pH4.5的8M尿素洗脫層析柱10倍柱體積,分部收集。洗脫各組分分別上樣進(jìn)行SDS-PAGE分析,選擇目的蛋白所在的組分進(jìn)行復(fù)性。將目的蛋白所在的組分合并后調(diào)整蛋白濃度至0.25mg/ml,對(duì)含2M尿素的緩沖液透析,4度透析12小時(shí),再對(duì)含0.2M尿素的緩沖液透析,4度透析12小時(shí),再對(duì)含0.02M尿素的緩沖液透析,4度透析12小時(shí),再對(duì)不含尿素的緩沖液透析,4度透析12小時(shí)。采用PEG20000吸水濃縮的方法濃縮各抗原至最終濃度為1mg/ml-2mg/ml。離心去沉淀,Lowrry法測(cè)定蛋白含量,獲得各抗原的重組蛋白。
實(shí)施例3診斷肺癌的蛋白質(zhì)芯片的衍生試劑盒的制備(蛋白芯片診斷試劑盒)(一)試劑盒的組成1.預(yù)點(diǎn)抗原的蛋白芯片。
2.IgG/IgM抗體標(biāo)準(zhǔn)片。
3.樣品稀釋液。
4.洗滌液濃縮液。
5.熒光標(biāo)記抗人抗體二抗的濃縮液。
6.熒光標(biāo)記鏈霉親和素的濃縮液。
7.試劑盒說明書。
(二)試劑盒各組成成份的制備1.預(yù)點(diǎn)抗原的蛋白芯片的制備購買商品化的BSA包被并經(jīng)醛基化處理后的載體玻片,例如美國(guó)CELAssociates公司的CSS-100型玻片。采用實(shí)施例2制備的12種抗原的純化重組蛋白,以及人IgG(0.2mg/ml)、人IgM(0.2mg/ml)標(biāo)準(zhǔn)品作為樣品,加入適量的生物素化的BSA和tween-20,采用生物芯片點(diǎn)樣機(jī)將上述14種樣品點(diǎn)于載體玻片上形成微陣列,每玻片點(diǎn)10個(gè)平行的微陣列,每個(gè)微陣列之間采用貼上適宜大小的塑料膜分割開來,每個(gè)樣品每點(diǎn)點(diǎn)樣約4nl、2個(gè)平行點(diǎn)。點(diǎn)樣結(jié)束后保濕放置4小時(shí)促進(jìn)樣品交聯(lián)于玻片之上,然后在玻片表面加上一層含20%胎牛血清的PBS,室溫保濕放置1小時(shí)后4℃放置過夜,以充分封閉玻片上的非特異蛋白交聯(lián)或結(jié)合位點(diǎn)。棄去液體,空氣干燥,將玻片放置于鋁箔塑料袋中充氮干燥密封,置于4℃下保存。以上過程制備成功預(yù)點(diǎn)抗原的蛋白芯片。
2.IgG/IgM抗體標(biāo)準(zhǔn)片的制備采用0.01mol/L的pH7.4的PBS對(duì)IgG和IgM抗體的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行稀釋,分別配制6個(gè)稀釋度的抗體溶液,包括0ug/ml、10ug/ml、20ug/ml、40ug/ml、80ug/ml和160ug/ml。在每份抗體樣品中加入適量的生物素化的BSA,然后加入終濃度為0.05%的Tween-20,充分混勻。采用生物芯片點(diǎn)樣機(jī)將上述抗體標(biāo)準(zhǔn)品樣品點(diǎn)于載體玻片上形成微陣列,每玻片點(diǎn)10個(gè)平行的微陣列,每個(gè)微陣列之間采用貼上適宜大小的塑料膜分割開來,每個(gè)樣品每點(diǎn)點(diǎn)樣約4nl、2個(gè)平行點(diǎn)。點(diǎn)樣結(jié)束后保濕放置4小時(shí)促進(jìn)樣品交聯(lián)于玻片之上,然后在玻片表面加上一層含20%胎牛血清的PBS,室溫保濕放置1小時(shí)后4℃放置過夜,以充分封閉玻片上的非特異蛋白交聯(lián)或結(jié)合位點(diǎn)。棄去液體,空氣干燥,將玻片放置于鋁箔塑料袋中充氮干燥密封,置于4℃下保存。以上過程制備成功預(yù)點(diǎn)抗體標(biāo)準(zhǔn)品的蛋白芯片。
3.樣品稀釋液配制含10%胎牛血清的PBS(0.01mol/L,pH7.4),加入終濃度為0.02%的Tween20,無菌過濾分裝,每瓶2ml。
4.洗滌液濃縮液配制10倍濃縮的PBS(0.01mol/L,pH7.4),無菌過濾分裝,每瓶20ml,使用前采用去離子水稀釋至200ml。
5.熒光標(biāo)記抗人抗體二抗的濃縮液使用市售的抗人IgG-Cy5熒光標(biāo)記二抗和抗人IgM-Cy3熒光標(biāo)記二抗在分別滴定適宜的稀釋度后,分裝于棕色小瓶。
6.熒光標(biāo)記鏈霉親和素的濃縮液使用市售的鏈霉親和素-Cy5熒光記二抗和鏈霉親和素-Cy3熒光標(biāo)記二抗在分別滴定適宜的稀釋度后,分裝于棕色小瓶。
