專(zhuān)利名稱(chēng)：一種豬2型細(xì)環(huán)病毒抗體膠體金快速診斷試紙及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及獸藥領(lǐng)域，具體涉及一種豬2型細(xì)環(huán)病毒抗體膠體金快速診斷試紙及其制備方法。
背景技術(shù)：
輸血傳播病毒(TransufsionTransmitted Viurs, TTV)是一類(lèi)無(wú)囊膜，二十面體，單股負(fù)鏈環(huán)狀的DNA病毒，電鏡觀(guān)察病毒顆粒直徑約為30-32 nm。TTV首次由日本學(xué)者從一例未知病原的 非甲-非戊型輸血后肝炎病人的血清中發(fā)現(xiàn)，隨后人們?cè)诜庆`長(zhǎng)類(lèi)以及豬、牛、羊、犬，貓、家禽等多種家養(yǎng)及野生動(dòng)物體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了 TTV的感染。2009年，國(guó)際病毒分類(lèi)協(xié)會(huì)(ICTV)將豬的TTV劃分到指環(huán)病毒科(Anelloviridae)細(xì)環(huán)病毒屬(1tatorquevirus),并進(jìn)一步劃分為兩個(gè)種:豬I型細(xì)環(huán)病毒(TTSuVl)和豬2型細(xì)環(huán)病毒(TTSuV2)。2004年，McKeown對(duì)中國(guó)，愛(ài)荷華州，泰國(guó)，安大略，韓國(guó)，西班牙，魁北克和薩斯喀徹溫省這六個(gè)不同國(guó)家地區(qū)的154份豬血清進(jìn)行檢測(cè)，TTSuVs陽(yáng)性率可高達(dá)66.2%。近年來(lái)，我國(guó)關(guān)于TTSuVl和TTSuV2的報(bào)道逐漸增多，TTSuVs的感染具有廣泛性和普遍性，這一特點(diǎn)引起了諸多科研工作者的關(guān)注。根據(jù)目前的報(bào)道，國(guó)內(nèi)采用PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TTSuV2抗原在豬血清中的檢出率在30%-80%，TTSuV2的感染在增強(qiáng)PMWS和TONS病癥方面起著重要的作用。TTSuV2感染后，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生TTSuV2的特異性抗體，TTSuV2抗原的含量(TTSuV2感染或其結(jié)構(gòu)蛋白的量)與血清中TTSuV2特異性抗體的滴度呈正相關(guān)。目前行業(yè)內(nèi)還沒(méi)有關(guān)于TTSuV2抗體快速診斷方法，因此提供一種TTSuV2抗體快速診斷方法的試紙具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種豬2型細(xì)環(huán)病毒抗體膠體金快速診斷試紙，能夠快速TTSuV2抗體，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，使用方便，并具有良好的靈敏度和特異性。本發(fā)明的另一目的在于提供一種豬2型細(xì)環(huán)病毒抗體膠體金快速診斷試紙的制備方法，通過(guò)該方法獲得一種靈敏度高和特異性良好的豬2型細(xì)環(huán)病毒抗體膠體金快速診斷試紙。為實(shí)現(xiàn)上述方案，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下:一種豬2型細(xì)環(huán)病毒抗體膠體金快速診斷試紙，其包括PVC底板、樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜及吸水濾紙，樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜及吸水濾紙按照層析方向依次設(shè)置在PVC底板上，并且樣品墊的一端疊在膠體金結(jié)合墊前端，膠體金結(jié)合墊的后端疊在硝酸纖維素膜的一端，吸水濾紙的前端疊在硝酸纖維素膜的另一端；所述硝酸纖維素膜上分別噴制有檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)，所述膠體金結(jié)合墊由一層硝酸纖維素膜和噴在該硝酸纖維素膜上的rTTSuV2 ORFr膠體金組成。在本發(fā)明中，所述的rTTSuV2 0RF1’膠體金是通過(guò)以下方法制備而成:
1)TTSuV2ORFl蛋白序列分析與篩選:篩選出具有較強(qiáng)抗原的TTSuV2 0RF1’氨基序列SEQ ID NO:1 ；
2)TTSuV2 ORFr的表達(dá)與純化:以步驟I)中的氨基序列所對(duì)應(yīng)的核酸序列為模板應(yīng)用Primer Premier5.0設(shè)計(jì)正向引物SEQ ID N0:2和反向引物SEQ ID N0:3，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增構(gòu)建插入TTSuV2 ORFr的pET21b重組質(zhì)粒，雙酶切PCR產(chǎn)物及載體，連接，轉(zhuǎn)化E.coli:DH5a后，獲取正確的載體，提取重組質(zhì)粒pET21b-TTSuV2 0RF1’；再將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E.coliBL21，涂布于LA平板上，培養(yǎng)6-9小時(shí)后挑取單菌落，并將挑取的單菌落接種于LA液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2-5小時(shí)，加入的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)；3-8小時(shí)后，離心、收集菌體，最后，應(yīng)用切膠回收的方法回收蛋白，I XPBS透析后獲得TTSuV2 ORFr重組蛋白；
3)免疫膠體金制備:取質(zhì)量濃度為0.01%氯金酸水溶液并加熱至沸騰，滴加1%檸檬酸三鈉水溶液并不斷攪拌，在氯·金酸水溶液由金黃色變?yōu)樽霞t色后繼續(xù)煮沸，冷卻后以蒸餾水恢復(fù)至原體積，2-8 °C保存待用；
4)rTTSuV20RF1’膠體金的制備:將TTSuV2 0RF1’重組蛋白溶液濃度至I mg/mL后轉(zhuǎn)入透析袋中，2-8°C下用濃度為20 mmol/L、pH值為7.0的Tris緩沖液透析過(guò)夜；之后在透析處理的rTTSuV2 0RF1’中按照rTTSuV2 0RF1’與膠體金的體積比為50-300 μ L/1OmL的比例加入步驟3)中的膠體金，2-8°C靜置并使rTTSuV2 0RF1’充分與膠體金結(jié)合，然后按每10 mL膠體金加2 mL質(zhì)量濃度為5% BSA溶液比例加入BSA溶液，充分混勻后離心
0.5-1.5 h，棄上清液，膠體金沉淀用保護(hù)液再溶解，即制得rTTSuV2 0RF1’免疫膠體金。本發(fā)明中所述檢測(cè)線(xiàn)是將透析處理后的rTTSuV2 0RF1’噴在硝酸纖維素膜而形成線(xiàn)，所述質(zhì)控線(xiàn)是TTSuV2強(qiáng)陽(yáng)性抗體在硝酸纖維素膜而形成線(xiàn)。本發(fā)明中所述TTSuV2強(qiáng)陽(yáng)性抗體是通過(guò)TTSuV2 ELISA抗體診斷試劑盒對(duì)290份豬血清樣品進(jìn)行篩選，選擇OD值為0.8-0.9的樣品。在上述方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明所述的步驟3)中膠體金的pH值為9-11。一種豬2型細(xì)環(huán)病毒抗體膠體金快速診斷試紙的制備方法，其特征在于其是按照以下步驟制備:
1)TTSuV20RF1’蛋白序列分析與篩選:用ProtScale生物軟件篩選出具有較強(qiáng)抗原的TTSuV2 0RF1，氨基序列 SEQ ID NO:1 ；
2)構(gòu)建TTSuV2ORFr重組蛋白:以步驟I)中的氨基序列所對(duì)應(yīng)的核酸序列為模板應(yīng)用Primer Premier5.0設(shè)計(jì)引物正向引物SEQ ID N0:2和反向引物SEQ ID N0:3，化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入E.Coli BL21感受態(tài)細(xì)胞中，篩選重組的TTSuV2 0RF1’拷貝子，獲得TTSuV2 0RF1’重組蛋白 rTTSuV2 0RF1，；
3)膠體金制備:取質(zhì)量濃度為0.01%氯金酸水溶液并加熱至沸騰，滴加1%檸檬酸三鈉水溶液并不斷攪拌，在氯金酸水溶液由金黃色變?yōu)樽霞t色后繼續(xù)煮沸15 min,冷卻后以蒸餾水恢復(fù)至原體積，2-8 °C保存待用；
