乙酰甲胺磷膠體金檢測卡的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]屬于食品安全檢測領(lǐng)域，具體涉及食品中有害殘留物的檢測方法，特別是乙酰甲胺磷試紙檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]乙酰甲胺磷(英文名稱:Ac印hate)又名高滅磷，屬低毒殺蟲劑。乙酰甲胺磷為內(nèi)吸殺蟲劑，具有胃毒和觸殺作用，并可殺卵，有一定的熏蒸作用，是緩效型殺蟲劑，適用于蔬菜、茶樹、煙草、果樹、棉花、水稻、小麥、油菜等作物，防治多種咀嚼式、刺吸式口器害蟲和害螨及衛(wèi)生害蟲。保管及使用不當可引起人畜中毒。
[0003]乙酰甲胺磷屬有機磷酸酯類農(nóng)藥。該類農(nóng)藥抑制體內(nèi)膽堿酯酶，造成神經(jīng)生理功能紊亂。有機磷農(nóng)藥急性中毒系誤服引起。中毒表現(xiàn)有頭痛、頭昏、食欲減退、惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉、流涎、瞳孔縮小、呼吸道分泌物增多、多汗、肌束震顫等。重癥出現(xiàn)肺水腫、昏迷、呼吸麻痹、腦水腫，少數(shù)重度中毒者在臨床癥狀消失后數(shù)周出現(xiàn)神經(jīng)病。接觸有機磷農(nóng)藥工人可有頭暈、頭痛、無力、失眠、多汗、四肢麻木、肌肉跳動等。血膽堿酯酶活性降低。
[0004]我國已制定的一些農(nóng)副產(chǎn)品中的農(nóng)藥最高殘留限量表中乙酰甲胺磷的限量為谷類(以原糧計)，蔬菜中不得超過0.2mg/kg ;水果中不得超過0.5mg/kg。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明目的在于提供快速檢測出食品中乙酰甲胺磷的殘留。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案是乙酰甲胺磷的檢測卡及其檢測樣品的處理方法。乙酰甲胺磷的檢測卡是在長條扁平薄殼狀的檢測卡外殼內(nèi)設(shè)置檢測條，檢測卡外殼表面有檢測窗孔和加樣孔，其特征在于測試條是由支承背板上粘貼四種原件組成:支承背板中部粘貼硝酸纖維素膜，支承背板一端上粘貼吸水紙，另一端粘貼樣品墊，吸水紙內(nèi)端與硝酸纖維素膜搭接，樣品墊與硝酸纖維素膜之間則有一段金標墊，由金標墊將樣品墊與硝酸纖維素膜連接在一起。金標墊中是含有第二種屬蛋白和乙酰甲胺磷抗體的混合物，硝酸纖維素膜上橫向有2條間隔開的顯色印記帶，一條是含乙酰甲胺磷蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的檢測帶，另一條是第二種屬動物蛋白的IgG (常用的為抗兔抗體或抗鼠抗體);測試條置入檢測卡外殼內(nèi)，樣品墊正對加樣孔，硝酸纖維素膜正對檢測窗孔。
[0007]樣品處理方法是:稱取試樣2±0.05 g于50 mL的離心管中，加入10 mL超純水，在1800 r/min條件下用高速組織粉碎機打碎(約1 min),取粘稠液加50%三氯乙酸2 mL和二氯甲燒10 mL,在回旋式振蕩器上高速振搖30 min。然后在4°C 5000 rpm條件下離心30 min，取上清10 mL，加二氯甲烷2 mL，在回旋加速器上振蕩混合20 min，再在4°C 12000rpm條件下離心30 min,上清液即為藥物的抽提液。
[0008]本發(fā)明的優(yōu)點是能快速檢測出樣品中含有的乙酰甲胺磷，且節(jié)省檢測成本，使用方便，檢測快速，靈敏度高，結(jié)果準確。
