一種檢測(cè)毒死蜱的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別是檢測(cè)大米中毒死蜱的酶聯(lián)免疫試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]近些年來(lái)，科學(xué)家不斷發(fā)現(xiàn)一些來(lái)源于環(huán)境中的化學(xué)物質(zhì)能夠模擬內(nèi)分泌激素功能從而引起生物體內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂，稱其為環(huán)境激素或環(huán)境荷爾蒙。環(huán)境激素已成為繼臭氧層、地球氣候變暖之后全球的第三大環(huán)境問(wèn)題，成為環(huán)境科學(xué)研究領(lǐng)域中的熱門課題。美國(guó)環(huán)境保護(hù)局給出的環(huán)境激素的定義，是指一類干擾體內(nèi)與生物體的正常行為及與生殖、發(fā)育相關(guān)的正常激素的合成、貯存、分泌、體內(nèi)運(yùn)輸、結(jié)合及清除等過(guò)程的外源性化合物。
[0003]環(huán)境激素是環(huán)境中的激素類似物，它能通過(guò)與激素受體結(jié)合，干擾生物體正常的生理代謝、內(nèi)分泌和生殖機(jī)能，引起種種負(fù)面的生物學(xué)效應(yīng)。環(huán)境激素通過(guò)環(huán)境介質(zhì)和食物鏈進(jìn)入人體或動(dòng)物體內(nèi)，干擾其內(nèi)分泌系統(tǒng)和生殖功能系統(tǒng)，影響后代的生存和繁衍。因此安全問(wèn)題受到高度重視。國(guó)標(biāo)中規(guī)定小麥中最大殘留限量為0.5 mg/kg。
[0004]酶聯(lián)免疫吸附法是一種準(zhǔn)確、可靠、快速、特異的檢測(cè)方法，適合于大批樣品的快速篩選，近年來(lái)已廣泛應(yīng)用于食品安全檢測(cè)行業(yè)。本發(fā)明旨在建立一種檢測(cè)毒死蜱的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測(cè)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了克服色譜法的不足，本發(fā)明提供一種檢測(cè)毒死蜱的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測(cè)方法。該方法靈敏、準(zhǔn)確、快速，操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)，適用于大批樣品的快速檢測(cè)。
[0006]本發(fā)明檢測(cè)毒死蜱的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括酶標(biāo)板、毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)品、毒死蜱抗體工作液、毒死蜱酶標(biāo)二抗工作液、底物液A、底物液B、終止液、濃縮稀釋液和濃縮洗滌液。
[0007]本發(fā)明檢測(cè)毒死蜱的酶聯(lián)免疫試劑盒的制備，包括以下步驟:酶標(biāo)板的制備、毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)品的制備、毒死蜱抗體工作液的制備、毒死蜱酶標(biāo)二抗工作液的制備、底物液A的制備、底物液B的制備、終止液的制備、濃縮稀釋液的制備和濃縮洗滌液的制備。
[0008]其進(jìn)一步特征在于:所述的酶標(biāo)板經(jīng)由毒死蜱抗原包被制備，具體步驟是將毒死蜱半抗原與載體蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)得到包被抗原，用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸鹽(CBS)緩沖液作為包被液，將毒死蜱包被抗原稀釋成1:40000比例，100 μ L/孔，37°C避光孵育2 h，取出酶標(biāo)板甩掉板內(nèi)液體，加入經(jīng)稀釋的濃縮洗滌液300 μ L/孔，洗板2次，30 s/次，然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封閉液，150 μ L/孔，37°C放置1.5 h，甩掉封閉液直接拍干，拍干后的酶標(biāo)板放置恒溫間(25°C)晾干，抽檢合格后將酶標(biāo)板真空密封于4°C條件下保存。
[0009]毒死蝶標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為O mg/kg、0.lmg/kg、0.3 mg/kg、0.9 mg/kg、2.7 mg/kg、8.1 mg/kg。
[0010]所述毒死蜱抗體工作液是采用毒死蜱人工抗原免疫小鼠得到單克隆抗體，用抗體稀釋液稀釋成1:60000比例制備。
[0011]所述毒死蜱酶標(biāo)二抗工作液由酶標(biāo)二抗加稀釋液稀釋成1:2000比例，所述底物液A為含有0.5 mmol/L的過(guò)氧化氣脲的梓檬酸-磷酸氣二鈉緩沖溶液，所述底物液B為四甲基聯(lián)苯二胺的乙醇溶液，所述終止液為2 mol/L的硫酸，所述濃縮稀釋液是10倍濃縮稀釋液，為0.1 mol/L的PBS，pH值范圍7.0-7.5之間，所述濃縮洗滌液是10倍濃縮洗滌液，為含 0.5% 吐溫-20，0.1 mol/L 的 PBST，pH 值范圍 7.0-7.5 之間。
[0012]檢測(cè)毒死蜱的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測(cè)方法，基于抗原抗體的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫反應(yīng)原理，該方法包括以下步驟:
(1)預(yù)處理待測(cè)樣品，即將待測(cè)試的樣品處理為液體樣品，或者用有機(jī)溶劑提取待測(cè)樣品，并將其復(fù)溶于樣品稀釋液中；
(2)將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫(20?25°C)平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻；
