專利名稱:弓形蟲P35血清IgM抗體免疫膠體金檢測試紙條及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種利用膠體金免疫層析技術(shù)檢測血液中弓形蟲IgM抗體水平的試 紙條及其制備方法,屬于醫(yī)學(xué)和生物學(xué)檢驗領(lǐng)域。
背景技術(shù):
弓形蟲是由一種弓形蟲寄生引起的感染,世界各地的弓形蟲感染非常普遍。 1985-1990年我國的23個省、市、自治區(qū)的調(diào)查,大都在10%以下。正常人感染弓形蟲絕大 多數(shù)沒有癥狀,或者癥狀很輕,不知道是什么時候感染的,只有少數(shù)人初次感染(或稱原發(fā) 性感染)時有發(fā)熱、淋巴結(jié)腫大、頭痛、肌肉關(guān)節(jié)痛和腹痛,幾天或數(shù)周后隨著人體產(chǎn)生免 疫力,癥狀小時,只是形成的包囊在身體里存在幾個月、好幾年或者更長時間, 一般都是自 愈。吃未煮熟的肉,特別是豬、羊。幾乎所有哺乳動物和鳥類,如鼠類、豬、羊、牛、家兔和雞、 鴨、鵝等,都可以傳染弓形蟲,而且感染率很高。人的傳染來源主要來自于這些動物的肉類, 如涮肉的溫度不夠和時間過短,其中的弓形蟲沒有殺死,就有傳染的危險。生肉或切肉案板 的污染同樣可以傳染。污染的羊、牛奶也可以傳染。 現(xiàn)有檢測弓形蟲抗體的方法主要是通過酶聯(lián)免疫吸附(EIA)來檢測,該方法有不 足之處。主要表現(xiàn)以下幾方面需要專門的儀器設(shè)備來配合使用;試劑要求低溫保存;檢測 人員需要經(jīng)過專業(yè)的培訓(xùn);操作過程相對比較復(fù)雜,檢測所需的時間較長;檢測所需費用 較高,不能實現(xiàn)單人份檢測;不利于在基層單位及臨床的推廣使用。也有采用蟲體抗原的膠 體金診斷試劑,但由于抗原是多種蛋白的復(fù)合物,假陽性較多,采用基因重組抗原則可以有 效克服以上缺陷。弓形蟲表面抗原P35可以有效激發(fā)機體的免疫反應(yīng),可用來檢測人血清 中的抗P35抗體,用于弓形蟲感染的診斷。
發(fā)明內(nèi)容
為克服現(xiàn)有弓形蟲抗體檢測技術(shù)的不足,本發(fā)明提供一種快速檢測弓形蟲P35血 清IgM抗體的試紙條。不需要任何儀器設(shè)備輔助的快速檢測試劑。本發(fā)明根據(jù)膠體金免 疫層析技術(shù)特點和弓形蟲P35基因重組抗原系統(tǒng)特點,設(shè)計新的原材料,試劑和工藝流程, 應(yīng)用本發(fā)明提供的試紙條檢測弓形蟲IgM抗體水平,具有簡單,快速,靈敏和特異性好等特 點,30分鐘以內(nèi)出結(jié)果,并且價格低,適用于基層檢測和臨床初篩。 本發(fā)明所述試紙條是由PVC底板(1)上依次接合吸水墊(2)、特定包被的硝酸纖維 膜(3)、涂覆膠體金標(biāo)記弓形蟲P35基因重組抗原的玻璃纖維膠體金結(jié)合墊(6)、樣品墊(7) 而組成的條形物。檢測樣品經(jīng)過樣品墊和結(jié)合墊再經(jīng)層析作用在NC膜上出現(xiàn)檢測線和質(zhì) 控線,用肉眼判斷結(jié)果。在NC膜上僅僅出現(xiàn)一條質(zhì)控線,結(jié)果為陰性,在NC膜上同時出現(xiàn) 檢測線和質(zhì)控線,結(jié)果為陽性性,不出現(xiàn)線條表示試紙條或測試卡失效。30分鐘內(nèi)出結(jié)果。
