吡蟲啉的免疫膠體金檢測卡及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及谷物食品中農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及吡蟲啉的免疫膠體金檢測卡及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]卩比蟲啉(imidacloprid),化學(xué)名稱1-(6_氯_3_卩比唆基甲基)-N-硝基亞咪唑烷-2-基胺。吡蟲啉具有廣譜殺蟲活性，對飛虱、蚜蟲、葉蟬等刺吸式口器害蟲有特效，對其他種類的害蟲也有良好的防治效果。吡蟲啉是蔬菜種植過程中常用的農(nóng)藥，對吡蟲啉殘留檢測成為國家對蔬菜類植物中農(nóng)藥殘留監(jiān)控的必要手段。日本規(guī)定吡蟲啉在蔬菜中的最高殘留限量(MRL)為0.5mg/kg。
[0003]現(xiàn)有技術(shù)對于吡蟲啉的檢測主要是高效液相色譜法等檢測方法，但這些技術(shù)的缺陷明顯:設(shè)備昂貴、操作復(fù)雜、難以推廣。所以，建立一種簡單、有效、適合基層使用的測定方法是極其必要的。本發(fā)明的目的是研制一種更適合企業(yè)進行現(xiàn)場檢測且快捷簡便、成本低廉的定性檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對以上情況，本發(fā)明的目的就是為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種吡蟲啉的免疫膠體金檢測卡及其制備方法，可有效解決能快速、簡便地檢測出吡蟲啉的問題。
[0005]本發(fā)明的吡蟲啉膠體金檢測卡，包括包被了單克隆抗體膠體金標(biāo)記物的膠體金結(jié)合墊、包被了吡蟲啉-BSA和羊抗鼠IgG的硝酸纖維素膜、樣品墊、吸水墊、PVC膠板和塑料模具組成，在PVC膠板的一端依次粘附樣品墊、結(jié)合墊，中間黏貼硝酸纖維素膜，另一端粘附吸水墊。
[0006]本發(fā)明的吡蟲啉膠體金檢測卡的制備方法，是由以下步驟實現(xiàn):
(1)膠體金溶液制備:取IL三角燒瓶I個,加入超純水495 mL，而后加入1%氯金酸(HAuCl4.3H20) 5 mL，配制成500 mL 0.01%氯金酸水溶液，加熱煮沸后在持續(xù)攪拌的情況下加入1%檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7.2H20)溶液5_7 mL，繼續(xù)攪拌加熱，當(dāng)溶液的顏色完全變?yōu)橥该鞯淖霞t色時，維持5 min后停止加熱，補水至原體積，冷卻至室溫，2-8°C保存?zhèn)溆茫?br> (2)抗體的預(yù)處理:將要標(biāo)記的卩比蟲啉抗體在1000r/min, 4°C條件下,離心20 min,取上清，用0.01 mol/L PBS稀釋成I mg/mL ;或者用0.01 mol/L PBS稀釋成I mg/ml,過
0.22 Pm 濾膜；
(3)膠體金標(biāo)記物的制備:取步驟⑴中的膠體金溶液40mL，用0.25 mol/L K2C03調(diào)節(jié)膠體金溶液pH至8.5,電磁攪拌器250 r/min攪拌,逐滴加入4 mL含0.3 mg抗體蛋白的蛋白溶液，反應(yīng)10 min;逐滴加入4 mL 10% BSA,繼續(xù)攪拌反應(yīng)10 min ;金標(biāo)抗體溶液常溫低速(1500 r/min)離心10 min,棄去由凝聚的金顆粒形成的沉淀；紅色上清溶液4°C,12000 r/min離心20 min,棄上清,收集沉淀,將沉淀用金標(biāo)抗體稀釋液定容至I mL,制備成吡蟲啉單克隆抗體膠體金標(biāo)記物； (4)膠體金膜的制備:將步驟(3)吡蟲啉蛋白質(zhì)偶聯(lián)物單克隆抗體膠體金標(biāo)記物用劃膜儀以5 PL/cm的濃度均勻噴在載體玻璃纖維素膜上，室溫自然晾干或者37°C烘干3 h，制成含吡蟲啉蛋白質(zhì)偶聯(lián)物單克隆抗體膠體金標(biāo)記物的膠體金膜；
(5)包被膜制備:將羊抗鼠IgG抗體、吡蟲啉蛋白質(zhì)偶聯(lián)物稀釋成Img/mL，用劃膜儀依次以I PL/cm的濃度噴涂在硝酸纖維素膜上,制備成包被膜,370C包被2 h后，室溫自然晾干或者37°C烘干；