(3)取包被有毒死蜱抗原的酶標(biāo)板，加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50μ L/孔到對(duì)應(yīng)的微孔中，加入毒死蜱酶標(biāo)二抗工作液，50 μ L/孔，然后加入毒死蜱抗體工作液，50 μ L/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫25 °C避光環(huán)境中反應(yīng)30 min ；
(4)小心揭開(kāi)蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液260μ L/孔，充分洗滌4~5次，每次間隔10 S，用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過(guò)的槍頭戳破)；
(5)加入底物液A50 μ L/孔，底物液B 50 μ L/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25°C避光環(huán)境中反應(yīng)15?20 min ；
(6)加入終止液50μ L/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450 nm處或雙波長(zhǎng)450/630nm檢測(cè)，測(cè)定每孔吸光度值(請(qǐng)?jiān)? min內(nèi)讀完數(shù)據(jù))；
(7)以的標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ppb)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中毒死蜱的含量。
[0013]其中，所述待測(cè)樣品用以下方法進(jìn)行預(yù)處理:
a.研磨代表性樣品(使50%的樣品可以通過(guò)一個(gè)20目的濾網(wǎng))；
b.稱量5g研磨過(guò)濾后的樣品加入50 mL離心管中，加入3 g氯化鈉，10 mL水和20mL正己烷-丙酮溶液(體積比為2:1);
c.在密封的容器里混合，震蕩渦旋Imin;
d.室溫離心4000r/min以上，1min;取離心后的上清液或過(guò)濾后的濾液I mL，50 ~60
°C水浴氮?dú)獯蹈桑?br> e.加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液ImL并充分混勻,4000 r/min離心5 min或用定量分析濾紙過(guò)濾，取離心后的上清或過(guò)濾后的濾液進(jìn)行分析。
[0014]本發(fā)明檢測(cè)毒死蜱的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測(cè)方法的測(cè)定原理:樣品中的毒死蜱與酶標(biāo)板上固定的抗原特異性競(jìng)爭(zhēng)抗體，加入酶標(biāo)二抗，與抗體反應(yīng)，通過(guò)酶催化顯色劑顯色，根據(jù)顯色的深淺來(lái)判斷樣品中毒死蜱的含量。如果樣品中的毒死蜱含量少，顯色深；反之，則顯色淺。本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)靈敏、準(zhǔn)確、快速，適用于大批量樣品的快速檢測(cè)。
【具體實(shí)施方式】
[0015]毒死蜱蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的制備:
采用琥珀酸酐法得到帶羧基的毒死蜱半抗原衍生物，之后取0.05 mmol與載體蛋白BSA按10:1的結(jié)合比混合在0.05 mol/L pH 9.6的碳酸鹽緩沖液(CBS)中，然后加入0.15mmol碳二亞胺,攪拌置室溫反應(yīng)24 h,最后于0.2 mol/L pH 7.6的PBS緩沖液中透析兩天，除去未反應(yīng)的半抗原，將得到的蛋白質(zhì)偶聯(lián)物溶液于_20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0016]毒死蜱抗體的制備:
選用健康成年純種BALA/C小鼠，取與蛋白質(zhì)偶聯(lián)制備的免疫抗原50μ g與等量完全弗氏佐劑混合采用腹腔注射進(jìn)行初次免疫，之后每隔3周用相同劑量免疫抗原加等量不完全弗氏佐劑采用腹腔注射進(jìn)行二次、三次免疫，每次免疫6天后尾靜脈采血測(cè)定抗血清效價(jià)至一定滴度后，用相同劑量不加佐劑進(jìn)行末次免疫，3天后取脾制備脾細(xì)胞懸浮液與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，篩選出所需要的雜交瘤細(xì)胞系進(jìn)行克隆化，選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行凍存，用于腹水制備，先腹腔注射0.5 ml液體石蠟于BALB/C鼠致敏，2周后腹腔注射IXlO6個(gè)雜交瘤細(xì)胞，接種細(xì)胞7-10天后可產(chǎn)生腹水，待腹水盡可能多時(shí)用注射器抽取腹水，反復(fù)收集數(shù)次，4000 rpm離心15 min,收集上清，采用辛酸-硫酸銨法純化腹水對(duì)單克隆抗體進(jìn)行純化，冷凍干燥得凍干粉后于-20 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0017]制備包被有毒死蜱包被抗原的酶標(biāo)板:
包被抗原是將毒死蜱半抗原與載體蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)得到的，用0.05mol/L pH 9.6的碳酸鹽(CBS)緩沖液作為包被液，將毒死蜱抗原稀釋成1:40000比例，100?/孔，37 °C放置2 h，取出酶標(biāo)板甩掉板內(nèi)液體，用稀釋后的濃縮洗滌液300 μ?/孔，洗板2次，30 s/次，然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封閉，150 μ?7孔，37°C放置1.5 h，棄去封閉液，拍干后的酶標(biāo)板放置恒溫間(25°C)晾干，抽檢合格后將酶標(biāo)板真空密封后置4°C下保存。
[0018]毒死蝶標(biāo)準(zhǔn)品配制濃度分別為O mg/kg、0.lmg/kg、0.3 mg/kg、0.9 mg/kg、2.7 mg/kg、8.1 mg/kg。
[0019]毒死蜱抗體工作