本發(fā)明所述試紙條吸水墊為一種濾紙,包括吸水紙和濾油紙,切成要求大小直接 使用。貼在底板的末端,起吸水作用。
本發(fā)明所述試紙條上特定包被的NC膜是一種專門用于膠體金試紙條的材料,由 一層濾膜和膠膜組成,成巻筒裝,NC膜上噴2條線,分別為檢測線和質(zhì)控線,檢測線噴涂的 是鼠抗人IgM(y鏈),質(zhì)控線噴涂的是兔抗P35 ;NC膜貼在底板的中間,兩端分別與結(jié)合墊 和吸水墊連接。 本發(fā)明所述試紙條上結(jié)合墊為玻璃纖維紙,噴涂上膠體金標(biāo)記弓形蟲P35基因重 組抗原,再37t:干燥,結(jié)合墊上與樣品墊銜接,下與NC膜銜接。 本發(fā)明所述試紙條樣品墊為玻璃纖維紙,用硼酸緩沖液浸泡處理,緩沖液ra為
7. 2,浸泡處理后,37t:干燥過夜,在試劑條中起過濾樣品的作用,位于結(jié)合墊上,貼在底板 上。 本發(fā)明還提供上述試紙條在制備弓形蟲P35血清IgM抗體診斷試紙條中的應(yīng)用, 診斷試紙條還包括標(biāo)識條,此標(biāo)識條為兩個帶有標(biāo)識的不干膠紙,分別粘貼在試紙條的兩 端,帶有箭頭端是貼在樣品墊和結(jié)合墊上,由此端浸入待測樣品,靠另一端的吸水墊的吸水 作用,使樣品經(jīng)過NC膜。 本發(fā)明還提供上述試紙條在制備弓形蟲P35血清IgM抗體測試卡中的應(yīng)用,測試 卡還包括塑料卡,此塑料卡是一個用塑料特制的卡,由上下2片組成,上下片可嵌合在一 起,下片主要有一個放試紙條的槽和與上片結(jié)合的卡齒,上片主要包括一個檢測孔、一個樣 品孔以及與下片結(jié)合的卡齒,檢測孔旁邊分別印有T和C字樣,T表示檢測線的位置,C表示 質(zhì)控線的位置,檢測孔是觀察結(jié)果的窗口,樣品孔是滴加樣品的位置。此塑料卡起保護試紙 條的作用,并且更美觀,減少污染和保護操作者的安全。
本發(fā)明所述試紙條的制備方法,包括如下步驟 1)弓形蟲P35基因重組抗原,自制或購買,分子量35kDa,純度10ug上樣 SDS-PAGE —條帶。 2)鼠抗人-IgM(ii鏈),自制或購買。 3)兔抗P35制備方法通過弓形蟲P35基因重組抗原免疫家兔,提取兔血清,純化
后得到兔抗P35。 4)膠體金的制備 a量取一定量的洗液于潔凈的燒瓶中,煮沸5分鐘;
b量取一定量的超純水于該燒瓶中,煮沸5分鐘; c棄去超純水,稱取適量三蒸水于該燒瓶中,加熱至沸騰,加入適量1%氯金酸,加 熱至沸騰; d攪拌下加入6 10毫升1 %檸檬酸三鈉,沸騰5-10分鐘;
5)膠體金探針標(biāo)記 取膠體金100毫升,調(diào)節(jié)膠體金溶液ra值8. 0,攪拌加入1毫升弓形蟲P35基因重 組抗原,再緩慢加入1毫升10% BSA充分混勻,攪拌,離心棄上清,加入工作液溶解;
