一種檢測動物源食品中甲巰咪唑殘留的酶聯(lián)免疫試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)，具體涉及一種檢測甲琉咪哇的酶聯(lián)免疫試劑盒， 其特別適用于動物源食品中甲琉咪哇殘留的檢測。 技術(shù)背景
[0002] 甲琉咪哇是甲亢的常用治療藥物，能改變動物體內(nèi)的內(nèi)分泌，動物在飼用含甲琉 咪哇的飼料后，在尿液、雞肉和組織中會有不同程度的殘留，歐盟等國家已明確將其列入動 物園食品中禁用藥物。目前，激素類物質(zhì)已被大部分國家禁止在養(yǎng)殖業(yè)中使用，并不得在食 品中檢出。但國內(nèi)對畜產(chǎn)品中甲琉咪哇等違禁藥物殘留的檢測幾乎是空白，根據(jù)我國對動 物源產(chǎn)品殘留監(jiān)控規(guī)定及有關(guān)進(jìn)口國的要求，研究各種檢測方法已成為當(dāng)務(wù)之急。
[0003] 目前，檢測甲琉咪哇殘留量的方法主要是高效液相色譜法（HPLC)，由于復(fù)雜的儀 器設(shè)備和繁瑣的過程W及對檢驗人員的高技能要求，不適合現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本的篩查。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于針對上述不足提供一種用于動物源食品中甲琉咪哇殘留檢測 酶聯(lián)免疫試劑盒，其操作簡單適合現(xiàn)場大批量樣品的篩選。
[0005] 本發(fā)明試劑盒，它含有： (1) 包被有包被原的酶標(biāo)板（包被原為抗原、抗體或抗抗體）； (2) 酶標(biāo)記物（為酶標(biāo)記半抗原、酶標(biāo)記抗體或酶標(biāo)記抗抗體）； (3) 甲琉咪哇抗體工作液（當(dāng)酶標(biāo)板上包被抗原且酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗抗體或酶標(biāo)板 上包被抗抗體且酶標(biāo)記物為酶標(biāo)抗原時含有）； (4) 甲琉咪哇標(biāo)準(zhǔn)品溶液； (5) 底物顯色液； (6) 終止液； (7) 濃縮洗涂液； (8) 濃縮復(fù)溶液； 本發(fā)明提供的檢測甲琉咪哇殘留量的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括甲琉咪哇特異性抗體工作 液及預(yù)包被包被原的酶標(biāo)板和酶標(biāo)記物工作液，所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記的抗抗體，酶標(biāo)記 甲琉咪哇半抗原或酶標(biāo)記甲琉咪哇特異性抗體；所述抗抗體為羊抗鼠抗抗體或羊抗兔抗抗 體。
[0006] 所述酶標(biāo)記物的標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶，酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體是采用混合 酸酢或碳化二亞胺法將標(biāo)記酶與抗抗體進(jìn)行偶聯(lián)得到的。
[0007] 所述甲琉咪哇特異性抗體為甲琉咪哇單克隆抗體，他們均是用甲琉咪哇半抗原與 載體蛋白采用混合酸酢法得到的偶聯(lián)物作為免疫原得到的，所述甲琉咪哇單克隆抗體優(yōu)選 甲琉咪哇鼠單克隆抗體。
[0008] 為了更方便現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本篩查，所述試劑盒還包括甲琉咪哇標(biāo)準(zhǔn)品溶液、 顯色劑、終止液、濃縮洗涂液、濃縮復(fù)溶液。
[000引所述洗涂液優(yōu)選濃縮洗涂液為抑7.廣17. 7,含有0. 8%~1. 2%吐溫80和 0. 03^10. 05%硫柳隸防腐劑，0. 02^10. 04mol/L磯酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體積百分 比。
[0010] 當(dāng)酶標(biāo)記物的標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶，底物顯色液A為過氧化氨或過氧化脈， 底物顯色液B為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺，終止液為廣2mol/L硫酸或鹽酸緩沖液； 所述復(fù)溶液為含有0.08~10. 12%吐溫20、3~18%卵清蛋白、0.2~0.5mol/L磯酸鹽緩沖 液，所述百分比為重量體積百分比。 本發(fā)明中酶標(biāo)板的制備過程為用緩沖液將包被原稀釋成0. 2^0. 3 μ g/ml，每孔加入 100 μ L 37°C溫育化或4°C過夜，傾去包被液，用稀釋后的洗涂液洗涂兩次，每次30s，拍干， 然后在每孔中加入150~200 μ L封閉液，37°C溫育廣化，傾去孔內(nèi)液體拍干，干燥后用鉛膜 真空密封保存。
