專利名稱：用于免疫學分析的蛋白質芯片的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生命科學領域，特別涉及一種免疫學檢測、分析和診斷的蛋白質芯片。
背景技術：
蛋白質芯片是一種在固體基片表面固定蛋白質或多肽微陣列，通過免疫學原理對蛋白質樣品進行檢測、識別、分析和診斷，可應用于生命科學、醫(yī)藥學、及生物傳感器的研制等相關領域。
傳統(tǒng)的免疫分析方法目前主要有免疫熒光方法(Fluorescent Immunoassay，F(xiàn)IA)，酶聯(lián)免疫分析法(Enzyme-linked Immunoassay，EIA)和放射免疫分析技術(RadioactiveImmunoassay，RIA)。這些技術具有較高的靈敏度和特異性，在臨床醫(yī)學和生物學的研究中發(fā)揮了重要作用。然而，傳統(tǒng)方法檢測速度慢，效率低，已不能滿足醫(yī)學尤其是生命科學飛速發(fā)展的要求。例如，F(xiàn)IA和EIA法靈敏度較低，而RIA雖然靈敏度較高，但其放射性又會對操作人員身體造成傷害。
生物芯片的出現(xiàn)給免疫分析技術帶來了新的發(fā)展契機?，F(xiàn)代生物芯片是指包括在固相載體表面固定排列高密度的DNA、抗原、抗體或細胞的為陣列，利用生物大分子之間具有的特異識別的能力，與檢測樣品或生物大分子進行反應或雜交，通過自動檢測設備可獲得大量有用的生物信息。
蛋白質芯片是在一種固相載體基片上，將蛋白質或多肽直接點樣于其上，使之與基片表面牢固結合，形成蛋白質微陣列?？乖贵w大都是蛋白質，并且它們之間的結合又是特異性的。因此，固定在基片表面的蛋白質可與帶有特殊標記的蛋白質分子(抗體或抗原)進行特異性免疫反應，兩者結合后，通過對標記的抗原-抗體復合物的檢測來實現(xiàn)抗原抗體的互檢，用于檢測相應的抗體或抗原。該技術的特點是高通量、微型化和自動化。可廣泛應用于臨床診斷、藥物篩選以及蛋白質組學等領域的研究。
蛋白質芯片可分為化學型和生物化學型兩種類型?；瘜W型蛋白質芯片是基于經(jīng)典的色譜介質，其基本原理是在蛋白質芯片表面鋪上特定的介質，通過介質的疏水力、靜電力以及共價鍵等結合樣品中的蛋白質。然后用特定的洗脫液洗去雜質蛋白，而保留特定的蛋白質進行分析。生物化學型蛋白質芯片是把生物活性分子(如抗原、抗體或受體、配體等)固定到芯片表面，用于結合樣品中的互補靶蛋白。由于生物化學型蛋白質芯片具有較高的特異性和生物活性分子的多樣性，因此其應用范圍和前景都遠遠超過了化學型蛋白質芯片。蛋白質芯片的制備必須保證蛋白質的正確定位和其生物活性的保持。但是，傳統(tǒng)的蛋白質芯片對實驗操作要求高，反應體系嚴格，由于人為因素產(chǎn)生的誤差較大，結果不穩(wěn)定，并且其檢測儀器設備價格昂貴，檢測成本高，因此無法大批量生產(chǎn)和使用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于免疫學分析的蛋白質芯片，本發(fā)明是靈敏度和特異性都較高的生物化學型蛋白質芯片，制作方法簡便、適合于批量生產(chǎn)，并且可以對多種蛋白質樣品進行檢測分析。