7.試劑盒說明書說明書應(yīng)包含以下內(nèi)容,試劑盒的組成、存放條件、使用操作步驟、結(jié)果分析判斷方法、注意事項(xiàng)等。
(三)試劑盒的操作方法與結(jié)果判斷操作方法1.將密封的預(yù)點(diǎn)芯片從4℃下取出,室溫預(yù)溫15分鐘以上。
2.將180ml去離子水加入20ml洗滌液濃縮液,配制好洗滌液。
3.打開預(yù)點(diǎn)抗原和抗體標(biāo)準(zhǔn)品芯片密封袋,取出芯片平放。采用樣品稀釋液按標(biāo)簽上標(biāo)定的稀釋度稀釋熒光標(biāo)記鏈霉親和素的濃縮液,將稀釋好的工作液各取20μl,加入各個(gè)微陣列樣品池,均勻覆蓋樣品池的所有表面,但不要溢出樣品池。
4.37℃下保濕孵育1小時(shí)。
5.快速甩去芯片上的液體,以20ml以上的洗滌液均勻流過玻片表面洗滌玻片,共洗滌玻片3次。
6.采用樣品稀釋液按照預(yù)定的比例稀釋血清樣品,推薦采用1∶10稀釋。
7.將稀釋好的樣品各取20μl,加入預(yù)點(diǎn)抗原芯片的微陣列樣品池,均勻覆蓋樣品池的所有表面,但不要溢出樣品池。在預(yù)點(diǎn)抗體標(biāo)準(zhǔn)品的芯片微陣列樣品池內(nèi)加入稀釋液。
8.37℃下保濕孵育1小時(shí)。
9.快速甩去芯片上的液體,以20ml以上的洗滌液均勻流過玻片表面洗滌玻片,共洗滌玻片3次。
10.采用樣品稀釋液按標(biāo)簽上標(biāo)定的稀釋度稀釋熒光二抗工作液,將稀釋好的熒光二抗工作液各取20μl,加入各個(gè)微陣列樣品池,均勻覆蓋樣品池的所有表面,但不要溢出樣品池。
11.37℃下保濕孵育1小時(shí)。
12.快速甩去芯片上的液體,以20ml以上的洗滌液均勻流過玻片表面洗滌玻片,共洗滌玻片3次。
13.以20ml以上的去離子水均勻流過玻片表面洗滌玻片,共洗滌玻片1次。
14.空氣干燥,于適宜的儀器上讀取各點(diǎn)在635nm、530nm的熒光強(qiáng)度。
結(jié)果判斷
1.對(duì)于單個(gè)微陣列的單個(gè)點(diǎn)樣點(diǎn)來說,按以下方法判斷其是否陽性分別計(jì)算該點(diǎn)的635nm熒光強(qiáng)度與該點(diǎn)的532nm熒光強(qiáng)度的比值和人IgG點(diǎn)635nm熒光強(qiáng)度與該點(diǎn)的532nm熒光強(qiáng)度的比值,取二者的比值,然后根據(jù)人IgG標(biāo)準(zhǔn)品預(yù)點(diǎn)片的抗體標(biāo)準(zhǔn)曲線的公式計(jì)算該抗原相應(yīng)的抗體含量。采用該數(shù)值與預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)比,判斷該點(diǎn)抗原IgG抗體是否陽性,陽性則計(jì)數(shù)為1,陰性計(jì)數(shù)為0;分別計(jì)算該點(diǎn)的532nm熒光強(qiáng)度與該點(diǎn)的635nm熒光強(qiáng)度的比值和人IgM點(diǎn)532nm熒光強(qiáng)度與該點(diǎn)的635nm熒光強(qiáng)度的比值,取二者的比值,然后根據(jù)人IgM標(biāo)準(zhǔn)品預(yù)點(diǎn)片的抗體標(biāo)準(zhǔn)曲線的公式計(jì)算該抗原相應(yīng)的抗體含量。采用該數(shù)值與預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)比,判斷該點(diǎn)抗原IgM抗體是否陽性,陽性則計(jì)數(shù)為1,陰性計(jì)數(shù)為0。
2.對(duì)于某個(gè)微陣列對(duì)應(yīng)的被檢人來說,其陽性抗原數(shù)按以下方法計(jì)算按1.所述方法判斷單點(diǎn)陽性數(shù)后,陣列中12種抗原單點(diǎn)陽性數(shù)的總和即為被檢人的陽性抗原數(shù)。
3.將被檢人陽性抗原數(shù)與預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比,當(dāng)被檢人陽性抗原數(shù)大于或等于預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)值時(shí),即被判斷為肺癌陽性。