【附圖說明】
[0009]圖1是乙酰甲胺磷檢測卡外殼及檢測試紙條在外殼內(nèi)的安置圖。
[0010]圖2是乙酰甲胺磷檢測卡檢測試紙條結(jié)構(gòu)示意圖。
[0011]圖3是檢測試紙條硝酸纖維素膜上顯示印跡帶示意圖。
【具體實施方式】
[0012]1.標記膠體金的制備
膠體金溶液的制備:先將1 g氯金酸(HAuC14)粉末溶于100 mL超純水配置成1%的氯金酸溶液；再取1 L超純水于特質(zhì)電爐上加熱，至沸騰后加入10 mL 1%的檸檬酸三鈉水溶液，沸騰后繼續(xù)加熱，5分鐘后加10 mL 1%的氯金酸溶液，再次加熱至沸騰，等待顏色變?yōu)榫萍t色后開始計時，10分鐘后停止加熱，取下后自然冷卻、定容至1 L，即為膠體金溶液。
[0013]抗體標記:確定抗體所需的0.1 mol/1 K2C03的比例，取100 mL膠體金溶液，加入此比例0.1 mol/L的K2C03，混勻(約5 min),再將乙酰甲胺磷和第二種屬動物蛋白分別用PBS (0.01 mol/L,pH7.4)溶解稀釋至2 mg/mL,加入2 mL 2 mg/mL的乙酰甲胺磷抗體(或2mL 2 mg/mL第二種屬動物蛋白),混勻(5 min),最后加入10% BSA 2 mL,混勻(5 min)。離心三次留沉淀，此三次收集的沉淀即為金標乙酰甲胺磷抗體。
[0014]膠體金標記部分處理:將乙酰甲胺磷抗體稀釋后，按一定比例將載體(如玻璃纖維、聚酯膜等)浸透，鋪均勻，取出放于37 °C恒溫烘箱烘制8-12 h，干燥后即作為膠體金標記部分。
[0015]2.免疫層析專用高分子復(fù)合膜制備
首先用一種硝酸纖維素膜制成透明背襯膜，在背襯膜上覆蓋一層對蛋白質(zhì)結(jié)合力強，浸潤性能好的具有一定孔徑的層析膜。背襯膜的作用是阻止粘合劑中的有機溶劑對層析膜上蛋白質(zhì)的破壞。
[0016]3.層析膜的點樣方法
將一定濃度的甜蜜抗原(乙酰甲胺磷與載體物質(zhì)形成的偶合物)精確定量；以一定間距(5 mm)呈橫條狀點定于層析膜上，供檢測用。
[0017]乙酰甲胺磷檢測卡是在檢測卡外殼1中設(shè)置檢測試紙條2，檢測卡外殼1的結(jié)構(gòu)及檢測試紙條2的設(shè)置見附圖1，檢測卡外殼1為長條扁平薄殼狀外殼，長70 _，寬20 _，厚5 mm,薄殼壁厚1 mm,由工程塑料制成，檢測卡外殼1由上蓋和下蓋兩半聯(lián)接而成，在檢測卡外殼1上蓋上有檢測窗孔3和加樣孔4。檢測試紙條2放置在檢測卡外殼1的下蓋內(nèi)。
[0018]檢測試紙條2是多層結(jié)構(gòu)的窄條薄片，片長60 mm,片寬約4 mm,厚度小于2.5 mm。檢測試紙條2是多層結(jié)構(gòu):底層是支承背板5,為聚乙烯薄片,厚度約0.5 mm,長60 mm,寬
4mm ;支承背板5中部粘貼硝酸纖維素膜6,硝酸纖維素膜厚0.5 mm,長20 mm,寬4 mm。硝酸纖維素膜6上有兩條間隔開的橫向顯示印跡帶，參見附圖3，兩條顯示印跡中，一條是檢測線10，含乙酰甲胺磷偶聯(lián)物，另一條是參照線11，含第二種屬動物蛋白的IgG。支承背板
5一端上粘貼吸水紙9，另一端粘貼樣品墊8，吸水紙9內(nèi)端與硝酸纖維素膜6搭接，樣品墊8與硝酸纖維素膜6之間則有一段金標墊7，由金標墊7將樣品墊8與硝酸纖維素膜6連接在一起，搭接寬度在1-2 mm。樣品墊8材料為吸水玻璃纖維或聚酯膜。
[0019]使用乙酰甲胺磷膠體金檢測卡時，先將待檢測的樣品液(藥物的抽提液稀釋后，直接用于檢測)從加樣孔4中滴入乙酰甲胺磷檢測試紙條2的樣品墊8，由于虹作用原理，帶動待檢測的樣品液及膠體金膜7所含的抗乙酰甲胺磷單克隆抗體膠體金標記物一起向硝酸纖維素膜6擴散，5-10分鐘內(nèi)觀察結(jié)果。