6)制備檢測弓形蟲血清IgM抗體的膠體金免疫試紙條 用噴涂機將標(biāo)記弓形蟲P35基因重組抗原的膠體金溶液噴在玻璃纖維膜上,37t: 干燥;將制備好的試劑條板上NC膜用噴膜機分別噴上鼠抗人-IgM(ii鏈)和質(zhì)控抗體(兔 抗P35),噴完后37t:干燥過夜;將吸水墊、已包被的硝酸纖維膜、玻璃纖維膠體金結(jié)合墊、 樣品墊依次粘于底板上,裁成細條,即成一種檢測弓形蟲血清IgM抗體的膠體金免疫試紙
4條。 上述膠體金制備過程中,優(yōu)選后的條件為三蒸水200毫升,氯金酸10毫升,檸檬酸三鈉7.5毫升。 本發(fā)明的有益效果應(yīng)用本發(fā)明提供的試紙條檢測人體內(nèi)弓形蟲P35血清IgM抗體水平,成本低廉,操作簡單、快速、靈敏,且特異性好,不需要特殊檢測儀器設(shè)備,因此可廣泛應(yīng)用于各級醫(yī)療檢驗場所,尤其是基層醫(yī)療機構(gòu),包括鄉(xiāng)鎮(zhèn)衛(wèi)生院等均可開展。本發(fā)明有益于弓形蟲IgM抗體篩查的普及,進而對于弓形蟲事件發(fā)生的預(yù)防有極為重要的意義。
圖1為本發(fā)明的結(jié)構(gòu)示意圖 1 :PVC底板;2 :吸水墊;3 :特定包被的硝酸纖維膜;4 :檢測線;5 :質(zhì)控線;6 :結(jié)合墊;7:樣品墊。 圖2為本發(fā)明的檢測結(jié)果示意圖 a :陽性;b :陰性;C :無效;4 :檢測線;5 :質(zhì)控線。 圖3為本發(fā)明的試紙條外觀示意圖 a :樣本墊;b :結(jié)合墊;C :檢測線;d :質(zhì)控線;e :試紙條名稱 圖4為本發(fā)明的測試卡外觀示意圖 a :樣本孔;b :測試孔;T :檢測線;C :質(zhì)控線。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施方式
對本發(fā)明作進一步說明,凡依照本發(fā)明公開內(nèi)容所作出的
本領(lǐng)域等同替換,均屬于本發(fā)明的保護范圍。
實施例1 : 弓形蟲P35血清IgM抗體膠體金免疫試紙條制備方法,它包括如下步驟
1、膠體金的制備 量取一定量的洗液于潔凈的250ml三角燒瓶中,煮沸5分鐘;量取一定量的超純水于該燒瓶中,煮沸5分鐘;棄去超純水,稱取200ml超純水于該燒瓶中,加熱至沸騰,加入1%氯金酸10ml,邊煮邊攪拌,加熱至沸騰;攪拌下加入1%檸檬酸三鈉10ml,沸水下快速攪拌,直到氯金酸溶液的顏色慢慢穩(wěn)定,呈紅色后,繼續(xù)沸騰5分鐘,制成小顆粒膠體金。
2、制備檢測弓形蟲P35血清IgM抗體的膠體金免疫試紙條 用噴涂機將標(biāo)記弓形蟲P35基因重組抗原的膠體金溶液噴涂在玻璃纖維膜上,
37t:干燥;將制備好的試劑條板上NC膜用噴膜機分別噴上鼠抗人-IgM(ii鏈)和質(zhì)控抗體
(兔抗P35)。噴完后37t:干燥過夜。將吸水墊、已包被的硝酸纖維膜、玻璃纖維膠體金結(jié)合
墊、樣品墊依次粘于底板上,裁成細條,即成一種檢測弓形蟲P35血清IgM抗體的膠體金免
疫試紙條。
實施例2 : 弓形蟲P35血清IgM抗體的膠體金免疫診斷試紙條制備方法,它包括如下步驟
將兩個帶有標(biāo)識的不干膠紙(標(biāo)識條)分別粘貼在實施例2中所制備試紙條的兩端,帶有箭頭端是貼在樣品墊和結(jié)合墊上,由此端浸入待測樣品,靠另一端的吸水墊的吸水作用,使樣品經(jīng)過NC膜。即成一種檢測弓形蟲P35血清IgM抗體的膠體金免疫診斷試紙條。