(6)樣品墊前處理:將樣品墊處理液均勻涂布在玻璃纖維素膜上，在空氣濕度低于60%的條件下，室溫自然晾干；
(7)檢測卡的組裝:PVC膠板自上而下依次粘貼樣品墊、膠體金膜、包被膜和吸水棉，組裝成試紙條，切割成一定寬度的長條，再將試紙條安裝在長條扁平殼狀的檢測卡外殼中。
[0007]所述步驟(5)中所包被的檢測線T設(shè)在質(zhì)控線C的下方；
所述步驟(6)中的樣品墊處理液是由I g小牛血清蛋白(BSA)和0.8 g氯化鈉(NaCl),用含有 0.5%TRIT0N-100 的 0.01 mol/L PBS 定容至 100 mL ；
本發(fā)明可有效用于測定吡蟲啉，方法簡單，方便、快捷，結(jié)果準(zhǔn)確。
【附圖說明】
[0008]圖1為本發(fā)明吡蟲啉的免疫膠體金檢測卡的結(jié)構(gòu)圖:圖中1.加樣孔 2.檢測線
3.質(zhì)控線4.檢測孔5.試紙條6.檢測卡外殼。
[0009]圖2為本發(fā)明吡蟲啉的免疫膠體金檢測卡內(nèi)的試紙條的剖視結(jié)構(gòu)圖，圖中7.樣品墊8.膠體金結(jié)合墊9.PVC膠板10.硝酸纖維素膜11.吸水墊。
【具體實施方式】
[0010]實施例1
圖1、圖2所示的實施例:圖中9為PVC膠板；7為樣品墊；8為膠體金結(jié)合墊，該膠體金結(jié)合墊上包被了單克隆抗體膠體金標(biāo)記物；10為包被膜，即硝酸纖維素膜，該硝酸纖維素膜上包被了吡蟲啉-BSA和羊抗鼠IgG ；11為吸水墊，由吸水材料如濾紙制成。
[0011]在PVC膠板9的一端上(樣品端)粘附樣品墊7、結(jié)合墊8，樣品墊7和結(jié)合墊8為并排結(jié)構(gòu)。
[0012]在PVC膠板9的中間粘附硝酸纖維素膜10。在硝酸纖維素膜10上設(shè)置有羊抗鼠IgG質(zhì)控線3和吡蟲啉-BSA檢測線2。
[0013]在PVC膠板9的另一端粘附吸水墊11。硝酸纖維素膜10的一端與結(jié)合墊8略交叉，另一端與吸水墊11略交叉。該試紙條5可裝入有塑料模具制成的檢測卡外殼6中，制成檢測卡，在檢測卡外殼6的上蓋上設(shè)有加樣孔I和檢測孔4，樣品墊7正對加樣孔1，硝酸纖維素膜10正對檢測孔4。
[0014]實施例2
吡蟲啉膠體金檢測卡制備，是由以下步驟具體實現(xiàn):
膠體金溶液制備:取I L三角燒瓶I個,加入超純水495 mL，而后加入1%氯金酸(HAuCl4.3H20) 5 mL，配制成500 mL 0.01%氯金酸水溶液，加熱煮沸后在持續(xù)攪拌的情況下加入1%檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7.2H20)溶液5_7 mL，繼續(xù)攪拌加熱，當(dāng)溶液的顏色完全變?yōu)橥该鞯淖霞t色時，維持5 min后停止加熱，補水至原體積，冷卻至室溫，2-8°C保存?zhèn)溆?；抗體的預(yù)處理:將要標(biāo)記的卩比蟲啉抗體在1000 r/min, 4°C條件下,離心20 min,取上清，用 0.01 mol/L PBS 稀釋成 I mg/mL ;或者用 0.01 mol/L PBS 稀釋成 I mg/ml,過 0.22濾膜；
膠體金標(biāo)記物的制備:取步驟(I)中的膠體金溶液40 mL，用0.25 mol/L K2C03調(diào)節(jié)膠體金溶液pH至8.5,電磁攪拌器250 r/min攪拌,逐滴加入4 mL含0.3 mg抗體蛋白的蛋白溶液，反應(yīng)10 min;逐滴加入4 mL 10% BSA，繼續(xù)攪拌反應(yīng)10 min ;金標(biāo)抗體溶液常溫低速(1500 r/min)離心10 min,棄去由凝聚的金顆粒形成的沉淀；紅色上清溶液4°C, 12000r/min離心20 min,棄上清,收集沉淀,將沉淀用金標(biāo)抗體稀釋液定容至I mL,制備成卩比蟲啉單克隆抗體膠體金標(biāo)記物；
膠體金膜的制備:將步驟(3)吡蟲啉蛋白質(zhì)偶聯(lián)物單克隆抗體膠體金標(biāo)記物用劃膜儀以5 PL/cm的濃度均勻噴在載體玻璃纖維素膜上，室溫自然晾干或者37°C烘干3 h，制成含吡蟲啉蛋白質(zhì)偶聯(lián)物單克隆抗體膠體金標(biāo)記物的膠體金膜；
包被膜制備:將羊抗鼠IgG抗體、吡蟲啉蛋白質(zhì)偶聯(lián)物稀釋成I mg/mL，用劃膜儀依次以I KL/cm的濃度噴涂在硝酸纖維素膜上，制備成包被膜，37°C包被2 h后，室溫自然晾干或者37°C烘干；