實(shí)施例4采用新的診斷肺癌的蛋白質(zhì)芯片及衍生試劑盒診斷、普查、篩檢肺癌疑似患者、肺癌高危人群以及健康人群采用實(shí)施例3所述的試劑盒(采用蛋白芯片加免疫熒光法)檢測(cè)肺癌疑似患者800例(400例肺癌加400例肺部良性病變)、肺癌高危人群3200例、健康人群(普通社區(qū)人群)2000例。采用實(shí)施例4所述的肺癌診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判斷。
結(jié)果被檢的800例肺癌疑似患者中被判為肺癌的448例,其中368例被臨床確診為肺癌,80例被臨床確診為肺部良性病變;被該方法判斷為非肺癌的352例,其中32例被臨床確診為肺癌,320例被臨床確診為肺部良性病變。說明該方法不僅可以診斷肺癌,而且對(duì)于肺部良性病變具有較高的鑒別診斷率。
被檢測(cè)的肺癌高危人群3200例中304例被判斷為肺癌,采用目前常規(guī)的篩檢肺癌的手段——X光胸片及痰細(xì)胞學(xué)檢測(cè)已經(jīng)診斷這304例被檢人中42例屬于肺癌,而X光胸片及痰細(xì)胞學(xué)篩檢在這3200例中總共檢測(cè)出51例肺癌,目前這51例肺癌正在進(jìn)行臨床確診。這說明該方法可以以較高的靈敏度將肺癌患者從被檢人群中篩檢出來,從而可以用于初步篩檢肺癌高危人群,在將這些高度疑似肺癌的人群進(jìn)行臨床確診和隨訪。
被檢測(cè)的健康人群(普通社區(qū)人群)2000例中156例被判斷為肺癌,其中臨床確診1例肺癌,而同時(shí)進(jìn)行的體檢也僅發(fā)現(xiàn)此1例肺癌。說明采用該方法可以將肺癌患者從健康人群中篩檢出來。
序列表<110>中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所<213>人工序列<211>序列的長(zhǎng)度309個(gè)aa/309個(gè)氨基酸殘基<400>氨基酸<210>序列號(hào)1gene″MAGEA1″GENE IDAY148486product=″MAGE-1 protein″protein_id=″AAN62752.1″MSLEQRSLHCKPEEALEAQQEALGLVCVQAAASSSSPLVLGTLEEVPTAGSTDPPQSPQGASAFPTTINFTRQRQPSEGSSSREEEGPSTSCILESLFRAVITKKVADLVGFLLLKYRAREPVTKAEMLESVIKNYKHCFPEIFGKASESLQLVFGIDVKEADPTGHSYVLVTCLGLSYDGLLGDNQIMPKTGFLIIVLVMIAMEGGHAPEEEIWEELSVMEVYDGREHSAYGEPRKLLTQDLVQEKYLEYRQVPDSDPARYEFLWGPRALAETSYVKVLEYVIKVSARVRFFFPSLREAALREEEEGV<110>中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所<213>人工序列<211>序列的長(zhǎng)度507個(gè)aa/507個(gè)氨基酸殘基<400>氨基酸<210>序列號(hào)2gene=″MATK″GENE IDNM 139355product=″megakaryocyte-associated tyrosine kinase isoform a″protein_id=″NP_647612.1″MAGRGSLVSWRAFHGCDSAEELPRVSPRFLRAWHPPPVSARMPTRRWAPGTQCITKCEHTRPKPGELAFRKGDVVTILEACENKSWYRVKHHTSGQEGLLAAGALREREALSADPKLSLMPWFHGKISGQEAVQQLQPPEDGLFLVRESARHPGDYVLCVSFGRDVIHYRVLHRDGHLTIDEAVFFCNLMDMVEHYSKDKGAICTKLVRPKRKHGTKSAEEELARAGWLLNLQHLTLGAQIGEGEFGAVLQGEYLGQKVAVKNIKCDVTAQAFLDETAVMTKMQHENLVRLLGVILHQGLYIVMEHVSKGNLVNFLRTRGRALVNTAQLLQFSLHVAEGMEYLESKKLVHRDLAARNILVSEDLVAKVSDFGLAKAERKGLDSSRLPVKWTAPEALKHGKFTSKSDVWSFGVLLWEVFSYGRAPYPKMSLKEVSEAVEKGYRMEPPEGCPGPVHVLMSSCWEAEPARRPPFRKLAEKLARELRSAGAPASVSGQDADGSTSPRSQEP<110>中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所<213>人工序列<211>序列的長(zhǎng)度314個(gè)aa/314個(gè)氨基酸殘基<400>氨基酸