見圖3。
實施例3 : 弓形蟲P35血清IgM抗體的膠體金免疫診斷測試卡制備方法,它包括如下步驟
將實施例2中所制備試紙條放入塑料卡下片試紙條槽中,與上片嵌合,即成一種檢測同型半胱氨酸的膠體金免疫診斷測試卡,見圖4。此塑料卡是一個用塑料特制的卡,由上下2片組成,上下片可嵌合在一起,下片主要有一個放試紙條的槽和與上片結(jié)合的卡齒,上片主要包括一個檢測孔(見圖4b)、一個樣品孔(見圖4a)以及與下片結(jié)合的卡齒,檢測孔旁邊分別印有T和C字樣,T表示檢測線的位置,C表示質(zhì)控線的位置,檢測孔是觀察結(jié)果的窗口 ,樣品孔是滴加樣品的位置。
實施例4 : 弓形蟲P35血清IgM抗體免疫膠體金診斷層析試紙條使用方法 如圖3所示,將試紙條樣品墊插入待測液中,浸潤后取出,水平放置,約30分鐘后,
僅在質(zhì)控線C處出現(xiàn)一條線,結(jié)果為陰性;在檢測線T和質(zhì)控線C處分別出現(xiàn)一條線,結(jié)果
為陽性;不出現(xiàn)線條表示測試條失效。
實施例5 : 弓形蟲P35血清IgM抗體免疫膠體金診斷層析測試卡使用方法 如圖4所示,將樣本加入樣本孔a,加樣量75微升 80微升,水平放置,約30分鐘
后,僅在測試孔b的質(zhì)控線C處出現(xiàn)一條線,結(jié)果為陰性;在測試孔b的檢測線T和質(zhì)控線
C處分別出現(xiàn)一條線,結(jié)果為陽性;不出現(xiàn)線條表示測試卡失效。
權(quán)利要求
一種檢測弓形蟲P35血清IgM抗體的免疫膠體金層析試紙條,其特征在于所述試紙條是由PVC底板(1)上的依次接合吸水墊(2)、特定包被的硝酸纖維膜(NC膜)(3)、NC膜上有檢測線(4)和質(zhì)控線(5),噴涂膠體金標(biāo)記弓形蟲P35基因重組抗原的玻璃纖維膠體金結(jié)合墊(6)、樣品墊(7)而組成的條形物。所述試紙條其特征在于所述吸水墊(2)為一種濾紙,包括吸水紙和濾油紙;吸水墊貼在底板的末端。所述試紙條其特征在于所述特定包被的NC膜(3)由一層濾膜和膠膜組成,NC膜上噴涂鼠抗人-IgM(μ鏈)和兔抗P35;NC膜貼在底板的中間,兩端分別與結(jié)合墊和吸水墊連接。所述試紙條其特征在于所述結(jié)合墊(6)為玻璃纖維紙,噴涂上膠體金標(biāo)記的弓形蟲P35基因重組抗原,再37℃干燥,結(jié)合墊上與樣品墊銜接,下與NC膜銜接。所述試紙條,其特征在于所述樣品墊(7)為玻璃纖維紙,用硼酸緩沖液浸泡,緩沖液PH為7.2,浸泡處理后,37℃干燥過夜;樣品墊位于結(jié)合墊上。所述的試紙條在制備弓形蟲血清IgM抗體診斷試紙條中的應(yīng)用,其特征在于診斷試紙條還包括標(biāo)識條,此標(biāo)識條為兩個帶有標(biāo)識的不干膠紙,分別粘貼在試紙條的兩端,帶有箭頭端是貼在樣品墊和結(jié)合墊上,由此端浸入待測樣品,靠另一端的吸水墊的吸水作用,使樣品經(jīng)過NC膜。所述的試紙條在制備弓形蟲血清IgM抗體測試卡中的應(yīng)用,其特征在于測試卡還包括塑料卡,此塑料卡是一個用塑料特制的卡,由上下2片組成,上下片可嵌合在一起,下片主要有一個放試紙條的槽和與上片結(jié)合的卡齒,上片主要包括一個檢測孔、一個樣品孔以及與下片結(jié)合的卡齒,檢測孔旁邊分別印有T和C字樣,T表示檢測線的位置,C表示質(zhì)控線的位置,檢測孔是觀察結(jié)果的窗口,樣品孔是滴加樣品的位置。
