一種用于莫能霉素快速檢測的酶聯(lián)免疫試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于獸藥殘留分析和免疫分析檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種莫能霉素的單克隆抗體制備及其酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。本發(fā)明的單克隆抗體是由申請人建立的雜交瘤細(xì)胞株C2F3C2所分泌。本發(fā)明公開了特異性單克隆抗體、包被原、免疫原的制備方法和酶聯(lián)免疫檢測方法。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明拓寬了現(xiàn)有技術(shù)的檢測對象，本發(fā)明的試劑盒和方法具有簡便、快速、靈敏、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，能同時檢測動物源食品，尤其是肉類產(chǎn)品中莫能霉素的殘留量。
【背景技術(shù)】
[0002]莫能菌素屬于抗生素類藥物，用于雞球蟲病和肉牛促生長，具有良好的抗球蟲活性。對陰性菌無作用；但對葡萄球菌、桿菌、梭菌、鏈球菌、霉菌(青霉菌、念珠菌)有一定的抑制作用。莫能霉素主要作用于球蟲早期。正常球蟲孢子體和裂殖體細(xì)胞內(nèi)鉀離子濃度高、鈉離子濃度低(細(xì)胞外相反)，細(xì)胞通過儲備能量進(jìn)行離子滲透壓平衡(外泵鈉，內(nèi)泵鉀)，以穩(wěn)定菌體內(nèi)環(huán)境。莫能菌素以干擾球蟲細(xì)胞內(nèi)鈉鉀離子的正常交換，使大量的鈉離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，造成鈉離子在胞內(nèi)濃度高，滲透壓上升，更多的水分進(jìn)入球蟲內(nèi)。為了排除細(xì)胞內(nèi)多余的鈉，球蟲必須動用能量將多余的鈉外泵排出，最終造成有限的能量被用完；而后鈉鉀離子交換中斷停止，細(xì)胞膨脹、變形、破裂、崩解。莫能菌素可以影響反芻動物瘤胃內(nèi)能量代謝，改善瘤胃發(fā)酵，提高丙酸與乙酸的產(chǎn)出比例，降低揮發(fā)性脂肪酸，減少甲烷生成，提高蛋白質(zhì)利用效率。因此能夠顯著提高反芻動物的飼料利用率和促進(jìn)生長的作用。但是該類藥物在動物源性食品的殘留會引起人體的不良反應(yīng)，它們的長期大量使用會使病菌產(chǎn)生耐藥性，還有潛在的致癌作用。因此它們在動物源性食品中的殘留直接威脅到人類身體健康。由于以上危害美國、歐盟和我國都嚴(yán)格規(guī)定了該類藥物的使用以及最大殘留限量。
[0003]目前，HPLC和LC/MS/MS是測定動物源性食品中殘留的主要手段，由于這類方法存在分析時間長、檢測所需樣品量大、及繁瑣的前處理步驟等不足，不適宜于測定大量樣品。與此相比，免疫學(xué)方法具有低成本、快速、無需復(fù)雜樣品前處理等特點(diǎn)，可作為一種高效的檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004](一)本發(fā)明要解決的技術(shù)問題
本發(fā)明目的在于提供一種結(jié)構(gòu)簡單、使用方便、價格便宜、便于攜帶、靈敏度高的用于動物源食品中莫能霉素殘留快速檢測的酶聯(lián)免疫試劑盒，并提供一種高效、準(zhǔn)確、靈敏、適合大量篩選的定量檢測方法。
[0005](二)本發(fā)明的技術(shù)方案
為解決所述問題，本發(fā)明綜合采用蛋白質(zhì)偶聯(lián)和生物化學(xué)制備等技術(shù)制備了單克隆抗體。將莫能霉素與載體蛋白偶聯(lián)制備成人工免疫抗原和包被抗原；用此人工免疫抗原免疫動物制備抗莫能霉素的單克隆抗體；將莫能霉素包被抗原包被吸附于固相載體上；將檢測用的試劑配置成可直接使用的試劑。使用時，將莫能霉素標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品加入莫能霉素抗體工作液，待測樣品中殘留的莫能霉素與固相載體上包被的莫能霉素抗原競爭莫能霉素單克隆抗體，再加入酶標(biāo)記二抗進(jìn)行酶活性放大作用，顯色后終止，測定樣品的吸光度值，該值與樣品中莫能霉素殘留呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣品中莫能霉素的含量。
[0006]本酶聯(lián)免疫檢測試劑盒由下列成分組成:
(1)包被了莫能霉素抗原的酶標(biāo)板
(2)莫能霉素抗體
(3)莫能霉素標(biāo)準(zhǔn)品
(4)標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
(5)酶標(biāo)二抗
(6)底物顯色液
(7)洗滌緩沖液
(8)終止液
其中包被了莫能霉素抗原的酶標(biāo)板有24孔、或48孔、或96孔。
[0007]其中，莫能霉素抗原及莫能霉素單克隆抗體的制備方法為:
(O莫能霉素抗原的合成
將載體蛋白(BSA)的羧基用乙二胺活化，再通過水溶性碳化二亞胺法(EDC)將莫能霉素與活化載體蛋白(BSA)的氨基相偶聯(lián)制備莫能霉素抗原。具體步驟見下圖。本發(fā)明合成的免疫原采用免疫電泳測定其純度為98.6%。
[0008](2)莫能霉素單克隆抗體制備
動物免疫程序:采用莫能霉素抗原為免疫原，免疫BALB/C小鼠，免疫劑量為50 μ g，首次免疫為含弗氏完全佐劑的免疫原，以后每隔四周，用含弗氏不完全佐劑的免疫原加強(qiáng)免疫，前后共四次，可以得到血液里含有莫能霉素抗原特異性抗體的小鼠；最后一次免疫后10天，采血，取脾細(xì)胞。