<210>序列號(hào)3gene=″MAGEA3″GENE IDAY148486product=″melanoma antigen family A,3″protein_id=″NP_005353.1″MPLEQRSQHCKPEEGLEARGEALGLVGAQAPATEEQEAASSSSTLVEVTLGEVPAAESPDPPQSPQGASSLPTTMNYPLWSQSYEDSSNQEEEGPSTFPDLESEFQAALSRKVAELVHFLLLKYRAREPVTKAEMLGSVVGNWQYFFPVIFSKASSSLQLVFGIELMEVDPIGHLYIFATCLGLSYDGLLGDNQIMPKAGLLIIVLAIIAREGDCAPEEKIWEELSVLEVFEGREDSILGDPKKLLTQHFVQENYLEYRQVPGSDPACYEFLWGPRALVETSYVKVLHHMVKISGGPHISYPPLHEWVLREGEE<110>中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所<213>人工序列<211>序列的長(zhǎng)度497個(gè)aa/497個(gè)氨基酸殘基<400>氨基酸<210>序列號(hào)4gene=″CCT8″GENE IDBC012584product=″CCT8 protein″protein_id=″AAH12584.1″MNKMVINHLEKLFVTNDAATILRELEVQHPAAKMIVMASHMQEQEVGDGTNFVLVFAGALLELAEELLRIGLSVSEVIEGYEIACRKAHEILPNLVCCSAKNLRDIDEVSSLLRTSIMSKQYGNEVFLAKLIAQACVSIFPDSGHFNVDNIRVCKILGSGISSSSVLHGMVFKKETEGDVTSVKDAKIAVYSCPFDGMITETKGTVLIKTAEELMNFSKGEENLMDAQVKAIADTGANVVVTGGKVADMALHYANKYNIMLVRLNSKWDLRRLCKTVGATALPRLTPPVLEEMGHCDSVYLSEVGDTQVVVFKHEKEDGAISTIVLRGSTDNLMDDIERAVDDGVNTFKVLTRDKRLVPGGGATEIELAKQITSYGETCPGLEQYAIKKFAEAFEAIPRALAENSGVKANEVISKLYAVHQEGNKNVGLDIEAEVPAVKDMLEAGILDTYLGKYWAIKLATNAAVTVLRVDQIIMAKPAGGPKPPSGKKDWDDDQND<110>中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所<213>人工序列<211>序列的長(zhǎng)度393個(gè)aa/393個(gè)氨基酸殘基<400>氨基酸<210>序列號(hào)5gene=“TP53”GENE IDNM 000546product=“tumor protein p53”protein_id=“NP_000537.2”
MEEPQSDPSVEPPLSQETFSDLWKLLPENNVLSPLPSQAMDDLMLSPDDIEQWFTEDPGPDEAPRMPEAAPRVAPAPAAPTPAAPAPAPSWPLSSSVPSQKTYQGSYGFRLGFLHSGTAKSVTCTYSPALNKMFCQLAKTCPVQLWVDSTPPPGTRVRAMATYKQSQHMTEVVRRCPHHERCSDSDGLAPPQHLIRVEGNLRVEYLDDRNTFRHSVVVPYEPPEVGSDCTTIHYNYMCNSSCMGGMNRRPILTIITLEDSSGNLLGRNSFEVRVCACPGRDRRTEEENLRKKGEPHHELPPGSTKRALPNNTSSSPQPKKKPLDGEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQAGKEPGGSRAHSSHLKSKKGQSTSRHKKLMFKTEGPDSD<110>中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所<213>人工序列<211>序列的長(zhǎng)度723個(gè)aa/723個(gè)氨基酸殘基<400>氨基酸<210>序列號(hào)6gene=″ZNF258″GENE