本發(fā)明用于免疫學分析的蛋白質芯片的具體技術方案是1)在潔凈的玻璃基片上鍍一層金屬膜(如金屬鉻膜或鋁膜)后用高速旋轉的甩膠機在上面涂一層光敏膠；2)將具有的光刻掩模蓋在基片上，在紫外光刻機下光刻，顯影定影后得到金屬基底圖案；3)再將露出的金屬膜腐蝕掉，露出玻璃基底圖案，去膠后，修飾露出的玻璃基底圖案，使其具有活性功能基團——氨基；4)去掉剩余的金屬膜并清洗晾干后，將抗原蛋白溶液覆蓋于基片表面，蛋白質與氨基作用后通過化學鍵連接于載玻片上而被固定；所述的蛋白質樣品成微陣列；5)利用熒光標記物對蛋白質樣品分子進行標記，最后利用芯片熒光顯微鏡對蛋白質樣品進行檢測分析。
所述的蛋白質樣品微陣列為方塊狀點陣或長條狀陣列。
所述的方塊狀微陣列每個方塊狀微陣列中點的數(shù)目為40×40-400×400個。所述的方塊狀微陣列中蛋白質樣品點的直徑為50μm，點之間的間隙距離為50μm。
所述的長條狀微陣列中為10-100組，每組4個條。所述的長條狀微陣列中條的寬度依次為30μm、50μm、80μm和120μm，條之間的間隙距離為50μm。條的長度為0.2-2.0cm。
用于免疫學分析的蛋白質芯片的制作工藝采取如下步驟1)在潔凈的載玻片表面鍍一層厚約150-250nm的金屬鉻膜或鋁膜，然后在上面用高速旋轉的甩膠機涂一層500-700nm厚的紫外正型光刻膠；2)在60-80℃下烘干堅膜30-60min，使光膠與金屬膜緊密結合；3)通過微電子學中制作電路版的技術制作的具有微陣列圖案的光刻掩模；或者事先設計并打印出微陣列圖案，通過翻拍技術制得照相底片，以其作為光刻掩模；4)將光刻掩模蓋在涂膠的玻片上面，在紫外光刻機下光刻；5)用0.5-1％的NaOH溶液顯影，去掉曝光圖案部分的光刻膠，露出金屬基底圖案；6)用硝酸鈰銨溶液腐蝕掉露出的鉻層或對鋁膜用1.6mol/L的磷酸溶液腐蝕，得到玻璃圖案；用1-10％的NaOH溶液去掉剩余的光刻膠。
采取如下方法修飾玻璃表面1)將玻璃片用體積比1∶1∶5的25％NH3，30％H2O2和H2O溶液清洗；然后用體積比1∶1∶5為37％HCl，30％H2O2和H2O溶液處理5-10分鐘；對鍍鋁的玻璃片則改用30％的H2O2處理；再將其分別用水，酒精和丙酮清洗，使其在空氣下干燥后再置于100-120℃的烘箱內(nèi)干燥0.5-1小時；2)將玻璃片用1-5％的3-胺基-丙基-三乙氧基硅烷(APTES)的甲苯溶液修飾3-10分鐘，再用甲苯及丙酮清洗之，然后在100-120℃下干燥0.5-1小時，使玻璃片表面帶上氨基；3)用硝酸鈰銨腐蝕液腐蝕掉剩余的鉻層；或用磷酸溶液腐蝕鋁膜；并用雙蒸水進行充分的清洗后晾干。
所述的硝酸鈰銨腐蝕液配方硝酸鈰銨100克，醋酸17.5mL，加雙蒸水稀釋至500mL；所述的磷酸溶液為1.6mol/L的磷酸溶液。
用于免疫學分析的蛋白質芯片的使用方法是經(jīng)過下述步驟1)將配好的抗原(雞IgG)加到經(jīng)過修飾的玻璃基片表面，使蛋白質與表面的氨基作用約10-30min，通過化學鍵連接于載玻片上而被固定；然后用pH值在7.2-7.4之間磷酸鹽緩沖液0.2mol/L的Na2HPO481.0mL，0.2mol/L的NaH2PO419.0mL混合和雙蒸水分別沖洗基片表面，洗掉多余的抗原后晾干；2)將用熒光標記的待測樣品(如FITC標記的雞Anti-IgG)溶液加到固定有抗原(雞IgG)的玻璃片表面上，在常溫下保持5-10min，使抗原和抗體充分反應；3)用pH值在7.2-7.4之間的磷酸鹽緩沖液和雙蒸水依次沖洗玻璃片，洗去殘余的樣品，并在常溫下晾干；4)在熒光顯微鏡下對芯片進行檢測分析，或利用CCD系統(tǒng)拍照后對其熒光強度進行分析。