2. —種檢測弓形蟲血清IgM抗體的免疫膠體金層析試紙條的制備方法,包括如下步驟1、弓形蟲P35基因重組抗原自制或購買,分子量35kDa,純度10ug上樣SDS-PAGE —條帶。2、鼠抗人-IgM(ii鏈)自制或購買。3、兔抗P35制備方法通過形蟲P35基因重組抗原免疫家兔,提取兔血清,純化后得到兔抗P35。 4、膠體金的制備a)量取一定量的洗液于潔凈的燒瓶中,煮沸5分鐘;b)量取一定量的超純水于該燒瓶中,煮沸5分鐘;C)棄去超純水,稱取適量三蒸水于該燒瓶中,加熱至沸騰,加入適量1%氯金酸,加熱至沸騰;d)攪拌下加入6 10毫升1%檸檬酸三鈉,沸騰5-10分鐘;5、膠體金探針標(biāo)記取膠體金100毫升,調(diào)節(jié)膠體金溶液ra值8.0,攪拌加入l毫升弓形蟲P35基因重組抗原,再緩慢加入l毫升10% BSA充分混勻,攪拌,離心棄上清,加入工作液溶解;6、制備檢測弓形蟲血清IgM抗體的膠體金免疫試紙條用噴涂機將標(biāo)記弓形蟲P35基因重組抗原的膠體金溶液噴涂在玻璃纖維膜上,37t:干燥;將制備好的試劑條板上NC膜用噴膜機分別噴上鼠抗人-IgM(i!鏈)和質(zhì)控抗體(兔抗P35),噴完后37t:干燥過夜;將吸水墊、已包被的硝酸纖維膜、玻璃纖維膠體金結(jié)合墊、樣品墊依次粘于底板上,裁成細條,即成一種檢測弓形蟲血清IgM抗體的膠體金免疫試紙條。所述制備方法其特征在于c)步中所述三蒸水為200毫升,所述氯金酸為10毫升,d)步中所述檸檬酸三鈉為7. 5毫升。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)和生物學(xué)檢測領(lǐng)域,涉及一種檢測弓形蟲P35血清IgM抗體免疫膠體金檢測試紙條及其制備方法。該試紙條是由PVC底板(1)上的依次接合吸水墊(2)、特定包被的硝酸纖維膜(NC膜)(3)、NC膜上有檢測線(4)和質(zhì)控線(5),噴涂膠體金標(biāo)記弓形蟲P35基因重組抗原的玻璃纖維膠體金結(jié)合墊(6)、樣品墊(7)而組成的條形物。應(yīng)用本發(fā)明所提供的試紙條檢測人血清中弓形蟲IgM抗體水平,具有操作簡單、快速、靈敏和特異性好等特點,操作人員無需專業(yè)培訓(xùn),按說明書即可完成操作,具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號G01N33/552GK101793895SQ200910304120
公開日2010年8月4日 申請日期2009年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月8日
發(fā)明者華艷, 呂傳臣, 馬運國 申請人:北京現(xiàn)代高達生物技術(shù)有限責(zé)任公司