IDNM 007167product=″zinc finger protein 258″protein_id=″NP_009098.1″MKEPLDGECGKAVVPQQELLDKIKEEPDNAQEYGCVQQPKTQESKLKIGGVSSVNERPIAQQLNPGFQLSFASSGPSVLLPSVPAVAIKVFCSGCKKMLYKGQTAYHKTGSTQLFCSTRCITRHSSPACLPPPPKKTCTNCSKDILNPKDVITTRFENSYPSKDFCSQSCLSSYELKKKPVVTIYTKSISTKCSMCQKNADTRFEVKYQNVVHGLCSDACFSKFHSTNNLTMNCCENCGSYCYSSSGPCQSQKVFSSTSVTAYKQNSAQIPPYALGKSLRPSAEMIETTNDSGKTELFCSINCLSAYRVKTVTSSGVQVSCHSCKTSAIPQYHLAMSNGTIYSFCSSSCVVAFQNVFSKPKGTNSSAVPLSQGQVVVSPPSSRSAVSIGGGNTSAVSPSSIRGSAAASLQPLGEQSQQVALTHTVVKLKCQHCNHLFATKPELLFYKGKMFLFCGKNCSDEYKKKNKVVAMCDYCKLQKIIKETVRFSGVDKPFCSEVCKFLSARDFGERWGNYCKMCSYCSQTSPNLVENRLEGKLEEFCCEDCMSKFTVLFYQMAKCDGCKRQGKLSESIKWRGNIKHFCNLFCVLEFCHQQIMNDCLPQNKVNISKAKTAVTELPSARTDTTPVITSVMSLAKIPATLSTGNTNSVLKGAVTKEAAKIIQDESTQEDAMKFPSSQSSQPSRLLKNKGISCKPVTQTKATSCKPHTQHKECQTECPVRAVC<110>中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所<213>人工序列<211>序列的長(zhǎng)度620個(gè)aa/620個(gè)氨基酸殘基<400>氨基酸<210>序列號(hào)7gene=″PRC1″GENE IDNM 003981product=″protein regulator of cytokinesis 1 isoform 1″protein_id=″NP_003972.1″MRRSEVLAEESIVCLQKALNHLREIWELIGIPEDQRLQRTEVVKKHIKELLDMMIAEEESLKERLIKSISVCQKELNTLCSELHVEPFQEEGETTILQLEKDLRTQVELMRKQKKERKQELKLLQEQDQELCEILCMPHY
DIDSASVPSLEELNQFRQHVTTLRETKASRREEFVSIKRQIILCMEELDHTPDTSFERDVVCEDEDAFCLSLENIATLQKLLRQLEMQKSQNEAVCEGLRTQIRELWDRLQIPEEEREAVATIMSGSKAKVRKALQLEVDRLEELKMQNMKKVIEAIRVELVQYWDQCFYSQEQRQAFAPFCAEDYTESLLQLHDAEIVRLKNYYEVHKELFEGVQKWEETWRLFLEFERKASDPNRFTNRGGNLLKEEKQRAKLQKMLPKLEEELKARIELWEQEHSKAFMVNGQKFMEYVAEQWEMHRLEKERAKQERQLKNKKQTETEMLYGSAPRTPSKRRGLAPNTPGKARKLNTTTMSNATANSSIRPIFGGTVYHSPVSRLPPSGSKPVAASTCSGKKTPRTGRHGANKENLELNGSILSGGYPGSAPLQRNFSINSVASTYSEFAKDPSLSDSSTVGLQRELSKASKSDATSGILNSTNIQS<110>中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所<213>人工序列<211>序列的長(zhǎng)度328個(gè)aa/328個(gè)氨基酸殘基<400>氨基酸<210>序列號(hào)8gene=″C14orf104″GENE IDNM 