本發(fā)明用于免疫學分析的蛋白質芯片，首次將半導體制作工藝及微電子技術引入免疫分析的研究中來，使蛋白質芯片微陣列實現(xiàn)集成化。本發(fā)明是靈敏度和特異性都較高的生物化學型蛋白質芯片，制作方法簡便，并且檢測方法更加快捷靈敏，檢測效率更高。適合于批量生產(chǎn)，并且可以對多種蛋白質樣品進行檢測分析。


圖1是通過翻拍技術制得的光刻掩模照片。
圖2是免疫反應后所拍的蛋白質微圖案熒光顯微照片。
圖3是蛋白質芯片的方塊狀微陣列圖形的光學顯微照片。
圖4是蛋白質芯片的方塊狀微陣列圖形的掃描電鏡照片。
圖5是蛋白質芯片進行免疫反應后所拍的方塊狀蛋白質微陣列熒光顯微照片。
圖6是蛋白質芯片的長條狀微陣列圖形的光學顯微照片。
圖7是蛋白質芯片的長條狀微陣列圖形的掃描電鏡照片。
圖8是蛋白質芯片進行免疫反應后所拍的長條狀蛋白質微陣列熒光顯微照片。
具體實施例方式
實例1蛋白質微陣列芯片(鍍鉻膜)的制作方法1)使用鍍膜機(鍍膜機，DM-450C型，北京儀器廠)，真空下加熱鉻絲在潔凈的載玻片表面蒸鍍一層厚約154nm的金屬鉻膜，然后在上面用高速旋轉的甩膠機涂一層600nm厚的正型光刻(膠勻膠凈化工作臺，型號SW-CJ-9B，蘇州凈化設備廠；紫外正型光刻膠，型號BP212，北京化學試劑研究所)；2)在80℃下烘干堅膜30min，使光膠與金屬膜緊密結合；3)設計并打印出微陣列圖案，如圖1所示；圖1是通過翻拍技術制得的光刻掩模照片，圖1中圓形及五角星的直徑分別為150-250不等。間距為150μm，微陣列中點的數(shù)目為48×60個，并通過翻拍技術制得照相底片，以其作為光刻掩模。
4)將光刻掩模蓋在涂膠的玻片上面，在紫外光刻機下光刻(半自動光刻機，JKG-1型，上海光學機械廠)；5)用0.5％的NaOH溶液顯影，去掉曝光圖案部分的光刻膠，露出鉻的圖案；6)用硝酸鈰銨溶液腐蝕掉露出的鉻層，得到玻璃基底圖案，然后用5％的NaOH溶液去掉剩余的光刻膠；7)將玻璃片用25％NH3，30％H2O2，和H2O溶液(體積比1∶1∶5)清洗片刻；然后用37％HCl，30％H2O2和H2O溶液(體積比1∶1∶5)處理5-10分鐘；再將其分別用水，酒精和丙酮清洗，使其在空氣下干燥后再置于100℃的烘箱內(nèi)干燥0.5小時；8)將玻璃片用1-5％的APTES(3-胺基-丙基-三乙氧基硅烷)(3-aminopropyltriethoxysilane)的甲苯溶液修飾3-10分鐘，再用甲苯及丙酮清洗之，然后在100℃下干燥1小時，使玻璃片表面帶上氨基；9)用硝酸鈰銨溶液(配方硝酸鈰銨100克，醋酸17.5mL，.加雙蒸水稀釋至500mL)腐蝕掉剩余的鉻層，并用雙蒸水進行充分的清洗后晾干。