[0020]檢測卡的主要反應(yīng)是免疫學(xué)的抗原和抗體反應(yīng)，在硝酸纖維素膜上遷移的膠體金標記的抗體，在測試線上與含有乙酰甲胺磷蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，以及參照線含第二種屬動物蛋白的IgG反應(yīng)，形成棕紅色條帶。若樣品中相應(yīng)的待測乙酰甲胺磷高于允許值，樣品加入后先與金標墊中的抗體反應(yīng)，而不會與檢測帶所帶有的乙酰甲胺磷蛋白質(zhì)偶聯(lián)物反應(yīng)，從而不顯色。主要有以下3種檢測結(jié)果:
1、檢測線10和參照線11同時顯現(xiàn)棕紅色印跡，表示檢測結(jié)果為陰性，說明被測樣品中不含乙酰甲胺磷或含量低于允許值。
[0021]2、檢測線10不顯色，參照線11顯現(xiàn)棕紅色印跡，表示檢測結(jié)果為陽性，說明被測樣品中乙酰甲胺磷含量高于允許值。
[0022]3、檢測線10顯現(xiàn)棕紅色印跡，參照線11不顯色，或檢測線10和參照線11均不顯色，表示檢測試紙條失效。
【主權(quán)項】
1.乙酰甲胺磷膠體金檢測卡，其特征在于:在試紙的背襯上依次貼有樣液吸收部分、膠體金標記部分、檢測反應(yīng)部分和吸水部分，膠體金標記部分被標記的物質(zhì)為第二種屬動物蛋白和乙酰甲胺磷抗體的混合物；檢測反應(yīng)部分包被有檢測用乙酰甲胺磷抗原1條作為檢測線，同時還包被有抗第二種屬動物蛋白的IgG 1條作為參照線。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙酰甲胺磷膠體金檢測卡，其特征在于:乙酰甲胺磷檢測用抗原為乙酰甲胺磷與載體物質(zhì)形成的偶合物。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的乙酰甲胺磷膠體金檢測卡，其特征在于:所述的載體物質(zhì)，為蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段、合成多肽、半合成多肽或多糖。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙酰甲胺磷膠體金檢測卡，其特征在于:所述的第二種屬動物蛋白為非抗體來源動物的蛋白質(zhì)。
【專利摘要】本發(fā)明為乙酰甲胺磷膠體金檢測卡。主要用于快速檢測食品中乙酰甲胺磷的含量，該方法在試紙的背襯上依次粘貼有樣液吸收部分、膠體金標記部分、檢測反應(yīng)部分及吸水部分。檢測反應(yīng)部分上面包被有檢測用抗原1條作為檢測線，同時還包被有抗第二種屬動物蛋白的IgG1條作為參照線。該快速檢測試紙條特異性強，能夠半定量檢測，環(huán)境溫度為4-35℃都可以使用，適合于個體養(yǎng)殖戶、食品衛(wèi)生質(zhì)檢部門、海關(guān)等植物源食品進行乙酰甲胺磷殘留的快速檢測。本發(fā)明具有特異性強、靈敏性高、能夠?qū)崿F(xiàn)半定量檢測，且操作簡單方便等有益效果。
【IPC分類】G01N33/558, G01N33/577
【公開號】CN105486868
【申請?zhí)枴緾N201410522807
【發(fā)明人】洪霞, 薛永來, 吳明慧
【申請人】江蘇維賽科技生物發(fā)展有限公司
【公開日】2016年4月13日
【申請日】2014年10月8日