018139product=″hypothetical protein LOC55172″protein_id=″NP_060609.1″MGGPGTKSGEPLCPPLLCNQDKETLTLLIQVPRIQPQSLQGDLNPLWYKLRFSAQDLVYSFFLQFAPENKLSTTEPVISISSNNAVIELAKSPESHGHWREWYYGVNNDSLEERLFVNEENVNEFLEEVLSSPFKQSMSLTPPLIEVLQVTDNKIQINAKLQECSNSDQLQGKEERVNEESHLTEKEYIEHCNTPTTDSDSSIAVKALQIDSFGLVTCFQQESLDVSQMILGKSQQPESKMQSEFIKEKSATCSNEEKDNLNESVITEEKETDGDHLSSLLNKTTVHNIPGFDSIKETNMQDGSVQVIKDHVTNCAFSFQNSLLYDLD<110>中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所<213>人工序列<211>序列的長(zhǎng)度462個(gè)aa/462個(gè)氨基酸殘基<400>氨基酸<210>序列號(hào)9gene=″EEF1A1″GENE IDNM 001402product=″e(cuò)ukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1″protein_id=″NP_001393.1″MGKEKTHINIVVIGHVDSGKSTTTGHLIYKCGGIDKRTIEKFEKEAAEMGKGSFKYAWVLDKLKAERERGITIDISLWKFETSKYYVTIIDAPGHRDFIKNMITGTSQADCAVLIVAAGVGEFEAGISKNGQTREHALLAYTLGVKQLIVGVNKMDSTEPPYSQKRYEEIVKEVSTYIKKIGYNPDTVAFVPISGWNGDNMLEPSANMPWFKGWKVTRKDGNASGTTLLEALDCILPPTRPTDKPLRLPLQDVYKIGGIGTVPVGRVETGVLKPGMVVTFAPVNVTTEVKSVEMHHEALSEALPGDNVGFNVKNVSVKDVRRGNVAGDSKNDPPMEAAGFTAQVIILNHPGQISAGYAPVLDCHTAHIACKFAELKEKIDRRSGKKLEDGPKFLKSGDAAIVDMVPGKPMCVESFSDYPPLGRFAVRDMRQTVAVGVIKAVDKKAAGAGKVTKSAQKAQKAK
<110>中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所<213>人工序列<211>序列的長(zhǎng)度532個(gè)aa/532個(gè)氨基酸殘基<400>氨基酸<210>序列號(hào)10gene=″ZIC2″GENE IDNM 007129product=″zinc finger protein of the cerebel lum 2″protein_id=″NP_009060.2″MLLDAGPQFPAIGVGSFARHHHHSAAAAAAAAAEMQDRELSLAAAQNGFVDSAAAHMGAFKLNPGAHELSPGQSSAFTSQGPGAYPGSAAAAAAAAALGPHAAHVGSYSGPPFNSTRDFLFRSRGFGDSAPGGGQHGLFGPGAGGLHHAHSDAQGHLLFPGLPEQHGPHGSQNVLNGQMRLGLPGEVFGRSEQYRQVASPRTDPYSAAQLHNQYGPMNMNMGMNMAAAAAHHHHHHHHHPGAFFRYMRQQCIKQELICKWIDPEQLSNPKKSCNKTFSTMHELVTHVSVEHVGGPEQSNHVCFWEECPREGKPFKAKYKLVNHIRVHTGEKPFPCPFPGCGKVFARSENLKIHKRTHTGEKPFQCEFEGCDRRFANSSDRKKHMHVHTSDKPYLCKMCDKSYTHPSSLRKHMKVHESSPQGSESSPAASSGYESSTPPGLVSPSAEPQSSSNLSPAAAAAAAAAAAAAAAVSAVHRGGGSGSGGAGGGSGGGSGSGGGGGGAGGGGGGSSGGGSGTAGGHSGLSSNFNEWYV<110>中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所<213>人工序列<211>序列的長(zhǎng)度317個(gè)aa/317個(gè)氨基酸殘基<400>氨基酸<210>序列號(hào)11gene=″SOX2″GENE