樣品墊前處理:將樣品墊處理液均勻涂布在玻璃纖維素膜上，在空氣濕度低于60%的條件下，室溫自然晾干；
檢測卡的組裝:PVC膠板自上而下依次粘貼樣品墊、膠體金膜、包被膜和吸水棉，組裝成試紙條，切割成一定寬度長條，再將試紙條安裝在長條扁平殼狀的檢測卡外殼中。
【主權(quán)項】
1.吡蟲啉膠體金檢測卡，其特征在于按照下述步驟制備得到: (1)膠體金溶液制備:取IL三角燒瓶I個,加入超純水495 mL，而后加入1%氯金酸HAuCl4.3H20) 5 mL，配制成500 mL 0.01%氯金酸水溶液，加熱煮沸后在持續(xù)攪拌的情況下加入1%檸檬酸三鈉Na3C6H5O7.2H20溶液5_7 mL,繼續(xù)攪拌加熱，當(dāng)溶液的顏色完全變?yōu)橥该鞯淖霞t色時，維持5 min后停止加熱，補水至原體積，冷卻至室溫，2-8°C保存?zhèn)溆茫? (2)抗體的預(yù)處理:將要標(biāo)記的卩比蟲啉抗體在1000r/min, 4°C條件下,離心20 min,取上清，用 0.01 mol/L PBS稀釋成 I mg/mL ;或者用 0.01 mol/L PBS稀釋成 I mg/ml,過0.22 濾膜； (3)膠體金標(biāo)記物的制備:取步驟(I)中的膠體金溶液40mL，用0.25 mol/L K2CO3調(diào)節(jié)膠體金溶液pH至8.5,電磁攪拌器250 r/min攪拌,逐滴加入4 mL含0.3 mg抗體蛋白的蛋白溶液，反應(yīng)10 min;逐滴加入4 mL 10% BSA,繼續(xù)攪拌反應(yīng)10 min ;金標(biāo)抗體溶液常溫1500 r/min離心10 min,棄去由凝聚的金顆粒形成的沉淀；紅色上清溶液4°C, 12000 r/min離心20 min,棄上清,收集沉淀,將沉淀用金標(biāo)抗體稀釋液定容至I mL,制備成批蟲啉單克隆抗體膠體金標(biāo)記物； (4)膠體金膜的制備:將步驟(3)吡蟲啉蛋白質(zhì)偶聯(lián)物單克隆抗體膠體金標(biāo)記物用劃膜儀以5 PL/cm的濃度均勻噴在載體玻璃纖維素膜上，室溫自然晾干或者37°C烘干3 h，制成含吡蟲啉蛋白質(zhì)偶聯(lián)物單克隆抗體膠體金標(biāo)記物的膠體金膜； (5)包被膜制備:將羊抗鼠IgG抗體、吡蟲啉蛋白質(zhì)偶聯(lián)物稀釋成Img/mL，用劃膜儀依次以I PL/cm的濃度噴涂在硝酸纖維素膜上,制備成包被膜,370C包被2 h后，室溫自然晾干或者37°C烘干； (6)樣品墊前處理:將樣品墊處理液均勻涂布在玻璃纖維素膜上，在空氣濕度低于60%的條件下，室溫自然晾干； (7)檢測卡的組裝:PVC膠板自上而下依次粘貼樣品墊、膠體金膜、包被膜和吸水棉，組裝成試紙條，切割成一定寬度的長條，再將試紙條安裝在長條扁平殼狀的檢測卡外殼中。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的吡蟲啉膠體金檢測卡，其特征在于所述步驟(5)中所包被的檢測線T設(shè)在質(zhì)控線C的下方； 所述步驟(6)中的樣品墊處理液是由I g小牛血清蛋白(BSA)和0.8 g氯化鈉(NaCl),用含有 0.5%TRIT0N-100 的 0.01 mol/L PBS 定容至 100 mL。
【專利摘要】本發(fā)明吡蟲啉的免疫膠體金檢測卡及其制備方法，涉及動物源食品獸藥殘留檢測技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的檢測卡外殼中的試紙條，由PVC膠板、樣品墊、膠體金結(jié)合墊、包被膜和吸水墊組成；膠體金膜為含吡蟲啉單克隆抗體的玻璃纖維素膜，包被膜是硝酸纖維素膜，其上設(shè)有T線和C線，T線包被有吡蟲啉蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，C線包被有羊抗鼠IgG抗體。本發(fā)明有效用于快速檢測吡蟲啉，方便、快捷、結(jié)果準(zhǔn)確。
【IPC分類】G01N33/577
【公開號】CN105572372
【申請?zhí)枴緾N201410551751
【發(fā)明人】洪霞, 杜霞, 劉靜
【申請人】南京億特生物科技有限公司
【公開日】2016年5月11日
【申請日】2014年10月17日