一種甲拌磷殘留的酶聯(lián)免疫檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及藥物領(lǐng)域中一種診斷方法，具體涉及一種甲拌磷殘留的酶聯(lián)免疫檢測 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 甲拌磷[phorate，0, 0-二乙基-S-(乙硫基甲基）二硫化磷酸酯]是有機(jī)磷類的 高效廣譜的內(nèi)吸性殺蟲殺螨劑，具有觸殺、胃毒、熏蒸作用，高毒，主要用于防治棉花，甜菜， 小麥，高粱和油菜上的害蟲，只用于拌種。甲拌磷進(jìn)入植物體后，受植物代謝的影響而轉(zhuǎn)化 為毒性更大的氧化物（亞砜，砜），昆蟲取食后體內(nèi)神經(jīng)組織中的乙酰膽堿酯酶的活性受到 抑制，從而破壞了正常的神經(jīng)沖動(dòng)傳導(dǎo)，而導(dǎo)致中毒，直至死亡。并有較長的殘效期（約1~ 2個(gè)月，甚至更長），對人類的健康存在著潛在的威脅。世界糧農(nóng)組織（FAO)規(guī)定甲拌磷的 最1?殘留限量：在糧食作物中不允許存在殘留，在棉花中應(yīng)小于〇. 〇5mg/g，蔬菜殘留不得 檢出。但是由于其殺蟲作用好，目前在蔬菜，糧食等上存在不合理使用的現(xiàn)象比較嚴(yán)重。對 公眾健康具有較大危害。另外甲拌磷在土壤中不易降解，極易污染土壤和水源，容易造成環(huán) 境污染。因此除加強(qiáng)甲拌磷的使用管理，從源頭控制的同時(shí)，還應(yīng)加強(qiáng)對其在農(nóng)產(chǎn)品，土壤， 水源等方面的檢測盒監(jiān)管，防止其進(jìn)入食物鏈。
[0003]目前，有關(guān)甲拌磷殘留量的分析多采用氣相色譜法（GC)和液相色譜法（Pauland Zavitsanosetal，2002)。由于常規(guī)儀器分析方法前處理步驟復(fù)雜，費(fèi)時(shí)費(fèi)力、設(shè)備昂貴， 檢測費(fèi)用高，需要專業(yè)人員操作，不適宜大量樣品和現(xiàn)場快速檢測。對于待檢樣品量、特別 是現(xiàn)場快速檢測樣品量的迅速增加，開發(fā)和應(yīng)用可靠、靈敏、快速、實(shí)用的殘留分析新技 術(shù)，成為監(jiān)測和控制殘留、保證食用農(nóng)產(chǎn)品安全和避免國際間貿(mào)易爭端的重要前提。而酶聯(lián) 免疫分析（ELISA)快速檢測技術(shù)因其成本低，速度快，一次檢測樣本量大，儀器化程度低， 現(xiàn)已成為常用的檢測方法，因此開發(fā)甲拌磷特異，靈敏，且適用于現(xiàn)場大批量樣本快速篩選 的酶聯(lián)免疫方法具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種甲拌磷殘留的酶聯(lián)免疫檢測方法，該方法能夠現(xiàn)場大量 快速檢測土壤、水、農(nóng)產(chǎn)品等樣品中殘留的甲拌磷，該方法靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度高，該酶 聯(lián)免疫檢測方法用包被抗原預(yù)包被酶標(biāo)板，節(jié)約了甲拌磷抗體的用量，而且克服了直接包 被抗體不利于試劑盒長期保存的問題。
[0005] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：
[0006] -種甲拌磷殘留的酶聯(lián)免疫檢測方法，所述酶聯(lián)免疫檢測方法包括以下步驟：
[0007] ①合成甲拌磷半抗原，包括甲拌磷半抗原前體的合成和甲拌磷半抗原的合成；
[0008] ②并用步驟①中所述的甲拌磷半抗原合成甲拌磷完全抗原，所述甲拌磷完全抗原 包括甲拌磷免疫抗原和甲拌磷包被抗原；所述甲拌磷免疫抗原是用N，N' -二環(huán)己基碳二亞 胺法將所述甲拌磷半抗原與牛血清白蛋白（BSA)共價(jià)偶聯(lián)所得，所述甲拌磷包被抗原是用 N，N' -二環(huán)己基碳二亞胺法將所述甲拌磷半抗原與雞卵清白蛋白（OVA)共價(jià)偶聯(lián)所得；
[0009] ③制備甲拌磷多克隆抗體：a.將步驟②中所述的甲拌磷免疫抗原與弗氏佐劑充 分混合，形成油包水的結(jié)構(gòu)為止；b.將步驟a中形成油包水的結(jié)構(gòu)后立即對免疫動(dòng)物進(jìn)行 免疫注射，免疫注射的次數(shù)為4~7次；c.測定血清中抗甲拌磷抗體效價(jià)；d.用辛酸-硫酸 銨法進(jìn)行純化，得到對甲拌磷具有特異性反應(yīng)的所述甲拌磷多克隆抗體；
[0010] ④酶標(biāo)抗原的制備：采用混合酸酐法將羊抗兔或羊抗鼠與辣根過氧化物酶共價(jià)偶 聯(lián)制得所述酶標(biāo)抗原；