IDNM 003106product=″sex-determining region Y-box 2″protein_id=″NP_003097.1″MYNMMETELKPPGPQQTSGGGGGNSTAAAAGGNQKNSPDRVKRPMNAFMVWSRGQRRKMAQENPKMHNSEISKRLGAEWKLLSETEKRPFIDEAKRLRALHMKEHPDYKYRPRRKTKTLMKKDKYTLPGGLLAPGGNSMASGVGVGAGLGAGVNQRMDSYAHMNGWSNGSYSMMQDQLGYPQHPGLNAHGAAQMQPMHRYDVSALQYNSMTSSQTYMNGSPTYSMSYSQQGTPGMALGSMGSVVKSEASSSPPVVTSSSHSRAPCQAGDLRDMISMYLPGAEVPEPAAPSRLHMSQHYQSGPVPGTAINGTLPLSHM<110>中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所<213>人工序列<211>序列的長(zhǎng)度97個(gè)aa/97個(gè)氨基酸殘基<400>氨基酸<210>序列號(hào)12
gene=″S100A10″GENE IDNM_002966product=″S100calcium-binding protein A10″protein_id=″NP_002957.1″MPSQMEHAMETMMFTFHKFAGDKGYLTKEDLRVLMEKEFPGFLENQKDPLAVDKIMKDLDQCRDGKVGFQSFFSLIAGLTIACNDYFVVHMKQKGKK
權(quán)利要求
1.一種診斷人肺癌的蛋白質(zhì)芯片,其特征在于由以下氨基酸序列組成(1)具有序列號(hào)1所示氨基酸序列的MAGEA1抗原片段,;(2)具有序列號(hào)2所示氨基酸序列的MATK抗原片段,;(3)具有序列號(hào)3所示氨基酸序列的MAGEA3抗原片段;(4)具有序列號(hào)4所示氨基酸序列的CCT8抗原片段;(5)具有序列號(hào)5所示氨基酸序列的TP53抗原片段;(6)具有序列號(hào)6所示氨基酸序列的ZNF258抗原片段;(7)具有序列號(hào)7所示氨基酸序列的PRC1抗原片段;(8)具有序列號(hào)8所示氨基酸序列的C14orf104抗原片段;(9)具有序列號(hào)9所示氨基酸序列的EEF1A1抗原片段;(10)具有序列號(hào)10所示氨基酸序列的ZIC2抗原片段;(11)具有序列號(hào)11所示氨基酸序列的SOX2抗原片段;和(12)具有序列號(hào)12所示氨基酸序列的S100A10抗原片段。
2.如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)芯片,其中所述的蛋白質(zhì)為重組表達(dá)的蛋白質(zhì)。
3.一種蛋白質(zhì)芯片診斷試劑盒,其包括如權(quán)利要求1或2所述的蛋白質(zhì)芯片。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的診斷人肺癌的蛋白質(zhì)芯片,以及由此蛋白質(zhì)芯片衍生的診斷試劑盒。該蛋白質(zhì)芯片包含了12種特定人蛋白質(zhì)的蛋白斑點(diǎn),使用該蛋白質(zhì)芯片可以檢測(cè)被檢人血液樣品中這12種蛋白質(zhì)各自相應(yīng)抗體的含量,聯(lián)合分析這12個(gè)蛋白質(zhì)的相應(yīng)抗體的檢測(cè)結(jié)果,可以判斷被檢人是否為肺癌患者。本發(fā)明進(jìn)一步提供了該蛋白質(zhì)芯片在健康人群或高危人群中篩查肺癌的應(yīng)用。
文檔編號(hào)G01N33/531GK1873417SQ20051007335
公開日2006年12月6日 申請(qǐng)日期2005年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月2日
發(fā)明者楊治華, 冉宇靚, 李國(guó)惠, 李江偉 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所
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