10)將配好的抗原(雞IgG)加到經(jīng)過修飾的玻璃基片表面，使蛋白質與表面的氨基作用約10-30min，通過化學鍵連接于載玻片上而被固定；然后用pH值在7.2-7.4之間磷酸鹽緩沖液(PBS，0.2mol/L的Na2HPO481.0mL，0.2mol/L的NaH2PO419.0mL混合)和雙蒸水分別沖洗基片表面，洗掉多余的抗原后晾干；11)將用熒光標記的待測樣品FITC標記的雞Anti-IgG溶液加到固定有雞IgG的玻璃片表面上，在常溫下保持5-10min，使抗原和抗體充分反應；12)用pH值在7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)和雙蒸水依次沖洗玻璃片，洗去殘余的樣品，并在常溫下晾干；
13)在熒光顯微鏡下對芯片進行檢測分析，或利用CCD系統(tǒng)拍照后對其熒光強度進行分析，如圖2所示，圖2是免疫反應后所拍的蛋白質微圖案熒光顯微照片。通過抗原與熒光標記的抗體之間的免疫反應，可以得到清晰的綠色熒光圖案，圖中圓形及五角星的直徑分別為150-250不等。間距為150μm，微陣列中點的數(shù)目為48×60個。這說明只有經(jīng)過化學修飾而具有功能基團(氨基)的區(qū)域才可結合抗原，而未經(jīng)修飾的區(qū)域基本上不結合蛋白，進而通過免疫反應特異性地結合熒光蛋白，形成綠色微圖案?？梢钥闯鏊脠D案十分清晰，這說明本生物化學型蛋白質芯片具有較高的靈敏度和特異性。并且制作方法簡便，檢測方法更加快捷靈敏，檢測效率更高。
實例2方塊狀蛋白質微陣列芯片(鍍鋁膜)的制作方法1)使用鍍膜機，真空下加熱鋁絲在潔凈的載玻片表面蒸鍍一層厚約200nm的金屬鋁膜，然后在上面用高速旋轉的甩膠機涂一層600nm厚的正型光刻膠(膠勻膠凈化工作臺，型號SW-CJ-9B，蘇州凈化設備廠；紫外正型光刻膠，型號BP212，北京化學試劑研究所)；2)在80℃下烘干堅膜30min，使光刻膠與金屬膜緊密結合；3)通過微電子學中制作電路的制版技術制作方塊微陣列光刻掩模；4)將光刻掩模蓋在涂膠的玻片上面，在紫外光刻機下光刻(半自動光刻機，JKG-1型，上海光學機械廠)；5)用0.5％的NaOH溶液顯影，去掉曝光圖案部分的光刻膠，露出鉻的圖案；6)用磷酸溶液(1.6mol/L)腐蝕掉露出的鋁層，得到玻璃基底圖案，如圖3所示，圖3是蛋白質芯片的方塊狀微陣列圖形的光學顯微照片。然后用5％的NaOH溶液去掉剩余的光刻膠，并在掃描電鏡下觀測圖案形貌，如圖4所示，圖4是蛋白質芯片的方塊狀微陣列圖形的掃描電鏡照片。
7)將玻璃片用25％NH3，30％H2O2，和H2O溶液(體積比1∶1∶5)清洗片刻；然后用30％H2O2處理10分鐘；再將其分別用水，酒精和丙酮清洗，使其在空氣下干燥后再置于100℃的烘箱內(nèi)干燥0.5小時；8)將玻璃片用5％的APTES(3-胺基-丙基-三乙氧基硅烷)(3-aminopropyltriethoxysilane)的甲苯溶液修飾5分鐘，再用甲苯及丙酮清洗之，然后在100℃下干燥1小時，使玻璃片表面帶上氨基；9)用磷酸溶液(1.6mol/L)腐蝕掉剩余的鋁層，并用雙蒸水進行充分的清洗后晾干。
10)將配好的抗原(雞IgG)加到經(jīng)過修飾的玻璃基片表面，使蛋白質與表面的氨基作用約10min，通過化學鍵連接于載玻片上而被固定；然后用pH值在7.2-7.4之間磷酸鹽緩沖液(PBS，0.2mol/L的Na2HPO481.0mL，0.2mol/L的NaH2PO419.0mL混合)和雙蒸水分別沖洗基片表面，洗掉多余的抗原后晾干；