[0009]細(xì)胞融合與克隆化:取免疫BALB/C小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞雜交融合,制備雜交瘤細(xì)胞，采用間接競爭酶聯(lián)免疫方法測定細(xì)胞上清液，篩選陽性孔。利用有限稀釋法對陽性孔進(jìn)行克隆化，篩選能穩(wěn)定分泌莫能霉素類藥物單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
[0010]單克隆抗體的制備與純化:采用體內(nèi)誘生法，將BALB/C小鼠腹腔注入滅菌石蠟油，7-14天后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞，7-10天后采集腹水，經(jīng)硫酸銨鹽析純化，分裝待用，-20°C保存。
[0011]其中，本發(fā)明的試劑盒所用試劑的配制方法如下:
(1)莫能霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液配制:準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)莫能霉素Img，精確到0.00001 g，配成Iμ g/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液母液；使用時，用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液稀釋成所需的濃度(10-1000 ng/mL)；
(2)標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液為0.05 mol/L Tris-HCl, pH 8.0,0.9%NaCl 的緩沖液；
(3)包被緩沖液為0.1 mol/L 碳酸緩沖液，ρΗ7.8，含 0.05% NaN3,0.9% NaCl ；
(4)封閉液為0.05 mol/L Tris-HCl 溶液，ρΗ8.0，含0.5% BSA, 0.9% NaCl, 0.04% NaN3 ；
(5)洗滌緩沖液為0.05 mol/L Tris-HCl, pH 8.0,0.9% NaCl，0.04% Tween20 ；
(6)莫能霉素單克隆抗體工作液:將抗體用pH7.4,0.02 mol/L，含1%卵清蛋白的磷酸鹽緩沖液稀釋成蛋白濃度為0.1-1 ug/L使用； (7)酶標(biāo)二抗工作液:辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗；
(8)底物顯色液A液:過氧化氫或過氧化脲；
(9)底物顯色液B液:鄰苯二胺(OPD)或四甲基聯(lián)苯胺(TMB)；
(10)底物顯色液對硝基磷酸鹽緩沖液:pH8.1，含有MgCl2 0.01% 100 mmol/LTris-HCl ；
(11)終止液:2mol/L硫酸。
[0012]其中，酶標(biāo)板的包被方法為:包被抗原以合適濃度與包被緩沖液混合，添加于酶標(biāo)板中且置于室溫下反應(yīng)14 h。用洗滌緩沖液洗滌3次后，用封閉緩沖液在37°C進(jìn)行封閉(約I h)，去除孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。
[0013]本發(fā)明試劑盒的檢測原理和檢測方法:
將莫能霉素抗原偶聯(lián)物包被吸附于固相載體上，加入莫能霉素標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品，并加入莫能霉素抗體工作液，待測樣品中殘留的莫能霉素與固相載體上包被的莫能霉素抗原競爭莫能霉素單克隆抗體，洗滌去除游離的抗原抗體復(fù)合物，再加入酶標(biāo)記二抗進(jìn)行酶活性放大作用，顯色后終止，測定樣品的吸光度值，該值與樣品中莫能霉素殘留呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣品中莫能霉素的含量。
[0014](三)本發(fā)明的有益效果
本發(fā)明所制備的莫能霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒，具有簡便、快速、靈敏、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，可用于定性或定量檢測動物組織等樣品中莫能霉素的殘留量；其最低檢測限為0.01 ng/g，檢測時間僅需3小時。本方法平均回收率為97-121%,批內(nèi)誤差小于8%,批間誤差小于13%。
[0015]本發(fā)明的試劑盒采用高特異性的莫能霉素單克隆抗體，主要試劑以工作液形式提供，可以減少操作步驟，節(jié)省時間。
【具體實(shí)施方式】
[0016]實(shí)施例1試劑盒組分的制備 1、抗原的合成
a、取載體牛血清白蛋白(BSA)10 g溶于35 mL pH9.6碳酸鹽緩沖液中，加入1g乙二胺進(jìn)行活化；
b、取莫能霉素Ig溶于10 ml 0.5 M的氫氧化鈉溶液中；
C、取I g碳化二亞胺溶于5 ml純水,然后加到莫能霉素溶液中室溫攪拌反應(yīng)3小時；
d、將活化的載體蛋白BSA滴加到莫能霉素溶液中4°C攪拌反應(yīng)過夜；
e、將反應(yīng)完所獲得的人工抗原對0.1 M的PBS緩沖液透析5天，每天更換緩沖液4次；將獲得的純化的人工抗原經(jīng)超濾濃縮或凍干保存。
[0017]2、莫能霉素類藥物單克隆抗體制備
a、動物免疫程序:采用莫能霉素人工抗原為免疫原，免疫BALB/C小鼠，免疫