4)免疫膠體金的制備:將TTSuV2ORFr重組蛋白溶液濃度至I mg/mL后轉(zhuǎn)入透析袋中，2-8°C下用濃度為20 mmol/1、pH值為7.0的Tris緩沖液透析過(guò)夜；之后在透析處理的rTTSuV2 ORFr中按照rTTSuV2 0RF1’與膠體金的體積比為50-300 μ L/10mL的比例加入步驟3)中的膠體金，2-8°C靜置并使rTTSuV2 0RF1’充分與膠體金結(jié)合，然后按每10 mL膠體金加2 mL質(zhì)量濃度為5% BSA溶液比例加入BSA溶液，充分混勻后離心0.5-1.5 h，棄上清液，膠體金沉淀用保護(hù)液再溶解，即制得rTTSuV2 ORFr免疫膠體金；
5)膠體金試紙的組裝:將制備的rTTSuV20RF1’膠體金噴于硝酸纖維素膜上，真空冷凍干燥后形成膠體金結(jié)合墊；在硝酸纖維素膜上噴制檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)；然后將樣品墊、膠體金結(jié)合墊、噴制好檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)的硝酸纖維素膜及吸水紙組裝一起，即為豬2型細(xì)環(huán)病毒抗體膠體金快速診斷試紙。獲得TTSuV2 0RF1’重組蛋白rTTSuV2 0RF1’的方法可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員所掌握的任何生物學(xué)方法。在本發(fā)明中，優(yōu)選的采用以下方法:以步驟I)中的氨基序列所對(duì)應(yīng)的核酸序列為模板應(yīng)用Primer Premier5.0設(shè)計(jì)引物正向引物SEQ ID N0:2和反向引物SEQID勵(lì):3，經(jīng)過(guò)？0 擴(kuò)增構(gòu)建插入11^1^2 0RF1’的pET21b重組質(zhì)粒，雙酶切PCR產(chǎn)物及載體，連接，轉(zhuǎn)化E.col1:DH5a后，獲取正確的載體，提取重組質(zhì)粒pET21b-TTSuV2 ORFI’ ；再將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E.coli BL21，涂布于LA平板上，培養(yǎng)6-9小時(shí)后挑取單菌落，并將挑取的單菌落接種于LA液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2-5小時(shí)，加入的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)；3-8小時(shí)后，離心、收集菌體，最后，應(yīng)用切膠回收的方法回收蛋白，IXPBS透析后獲得rTTSuV2 ORFI’。步驟2)PCR擴(kuò)增的條件為94°C 45 S，55°C 45 S’72 V 90 S，共30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘。本發(fā)明中rTTSuV2 0RF1’的純度達(dá)到90%以上。步驟4)中所述的保護(hù)液為含有I % BSA，且ρΗ=7.0，濃度為0.01 mo I/LTris-HCl 溶液。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在制備膠體金的過(guò)程中，膠體金產(chǎn)生塊狀沉淀的現(xiàn)象，并發(fā)現(xiàn)進(jìn)過(guò)pH值對(duì)膠體金的溶解度影響較大，為了確定膠體金的最佳pH值:取6份10 mL膠體金用0.1mol/L 的 K2CO3 分別調(diào) pH 為:7.0、8.0、9.0、10.0、11.0 和不調(diào) pH，4°C靜置 20 min 使rTTSuV2 ORFr充分與膠體金結(jié)合，按每10 mL膠體金加2mL 5% BSA溶液，充分混勻，配平后13000 r/min (BECKMAN J2_21M)4°C離心I h后棄上清液，向各離心管中加入10 mL保護(hù)液，震蕩混勻；觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，pH 7.0,8.0和不調(diào)pH處理的膠體金沉淀成塊狀，且不易溶于保護(hù)液；pH 9.0,10.0和11.0處理的膠體金沉淀易溶解。因此，在上述方案的基礎(chǔ)，優(yōu)選的，步驟3)中還包括用0.1 mol/L的K2CO3調(diào)節(jié)膠體金的pH值至9_11的。