11)將用熒光標記的待測樣品FITC標記的雞Anti-IgG溶液加到固定有雞IgG的玻璃片表面上，在常溫下保持5min，使抗原和抗體充分反應；12)用pH值在7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)和雙蒸水依次沖洗玻璃片，洗去殘余的樣品，并在常溫下晾干；13)在熒光顯微鏡下對芯片進行檢測分析，或利用CCD系統(tǒng)拍照后對其熒光強度進行分析，如圖5所示，圖5是蛋白質芯片進行免疫反應后所拍的方塊狀蛋白質微陣列熒光顯微照片。通過抗原與熒光標記的抗體之間的免疫反應，可以得到清晰的綠色熒光圖案，方塊狀微陣列每個方塊狀微陣列中點的數(shù)目為200×200個，蛋白質樣品點的直徑為50μm，點之間的間隙距離為50μm。這說明只有經(jīng)過化學修飾而具有功能基團(氨基)的區(qū)域才可結合抗原，而未經(jīng)修飾的區(qū)域基本上不結合蛋白，進而通過免疫反應特異性地結合熒光蛋白，形成方塊狀綠色微圖案。可以看出所得圖案十分清晰，這說明本生物化學型蛋白質芯片具有較高的靈敏度和特異性。并且制作方法簡便，檢測方法更加快捷靈敏，檢測效率更高。
實例3長條狀蛋白質微陣列芯片(鍍鋁膜)的制作方法1)使用鍍膜機(鍍膜機，DM-450C型，北京儀器廠)，真空下加熱鋁絲在潔凈的載玻片表面蒸鍍一層厚約200nm的金屬鋁膜，然后在上面用高速旋轉的甩膠機涂一層600nm厚的正型光刻膠(膠勻膠凈化工作臺，型號SW-CJ-9B，蘇州凈化設備廠；紫外正型光刻膠，型號BP212，北京化學試劑研究所)；2)在80℃下烘干堅膜30min，使光刻膠與金屬膜緊密結合；3)通過微電子學中制作電路的制版技術制作方塊微陣列光刻掩模；4)將光刻掩模蓋在涂膠的玻片上面，在紫外光刻機下光刻(半自動光刻機，JKG-1型，上海光學機械廠)；5)用0.5％的NaOH溶液顯影，去掉曝光圖案部分的光刻膠，露出鉻的圖案；6)用磷酸溶液(1.6mol/L)腐蝕掉露出的鋁層，得到玻璃基底圖案，如圖6所示，圖6是蛋白質芯片的長條狀微陣列圖形的光學顯微照片。然后用5％的NaOH溶液去掉剩余的光刻膠，并在掃描電鏡下觀測圖案形貌，如圖7所示，圖7是蛋白質芯片的長條狀微陣列圖形的掃描電鏡照片。。
7)將玻璃片用25％NH3，30％H2O2，和H2O溶液(體積比1∶1∶5)清洗片刻；然后用30％H2O2處理10分鐘；再將其分別用水，酒精和丙酮清洗，使其在空氣下干燥后再置于100℃的烘箱內(nèi)干燥0.5小時；8)將玻璃片用5％的APTES(3-胺基-丙基-三乙氧基硅烷)(3-aminopropyltriethoxysilane)的甲苯溶液修飾5分鐘，再用甲苯及丙酮清洗之，然后在100℃下干燥1小時，使玻璃片表面帶上氨基；9)用磷酸溶液(1.6mol/L)腐蝕掉剩余的鋁層，并用雙蒸水進行充分的清洗后晾干。