[0011] ⑤用步驟②中所述的甲拌磷包被抗原包被酶標(biāo)板，洗滌去除游離物并封閉，所述 酶標(biāo)板96孔或48孔的聚苯乙烯微孔板；所述封閉采用封閉液進(jìn)行進(jìn)行封閉，所述封閉液為 非牛源血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液溶液；
[0012] ⑥準(zhǔn)備洗滌液、底物顯色液、反應(yīng)終止液、磷酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液以及封閉 液；
[0013] ⑦在步驟⑤中所述的酶標(biāo)板的微孔條中加入甲拌磷標(biāo)樣或待測樣品和所述的甲 拌磷多克隆抗體，反應(yīng)60~70分鐘后，倒出微孔條中的液體，用所述洗滌液進(jìn)行洗滌；再加 入步驟③所述的酶標(biāo)抗原，反應(yīng)60~70分鐘后，倒出微孔條中的液體，用所述洗滌液進(jìn)行 洗滌；加入所述的底物顯色液，反應(yīng)30min，再加入所述的反應(yīng)終止液，測定OD值。
[0014] 進(jìn)一步地，所述甲拌磷免疫抗原和甲拌磷包被抗原通過紫外吸收光譜法進(jìn)行鑒 定。
[0015] 進(jìn)一步地，所述甲拌磷半抗原前體的合成方法為：①在反應(yīng)瓶中加11.IgP5S2，逐 滴滴入無水乙醇9. 66g，在75~85°C下，攪拌，溶液呈淡黃色后，停止反應(yīng)，得到硫化物；② 反應(yīng)瓶中加入步驟①中所得的硫化物，在室溫條件下，滴加IOg30%甲醛水溶液，磁力攪拌 20min后，加入7.9g2-巰基乙醇在60°C反應(yīng)5h，柱色譜層析，得到所述甲拌磷半抗原前體， 該甲拌磷半抗原前體具有特征基團(tuán)羥基，其合成路線如下。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種甲拌磷殘留的酶聯(lián)免疫檢測方法，其特征在于：所述酶聯(lián)免疫檢測方法包括以 下步驟： ① 合成甲拌磷半抗原，包括甲拌磷半抗原前體的合成和甲拌磷半抗原的合成； ② 并用步驟①中所述的甲拌磷半抗原合成甲拌磷完全抗原，所述甲拌磷完全抗原包括 甲拌磷免疫抗原和甲拌磷包被抗原；所述甲拌磷免疫抗原是用N，N'_二環(huán)己基碳二亞胺法 將所述甲拌磷半抗原與牛血清白蛋白共價(jià)偶聯(lián)所得，所述甲拌磷包被抗原是用Ν，Ν' -二環(huán) 己基碳二亞胺法將所述甲拌磷半抗原與雞卵清白蛋白共價(jià)偶聯(lián)所得； ③ 制備甲拌磷多克隆抗體：a.將步驟②中所述的甲拌磷免疫抗原與弗氏佐劑充分混 合，形成油包水的結(jié)構(gòu)為止；b.將步驟a中形成油包水的結(jié)構(gòu)后立即對免疫動(dòng)物進(jìn)行免疫 注射，免疫注射的次數(shù)為4~7次；c.測定血清中抗甲拌磷抗體效價(jià)；d.用辛酸-硫酸銨法 進(jìn)行純化，得到對甲拌磷具有特異性反應(yīng)的所述甲拌磷多克隆抗體； ④ 酶標(biāo)抗原的制備：采用混合酸酐法將羊抗兔或羊抗鼠與辣根過氧化物酶共價(jià)偶聯(lián)制 得所述酶標(biāo)抗原； ⑤ 用步驟②中所述的甲拌磷包被抗原包被酶標(biāo)板，洗滌去除游離物并封閉，所述酶標(biāo) 板96孔或48孔的聚苯乙烯微孔板；所述封閉采用封閉液進(jìn)行進(jìn)行封閉，所述封閉液為非牛 源血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液溶液； ⑥ 準(zhǔn)備洗滌液、底物顯色液、反應(yīng)終止液、磷酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液以及封閉液； ⑦ 在步驟⑤中所述的酶標(biāo)板的微孔條中加入甲拌磷標(biāo)樣或待測樣品和所述的甲拌磷 多克隆抗體，反應(yīng)60~70分鐘后，倒出微孔條中的液體，用所述洗滌液進(jìn)行洗滌；再加入步 驟③所述的酶標(biāo)抗原，反應(yīng)60~70分鐘后，倒出微孔條中的液體，用所述洗滌液進(jìn)行洗滌； 加入所述的底物顯色液，反應(yīng)30min，再加入所述的反應(yīng)終止液，測定OD值。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲拌磷殘留的酶聯(lián)免疫檢測方法，其特征在于：所述甲拌磷 免疫抗原和甲拌磷包被抗原通過紫外吸收光譜法進(jìn)行鑒定。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲拌磷殘留的酶聯(lián)免疫檢測方法，其特征在于：所述甲拌磷 半抗原前體的合成方法為：①在反應(yīng)瓶中加11. Ig P5S2，逐滴滴入無水乙醇9. 