另外，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，rTTSuV2 0RF1’的膠體金標(biāo)記濃度對(duì)檢測(cè)的靈敏性有較大的影響，當(dāng)標(biāo)記濃度在50-300 μ L/1OmL是，檢測(cè)的結(jié)果較為明顯，為了找到最佳的標(biāo)記濃度，本發(fā)明還在標(biāo)記濃度在50-300 μ L/1OmL的范圍內(nèi)做了以下實(shí)驗(yàn):取5份10 mL膠體金用0.1mol/L I^K2COJpH 為 9.0，每份加處理過(guò)的 rTTSuV2 0RF1，50、100、150、200、300 μ L,處理好的rTTSuV2 ORFr噴 分別涂于5張硝酸纖維素膜上真空冷凍干燥，分別將標(biāo)記不同量的膠體金與噴好的膜組裝成試紙條，加TTSuV2陽(yáng)性血清、陰性血清；顯色結(jié)果表明標(biāo)記濃度為200 μ L/ 10 mL時(shí),顯色時(shí)間最短,靈敏度最好。本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明的豬2型細(xì)環(huán)病毒抗體膠體金快速診斷試紙，能夠快速TTSuV2抗體，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，使用方便，并具有良好的名感性和特異性。下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。


圖1為本發(fā)明所述的豬2型細(xì)環(huán)病毒抗體膠體金快速診斷試紙結(jié)構(gòu)示意 圖2為采用本發(fā)明所述的豬2型細(xì)環(huán)病毒抗體膠體金快速診斷試紙檢測(cè)樣品結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式以下是本發(fā)明的具體實(shí)施例。實(shí)施例1
如圖1所示，本發(fā)明所述的豬2型細(xì)環(huán)病毒抗體膠體金快速診斷試紙，其包括PVC底板1、樣品墊2、膠體金結(jié)合墊3、硝酸纖維素膜4及吸水濾紙5，樣品墊2、膠體金結(jié)合墊3、硝酸纖維素膜4及吸水濾紙5按照層析方向依次設(shè)置在PVC底板I上，并且樣品墊2的一端疊在膠體金結(jié)合墊3前端,膠體金結(jié)合墊3的后端疊在硝酸纖維素膜4的一端,吸水濾紙5的前端疊在硝酸纖維素膜4的另一端；所述硝酸纖維素膜4上分別噴制有檢測(cè)線(xiàn)41和質(zhì)控線(xiàn)42，所述膠體金結(jié)合墊由一層硝酸纖維素膜和噴在該硝酸纖維素膜上的rTTSuV2 0RF1’膠體金組成；并通過(guò)以 下方法制備:
1)TTSuV20RF1’蛋白序列分析與篩選:用ProtScale生物軟件篩選出具有較強(qiáng)抗原的TTSuV2 0RF1，氨基序列 SEQ ID NO:1 ；
2)以步驟I)中的氨基序列所對(duì)應(yīng)的核酸序列為模板應(yīng)用PrimerPremier5.0設(shè)計(jì)正向引物SEQ ID NO: 2和反向引物SEQ ID NO: 3經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增構(gòu)建插入TTSuV2 0RF1’的pET21b重組質(zhì)粒構(gòu)建插入TTSuV2 0RF1’的pET21b重組質(zhì)粒，用化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入E.ColiBL21感受態(tài)細(xì)胞，具體程序如下:PCR擴(kuò)增條件為94°C 45 S，55°C 45 S,72°C 90 S，共30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘，雙酶切PCR產(chǎn)物及載體，連接，轉(zhuǎn)化E.coli:DH5 α中，對(duì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物提取重組質(zhì)粒pET21b-TTSuV2 0RF1’，再將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E.coli BL21，涂布于LA平板上，置于37°C培養(yǎng)6小時(shí)，觀(guān)察轉(zhuǎn)化子的生長(zhǎng)；挑取單菌落，接種于700 μ L LA液體培養(yǎng)基中，于37°C培養(yǎng)3小時(shí)，加入ImM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)；6小時(shí)后，離心、收集菌體，最后應(yīng)用切膠回收的方法回收蛋白，I X PBS透析，SDS-PAGE再次驗(yàn)證蛋白純度，用蛋白定量試劑盒進(jìn)行定量分析，-20°C保存；