[0011] 本發(fā)明中抗原的合成過程： 1. 半抗原的合成 甲琉咪哇半抗原是將孕麗和玻巧酸酢通過反應(yīng)得到的 2. 甲琉咪哇抗體的制備 將甲琉咪哇半抗原與載體蛋白采用碳化二亞胺法進(jìn)行偶聯(lián)得到免疫原 本發(fā)明所述試劑盒中甲琉咪哇標(biāo)準(zhǔn)品溶液；標(biāo)注品溶液6瓶，為0 μ g/l，0. 3 μ g/l， 0. 9 μ g/L, 2. 7 μ g/L, 8. 1 μ g/L, 24. 3 μ g/L〇
[0012] 本發(fā)明的檢測原理為： 當(dāng)在微孔條上預(yù)包被甲琉咪哇抗原時，加入樣本溶液或標(biāo)準(zhǔn)品溶液后，隨即加入酶標(biāo) 二抗，再加入甲琉咪哇特異性抗體溶液，樣本中殘留的甲琉咪哇與酶標(biāo)板上包被的甲琉咪 哇抗原競爭孕麗特異性抗體，酶標(biāo)記抗抗體進(jìn)行放大作用，用顯色液顯色，樣本吸光值與甲 琉咪哇的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較可粗略判斷樣品中甲琉咪哇殘留量的濃度范圍。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種應(yīng)用上述酶聯(lián)免疫試劑盒檢測動物源食品中甲琉咪哇殘留 的方法，它包括步驟： (1) 樣品前處理； (2) 用試劑盒進(jìn)行檢測； (3) 分析檢測結(jié)果。
[0014] 樣本前處理主要是為了從樣本中獲得甲琉咪哇溶液，從而用于后續(xù)的檢測。樣本 前處理的方法： 稱取2. 0+(-)0. 5牛肉至50ml聚苯己帰離必管中，加入5~8ml己酸己醋，振蕩器振蕩 10min，3000r W上離必5min，取上清液廣3ml，至10ml干凈的玻璃試管中，于50~6(TC水浴 氮?dú)饬飨麓蹈?，加入廣3ml樣本復(fù)溶液，用潤旋儀潤旋Imin，取50 μ 1用于分析。
[0015] 本發(fā)明中用試劑盒檢測時，當(dāng)包被原為甲琉咪哇抗原時，向酶標(biāo)板微孔中加入標(biāo) 準(zhǔn)品溶液或樣本溶液，隨即加入酶標(biāo)二抗，再加入抗體工作液，溫育后洗涂拍干，顯色，終 止，用酶標(biāo)儀測定吸光度值。本發(fā)明中的結(jié)果分析過程為：用所獲得的每個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶 液的吸光度平均值度）除W第一個標(biāo)準(zhǔn)品溶液（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值度0)再乘W 100%，即 百分吸光度值，計算公式為： 百分吸光度值餅)=度/B0)X100% W甲琉咪哇標(biāo)準(zhǔn)品的濃度（μ g/L)的半對數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn) 曲線圖，用同樣的辦法計算樣品中的百分吸光度值，相對應(yīng)的每個樣品的濃度則可從標(biāo)準(zhǔn) 曲線上讀出樣本中甲琉咪哇的殘留量。
[0016] 本發(fā)明中檢測結(jié)果的分析也可W采用回歸方程法，計算出樣品溶液的濃度。
[0017] 本發(fā)明中檢測結(jié)果的分析還可W利用計算機(jī)軟件，此法更便于大量樣品的快速分 析，整個檢測過程只需不足比可W完成。
[0018] 本發(fā)明檢測動物源食品中甲琉咪哇殘留的酶聯(lián)免疫試劑盒主要采用間接競爭 ELISA方法定性或定量檢測出樣品中的甲琉咪哇的殘留量，對樣品前處理要求低，樣品前處 理過程簡單，能同時快速檢測出大批量樣品，主要試劑W工作液的形式提供，檢驗方法方便 易行，具有特異性高，靈敏度高，精確度高，準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)。本發(fā)明的酶聯(lián)免疫試劑盒結(jié)構(gòu) 簡單，使用方便，攜帶便利，檢測方法高效準(zhǔn)確，適于大批量樣品篩選檢測。本發(fā)明的試劑盒 將在甲琉咪哇殘留的檢測中發(fā)揮重要作用。
【附圖說明】
[0019] 圖1甲琉咪哇化學(xué)結(jié)構(gòu)通式。
[0020] 圖2甲琉咪哇試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
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