10)將配好的雞IgG溶液加到經(jīng)過修飾的玻璃基片表面，使蛋白質與表面的氨基作用約10min，通過化學鍵連接于載玻片上而被固定；然后用pH值在7.2-7.4之間磷酸鹽緩沖液(PBS，0.2mol/L的Na2HPO481.0mL，0.2mol/L的NaH2PO419.0mL混合)和雙蒸水分別沖洗基片表面，洗掉多余的抗原后晾干；11)將用熒光標記的待測樣品FITC標記的雞Anti-IgG溶液加到固定有抗原雞IgG的玻璃片表面上，在常溫下保持5min，使抗原和抗體充分反應；12)用pH值7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)和雙蒸水依次沖洗玻璃片，洗去殘余的樣品，并在常溫下晾干；13)在熒光顯微鏡下對芯片進行檢測分析，或利用CCD系統(tǒng)拍照后對其熒光強度進行分析，如圖8所示，圖8是蛋白質芯片進行免疫反應后所拍的長條狀蛋白質微陣列熒光顯微照片。通過抗原與熒光標記的抗體之間的免疫反應，可以得到清晰的綠色熒光圖案，長條狀微陣列中共有60組，每組4個條，長條狀微陣列中條的寬度依次為30μm、50μm、80μm和120μm，條的長度為2cm，條之間的間隙距離為50μm。這說明只有經(jīng)過化學修飾而具有功能基團(氨基)的區(qū)域才可結合抗原，而未經(jīng)修飾的區(qū)域基本上不結合蛋白，進而通過免疫反應特異性地結合熒光蛋白，形成長條狀綠色微圖案?？梢钥闯鏊脠D案十分清晰，這說明本生物化學型蛋白質芯片具有較高的靈敏度和特異性。并且制作方法簡便，檢測方法更加快捷靈敏，檢測效率更高。
權利要求
1.一種用于免疫學分析的蛋白質芯片，其特征在于1)在潔凈的玻璃基片上鍍一層金屬膜后用高速旋轉的甩膠機在上面涂一層光敏膠；2)將具有的光刻掩模蓋在基片上，在紫外光刻機下光刻，顯影定影后得到金屬基底圖案；3)再將露出的金屬膜腐蝕掉，露出玻璃基底圖案，去膠后，修飾露出的玻璃基底圖案，使其具有活性功能基團——氨基；4)去掉剩余的金屬膜并清洗晾干后，將抗原蛋白溶液覆蓋于基片表面，蛋白質與氨基作用后通過化學鍵連接于載玻片上而被固定；所述的蛋白質樣品成微陣列；5)利用熒光標記物對蛋白質樣品分子進行標記，最后利用芯片熒光顯微鏡對蛋白質樣品進行檢測分析。
2.根據(jù)權利要求1所述的用于免疫學分析的蛋白質芯片，其特征在于所述的蛋白質樣品微陣列為方塊狀點陣或長條狀陣列。
3.根據(jù)權利要求2所述的用于免疫學分析的蛋白質芯片，其特征在于所述的方塊狀微陣列每個方塊狀微陣列中點的數(shù)目為40×40-400×400個。
4.根據(jù)權利要求3所述的用于免疫學分析的蛋白質芯片，其特征在于所述的方塊狀微陣列中蛋白質樣品點的直徑為50μm，點之間的間隙距離為50μm。
5.根據(jù)權利要求2所述的用于免疫學分析的蛋白質芯片，其特征在于所述的長條狀微陣列中為10-100組，每組4個條。
6.根據(jù)權利要求5所述的用于免疫學分析的蛋白質芯片，其特征在于所述的長條狀微陣列中條的寬度依次為30μm、50μm、80μm和120μm，條之間的間隙距離為50μm。
7.根據(jù)權利要求1所述的用于免疫學分析的蛋白質芯片的制作工藝，其特征在于采取如下步驟1)在潔凈的載玻片表面鍍一層厚約150-250nm的金屬鉻膜或鋁膜，然后在上面用高速旋轉的甩膠機涂一層500-700nm厚的紫外正型光刻膠；2)在60-80℃下烘干堅膜30-60min，使光膠與金屬膜緊密結合；3)通過微電子學中制作電路版的技術制作的具有微陣列圖案的光刻掩模；或者事先設計并打印出微陣列圖案，通過翻拍技術制得照相底片，以其作為光刻掩模；4)將光刻掩模蓋在涂膠的玻片上面，在紫外光刻機下光刻；5)用0.5-1％的NaOH溶液顯影，去掉曝光圖案部分的光刻膠，露出金屬基底圖案；6)用硝酸鈰銨溶液腐蝕掉露出的鉻層或對鋁膜用1.6mol/L的磷酸溶液腐蝕，得到玻璃圖案；用1-10％的NaOH溶液去掉剩余的光刻膠。