3)膠體金制備:取質(zhì)量濃度為0.01%氯金酸水溶液并加熱至沸騰，滴加1%檸檬酸三鈉水溶液并不斷攪拌，在氯金酸水溶液由金黃色變?yōu)樽霞t色后繼續(xù)煮沸15 min，冷卻后以蒸餾水恢復(fù)至原體積；
4)免疫膠體金的制備:rTTSuV20RF1’用pH值為9.0的膠體金進(jìn)行標(biāo)記，具體步驟為將TTSuV2 ORFr重組蛋白溶液濃度至I mg/mL后轉(zhuǎn)入透析袋中，4°C下用濃度為20 mmol/L、pH值為7.0的Tris緩沖液透析過(guò)夜；之后將經(jīng)透析處理的rTTSuV2 0RF1’蛋白溶液與膠體金按照50 μ L/1OmL的比例混合，4°C靜置并使rTTSuV2 ORFl ’充分與膠體金結(jié)合，然后按每10 mL膠體金加2 mL質(zhì)量濃度為5% BSA溶液比例加入BSA溶液，充分混勻后離心lh，棄上清液，膠體金沉淀用保護(hù)液再溶解，即制得rTTSuV2 ORF1’免疫膠體金；
5)膠體金試紙的組裝:將制備的rTTSuV2 ORF1’膠體金噴于硝酸纖維素膜上，真空冷凍干燥后形成膠體金結(jié)合墊；在硝酸纖維素膜上噴制檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)；然后將樣品墊、膠體金結(jié)合墊、噴制好檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)的硝酸纖維素膜及吸水紙按照?qǐng)D1所述的結(jié)構(gòu)進(jìn)行組裝，即為豬2型細(xì)環(huán)病毒抗體膠體金快速診斷試紙。實(shí)施例2
一種豬2型細(xì)環(huán)病毒抗體膠體金快速診斷試紙，按照與實(shí)施例1相同的制備方法制備而成。其與實(shí)施例1 的區(qū)別在于:步驟4中)所采用的膠體金的pH值調(diào)整至10.0，經(jīng)透析處理的rTTSuV2 ORFr蛋白溶液與膠體金的混合比例為100 μ L/10mL。實(shí)施例3
一種豬2型細(xì)環(huán)病毒抗體膠體金快速診斷試紙，按照與實(shí)施例1相同的制備方法制備而成。其與實(shí)施例1的區(qū)別在于:步驟4中)所采用的膠體金的pH值調(diào)整至11.0，經(jīng)透析處理的rTTSuV2 ORFr蛋白溶液與膠體金的混合比例為150 μ L/10mL。實(shí)施例4
一種豬2型細(xì)環(huán)病毒抗體膠體金快速診斷試紙，按照與實(shí)施例1相同的制備方法制備而成。其與實(shí)施例1的區(qū)別在于:步驟4中)所采用的膠體金的pH值為10.0，經(jīng)透析處理的rTTSuV2 ORFr蛋白溶液與膠體金的混合比例為150yL/10mL。實(shí)施例5
一種豬2型細(xì)環(huán)病毒抗體膠體金快速診斷試紙，按照與實(shí)施例1相同的制備方法制備而成。其與實(shí)施例1的區(qū)別在于:步驟4中)所采用的膠體金的pH值調(diào)整至10.0，經(jīng)透析處理的rTTSuV2 ORFr蛋白溶液與膠體金的混合比例為200 μ L/10mL。實(shí)施例6
一種豬2型細(xì)環(huán)病毒抗體膠體金快速診斷試紙，按照與實(shí)施例1相同的制備方法制備而成。其與實(shí)施例1的區(qū)別在于:步驟4中)所采用的膠體金的pH值為10.0，經(jīng)透析處理的rTTSuV2 ORFr蛋白溶液與膠體金的混合比例為300 μ L/10mL。應(yīng)用實(shí)施例
紙條檢測(cè)結(jié)果的判讀，如圖2所示:
陽(yáng)性:在觀(guān)察孔內(nèi)，檢測(cè)線(xiàn)區(qū)(T)及對(duì)照線(xiàn)區(qū)(C)同時(shí)出現(xiàn)紫紅色線(xiàn)。細(xì)環(huán)病毒抗體滴度越高，檢測(cè)線(xiàn)(T)顏色越深。弱陽(yáng)性:在觀(guān)察孔內(nèi)，檢測(cè)線(xiàn)區(qū)(T)及對(duì)照線(xiàn)區(qū)(C)同時(shí)出現(xiàn)紫紅色線(xiàn)，但檢測(cè)線(xiàn)區(qū)(T)出現(xiàn)的顏色很淺。陰性:在觀(guān)察孔內(nèi)，只有對(duì)照線(xiàn)區(qū)(C)出現(xiàn)一條紫紅色線(xiàn)。