66g，在75~ 85°C下，攪拌，溶液呈淡黃色后，停止反應(yīng)，得到硫化物；②反應(yīng)瓶中加入步驟①中所得的硫 化物，在室溫條件下，滴加 IOg 30%甲醛水溶液，磁力攪拌20min后，加入7. 9g 2-巰基乙醇 在60°C反應(yīng)5h，柱色譜層析，得到所述甲拌磷半抗原前體，該甲拌磷半抗原前體具有特征 基團(tuán)羥基，其合成路線如下。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲拌磷殘留的酶聯(lián)免疫檢測方法，其特征在于：所述甲拌磷 半抗原的合成方法為：在反應(yīng)瓶中加入所述甲拌磷半抗原前體與丁二酸酐，以4-二甲氨基 吡啶作為催化劑進(jìn)行反應(yīng)，得所述甲拌磷半抗原，該甲拌磷半抗原上的羧基能夠與蛋白質(zhì) 共價(jià)偶聯(lián)，其合成路線如下。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲拌磷殘留的酶聯(lián)免疫檢測方法，其特征在于：步驟②中所 述免疫動(dòng)物為兔、羊、狗或鼠。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的甲拌磷殘留的酶聯(lián)免疫檢測方法，其特征在于：所述免疫動(dòng) 物為雄性新西蘭大白兔。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲拌磷殘留的酶聯(lián)免疫檢測方法，其特征在于：所述甲拌磷 多克隆抗體能夠用甲拌磷單克隆抗體或甲拌磷基因工程抗體中的一種代替。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的甲拌磷殘留的酶聯(lián)免疫檢測方法，其特征在于：所述甲拌磷 單克隆抗體的制備方法：a.用所述甲拌磷免疫抗原免疫小鼠，得血液里含有甲拌磷的鼠的 細(xì)胞；b.將鼠的細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選陽性孔，并對所述陽性孔進(jìn)行克隆化，得到單 克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；c.采用體內(nèi)誘生法，得到所述的甲拌磷單克隆抗體。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的甲拌磷殘留的酶聯(lián)免疫檢測方法，其特征在于：所述甲拌磷 基因工程抗體是將甲拌磷免疫抗原免疫小鼠，提取小鼠脾細(xì)胞RNA，以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 為模板，PCR擴(kuò)增抗體，將抗體中的輕鏈、重鏈連接成ScFv酶切經(jīng)PCR擴(kuò)增的ScFv片段，并 與噬菌體載體連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)，純化，得到所述甲拌磷基因工程抗體。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲拌磷殘留的酶聯(lián)免疫檢測方法，其特征在于：步驟⑥中所 述的操作過程是在37°C下進(jìn)行反應(yīng)的。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種甲拌磷殘留的酶聯(lián)免疫檢測方法，所述酶聯(lián)免疫檢測方法包括以下步驟：①合成甲拌磷半抗原；②合成甲拌磷完全抗原，甲拌磷完全抗原包括甲拌磷免疫抗原和甲拌磷包被抗原；③制備甲拌磷多克隆抗體；④酶標(biāo)抗原的制備；⑤用甲拌磷包被抗原包被酶標(biāo)板；⑥相關(guān)溶液的配制；⑦檢測。該甲拌磷的酶聯(lián)免疫檢測方法能夠現(xiàn)場大量快速檢測土壤、水、農(nóng)產(chǎn)品等樣品中殘留的甲拌磷，該方法靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度高，該酶聯(lián)免疫檢測方法用包被抗原預(yù)包被酶標(biāo)板，節(jié)約了甲拌磷抗體的用量，而且克服了直接包被抗體不利于試劑盒長期保存的問題。
【IPC分類】G01N33-577, G01N33-531
【公開號】CN104764880
【申請?zhí)枴緾N201410007117
【發(fā)明人】魏松紅, 紀(jì)明山, 馬曉寧
【申請人】馬曉寧, 紀(jì)明山, 魏松紅
【公開日】2015年7月8日
【申請日】2014年1月8日