8.根據(jù)權利要求1所述的用于免疫學分析的蛋白質芯片的制作工藝，其特征在于采取如下方法修飾玻璃表面1)將玻璃片用體積比1∶1∶5的25％NH3，30％H2O2和H2O溶液清洗；然后用體積比1∶1∶5為37％HCl，30％H2O2和H2O溶液處理5-10分鐘；對鍍鋁的玻璃片則改用30％的H2O2處理；再將其分別用水，酒精和丙酮清洗，使其在空氣下干燥后再置于100-120℃的烘箱內(nèi)干燥0.5-1小時；2)將玻璃片用1-5％的3-胺基-丙基-三乙氧基硅烷(APTES)的甲苯溶液修飾3-10分鐘，再用甲苯及丙酮清洗之，然后在100-120℃下干燥0.5-1小時，使玻璃片表面帶上氨基；3)用硝酸鈰銨腐蝕液腐蝕掉剩余的鉻層；或用磷酸溶液腐蝕鋁膜；并用雙蒸水進行充分的清洗后晾干。
9.根據(jù)權利要求8所述的用于免疫學分析的蛋白質芯片的制作工藝，其特征在于所述的硝酸鈰銨腐蝕液配方硝酸鈰銨100克，醋酸17.5mL，加雙蒸水稀釋至500mL；所述的磷酸溶液為1.6mol/L的磷酸溶液。
10.權利要求1所述的用于免疫學分析的蛋白質芯片的使用方法，其特征在于它是經(jīng)過下述步驟1)將配好的抗原加到經(jīng)過修飾的玻璃基片表面，使蛋白質與表面的氨基作用約10-30min，通過化學鍵連接于載玻片上而被固定；然后用pH值在7.2-7.4之間磷酸鹽緩沖液0.2mol/L的Na2HPO481.0mL，0.2mol/L的NaH2PO419.0mL混合和雙蒸水分別沖洗基片表面，洗掉多余的抗原后晾干；2)將用熒光標記的待測樣品溶液加到固定有抗原的玻璃片表面上，在常溫下保持5-10min，使抗原和抗體充分反應；3)用pH值在7.2-7.4之間的磷酸鹽緩沖液和雙蒸水依次沖洗玻璃片，洗去殘余的樣品，并在常溫下晾干；4)在熒光顯微鏡下對芯片進行檢測分析，或利用CCD系統(tǒng)拍照后對其熒光強度進行分析。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于免疫學分析的新型蛋白質芯片。在潔凈的玻璃基片上鍍一層金屬膜后用甩膠機在上面涂一層光敏膠。將具有圖案的光刻掩模蓋在基片上，在紫外光刻機下光刻，顯影定影后得到微圖案。再將露出的金屬圖案腐蝕掉，露出玻璃圖案。去膠后，修飾露出的玻璃圖案，使其具有活性功能基團——氨基。去掉剩余的金屬膜并清洗晾干后，將抗原蛋白溶液覆蓋于基片表面，蛋白質與氨基作用后通過化學鍵連接于載玻片上而被固定。利用熒光標記物對蛋白質樣品分子進行標記，最后利用芯片熒光顯微分析系統(tǒng)對蛋白質樣品進行檢測分析。本發(fā)明是靈敏度和特異性都較高的生物化學型蛋白質芯片，制作方法簡便、適合于批量生產(chǎn)，并且可以對多種蛋白質樣品進行檢測分析。
文檔編號G01N21/64GK1645147SQ200510013108
公開日2005年7月27日 申請日期2005年1月18日 優(yōu)先權日2005年1月18日
發(fā)明者王立凱, 馮喜增, 秦明, 張福海, 賈云芳, 牛文成 申請人:南開大學