失效:在觀(guān)察孔內(nèi)，對(duì)照線(xiàn)區(qū)(C)和檢測(cè)線(xiàn)區(qū)(T)都不出現(xiàn)紫紅色線(xiàn)；或僅檢測(cè)線(xiàn)區(qū)(T)出現(xiàn)紫紅色線(xiàn)。穩(wěn)定性測(cè)試:將本發(fā)明的診斷試紙密封后進(jìn)行37°C破壞試驗(yàn)，同時(shí)與4°C、室溫存放的試紙對(duì)比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)37°C破壞廣7 d后，試紙檢測(cè)的靈敏度、特異性、爬速、檢測(cè)背景等指標(biāo)與4°C和室溫存放的試紙條無(wú)明顯區(qū)別；37°C破壞8 12 d后，與4°C和室溫存放的試紙條相比，其檢測(cè)的靈敏度和特異性雖無(wú)明顯變化，但在爬速、金釋放速度和檢測(cè)背景等方面稍有下降。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)值，暫將此檢測(cè)試紙有效期定為I年。特異性測(cè)試:將等量的TTSUV2陽(yáng)性血清、豬繁殖與呼吸綜合征、流行性乙型腦炎、偽狂犬、傳染性胸膜肺炎(豬氣喘病)、豬萎縮性鼻炎及豬圓環(huán)病毒抗體陽(yáng)性血清樣本以及兔、牛、小白鼠和雞血清樣本用本發(fā)明的診斷試紙進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)試診斷紙條的特異性；檢測(cè)結(jié)果顯示本發(fā)明的診斷試紙豬繁殖與呼吸綜合征、流行性乙型腦炎、偽狂犬、傳染性胸膜肺炎(豬氣喘病)、豬萎縮性鼻炎及豬圓環(huán)病毒抗體陽(yáng)性血清樣本以及兔、牛、小白鼠和雞血清均無(wú)交叉反應(yīng)
敏感性測(cè)試:將TTSuV2陽(yáng)性血清分別用本發(fā)明的診斷試紙與TTSuV2抗體ELISA診斷試劑盒檢測(cè)對(duì)比，考核其敏感性，結(jié)果顯示:陽(yáng)性樣品稀釋800倍后試紙條T線(xiàn)仍有可辨的條帶。
上述實(shí)施方式僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，不能以此來(lái)限定本發(fā)明保護(hù)的范圍，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明的基礎(chǔ)上所做的任何非實(shí)質(zhì)性的變化及替換均屬于本發(fā)明所要求保護(hù)的范 圍。
權(quán)利要求
1.一種豬2型細(xì)環(huán)病毒抗體膠體金快速診斷試紙，其特征在于:其包括PVC底板、樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜及吸水濾紙，樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜及吸水濾紙按照層析方向依次設(shè)置在PVC底板上，并且樣品墊的一端疊在膠體金結(jié)合墊前端，膠體金結(jié)合墊的后端疊在硝酸纖維素膜的一端，吸水濾紙的前端疊在硝酸纖維素膜的另一端；所述硝酸纖維素膜上分別噴制有檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)，所述膠體金結(jié)合墊由一層硝酸纖維素膜和噴在該硝酸纖維素膜上的rTTSuV2 ORFr膠體金組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬2型細(xì)環(huán)病毒抗體膠體金快速診斷試紙，其特征在于所述的rTTSuV2 ORFr膠體金是通過(guò)以下方法制備而成: 1)TTSuV2ORFl蛋白序列分析與篩選:篩選出具有較強(qiáng)抗原的TTSuV2 0RF1’氨基序列SEQ ID NO:1 ； 2)TTSuV2ORFr的表達(dá)與純化:以步驟I)中的氨基序列所對(duì)應(yīng)的核酸序列為模板應(yīng)用Primer Premier5.0設(shè)計(jì)引物正向引物SEQ ID N0:2和反向引物SEQ ID N0:3，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增構(gòu)建插入TTSuV2 ORFr的pET21b重組質(zhì)粒，雙酶切PCR產(chǎn)物及載體，連接，轉(zhuǎn)化E.coli:DH5a后，獲取載體，提取重組質(zhì)粒pET21b_TTSuV2 0RF1’ ；再將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E.coliBL21，涂布于LA平板上，培養(yǎng)6-9小時(shí)后挑取單菌落，并將挑取的單菌落接種于LA液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2-5小時(shí)，加入的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)；3-8小時(shí)后，離心、收集菌體，最后，應(yīng)用切膠回收的方法回收蛋白，I XPBS透析后獲得TTSuV2 ORFr重組蛋白； 3)免疫膠體金制備:取質(zhì)量濃度為0.01%氯金酸水溶液并加熱至沸騰，滴加1%檸檬酸三鈉水溶液并不斷攪拌，在氯金酸水溶液由金黃色變?yōu)樽霞t色后繼續(xù)煮沸15 min，冷卻后以蒸餾水恢復(fù)至原體積，2-8°C保存待用； 4)rTTSuV20RF1’膠體金的制備:將TTSuV2 0RF1’重組蛋白溶液濃度至I mg/mL后轉(zhuǎn)入透析袋中，2-8°C下用濃度為20 mmol/L、pH值為7.0的Tris緩沖液透析過(guò)夜；之后在透析處理之后的rTTSuV2 0RF1’中加入等量的步驟3)中的膠體金中，2_8°C靜置并使rTTSuV2ORFr充分與膠體金結(jié)合，然后按每10 mL膠體金加2 mL質(zhì)量濃度為5% BSA溶液比例加入BSA溶液，充分混勻后離心0.5-1.5 h，棄上清液，膠體金沉淀用保護(hù)液再溶解，即制得rTTSuV2 ORFr免疫膠體金。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的豬2型細(xì)環(huán)病毒抗體膠體金快速診斷試紙，其特征在于:所述檢測(cè)線(xiàn)是將透析處理后的rTTSuV2 ORFr噴在硝酸纖維素膜而形成線(xiàn)，所述質(zhì)控線(xiàn)是TTSuV2強(qiáng)陽(yáng)性抗體在硝酸纖維素膜而形成線(xiàn)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬2型細(xì)環(huán)病毒抗體膠體金快速診斷試紙，其特征在于:步驟3)中膠體金的pH值為9-11。
5.一種如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的豬2型細(xì)環(huán)病毒抗體膠體金快速診斷試紙的制備方法，其特征在于其是按照以下步驟制備: 1)TTSuV20RF1’蛋白序列分析與篩選:用ProtScale生物軟件篩選出具有較強(qiáng)抗原的TTSuV2 0RF1，氨基序列 SEQ ID NO:1 ； 2)構(gòu)建TTSuV2ORFr重組蛋白:以步驟I)中的氨基序列所對(duì)應(yīng)的核酸序列為模板應(yīng)用Primer Premier5.0設(shè)計(jì)正向引物SEQ ID NO: 2和反向引物SEQ ID NO: 3，化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入E.Coli BL21感受態(tài)細(xì)胞中，篩選重組的TTSuV2 0RF1’拷貝子，獲得TTSuV2 ORFI’重組蛋白 rTTSuV2 0RF1，；3)膠體金制備:取質(zhì)量濃度為0.01%氯金酸水溶液并加熱至沸騰，滴加1%檸檬酸三鈉水溶液并不斷攪拌，在氯金酸水溶液由金黃色變?yōu)樽霞t色后繼續(xù)煮沸，冷卻后以蒸餾水恢復(fù)至原體積，2-8 °C保存待用； 4)免疫膠體金的制備:將TTSuV2ORF1’重組蛋白溶液濃度至I mg/mL轉(zhuǎn)入透析袋中，2_8°C下用濃度為20 mmol/L、pH值為7.0的Tris緩沖液透析過(guò)夜；之后在透析處理的rTTSuV2 0RF1’中按照rTTSuV2 0RF1’與膠體金的體積比為50-300 μ L/10mL的比例加入步驟3)中的膠體金，2-8°C靜置并使rTTSuV2 0RF1’充分與膠體金結(jié)合，然后按每10 mL膠體金加2 mL質(zhì)量濃度為5% BSA溶液比例加入BSA溶液，充分混勻后離心0.5-1.5 h，棄上清液，膠體金沉淀用保護(hù)液再溶解，即制得rTTSuV2 ORFr免疫膠體金； 5)膠體金試紙的組裝:將制備的rTTSuV20RF1’膠體金噴于硝酸纖維素膜上，真空冷凍干燥后形成膠體金結(jié)合墊；在硝酸纖維素膜上噴制檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)；然后將樣品墊、膠體金結(jié)合墊、噴制好檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)的硝酸纖維素膜及吸水紙組裝一起，即為豬2型細(xì)環(huán)病毒抗體膠體金快速診斷試紙。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的豬2型細(xì)環(huán)病毒抗體膠體金快速診斷試紙的制備方法，其特征在于獲得TTSuV2 ORFr重組蛋白rTTSuV2 0RF1’的方法是:以步驟I)中的氨基序列所對(duì)應(yīng)的核酸序列為模板應(yīng)用Primer Premier5.0設(shè)計(jì)引物正向引物SEQ ID N0:2和反向引物SEQ ID勵(lì):3，經(jīng)過(guò)？0 擴(kuò)增構(gòu)建插入11^1^2 0RF1’的pET21b重組質(zhì)粒，雙酶切PCR產(chǎn)物及載體，連接，轉(zhuǎn)化E.coli:DH5a后，獲取正確的載體，提取重組質(zhì)粒pET21b_TTSuV20RF1’;再將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E.coli BL21，涂布于LA平板上，培養(yǎng)6-9小時(shí)后挑取單菌落，并將挑取的單菌落接種于LA液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2-5小時(shí)，加入的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)；3-8小時(shí)后，離心、收集菌體，最后，應(yīng)用切膠回收的方法回收蛋白，IXPBS透析后獲得rTTSuV2 ORFI’。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的豬2型細(xì)環(huán)病毒抗體膠體金快速診斷試紙的制備方法，其特征在于步驟2) PCR擴(kuò)增的條件為94°C 45 S，55°C 45 S，72 V 90 S，共30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的豬2型細(xì)環(huán)病毒抗體膠體金快速診斷試紙的制備方法，其特征在于:步驟4)中所述的保護(hù)液為含有1%BSA，且pH=7.0，濃度為0.01 mo I/L Tris-HCl溶液。
9.根據(jù)權(quán)利要求6 -8任一項(xiàng)所述的豬2型細(xì)環(huán)病毒抗體膠體金快速診斷試紙的制備方法，其特征在于:步驟3)中還包括用0.1 mo I/L的K2CO3調(diào)節(jié)膠體金的pH值至9_11。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種豬2型細(xì)環(huán)病毒抗體膠體金快速診斷試紙及其制備方法。包括PVC底板、樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜及吸水濾紙，樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜及吸水濾紙按照層析方向依次設(shè)置在PVC底板上，并且樣品墊的一端疊在膠體金結(jié)合墊前端，膠體金結(jié)合墊的后端疊在硝酸纖維素膜的一端，吸水濾紙的前端疊在硝酸纖維素膜的另一端；所述硝酸纖維素膜上分別噴制有檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)，所述膠體金結(jié)合墊由一層硝酸纖維素膜和噴在該硝酸纖維素膜上的rTTSuV2ORF1’膠體金組成。本發(fā)明的豬2型細(xì)環(huán)病毒抗體膠體金快速診斷試紙，能夠快速TTSuV2抗體，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，使用方便，并具有良好的靈敏度和特異性。
文檔編號(hào)G01N33/569GK103245783SQ201310154128
公開(kāi)日2013年8月14日 申請(qǐng)日期2013年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月27日
發(fā)明者李中圣, 劉小琴, 羅均, 趙焱, 陳軼雯 申請(qǐng)人:廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院有限公司