一種酶聯(lián)免疫檢測(cè)禽鸚鵡熱衣原體的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及檢測(cè)試劑盒，具體地說，涉及酶聯(lián)免疫檢測(cè)禽鸚鵡熱衣原體的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 禽衣原體病(Avian Chlamydiosis)是由嬰鳥鵡熱衣原體(Chlamydia psittaci，Cp) 引起的一類家禽、鳥類及哺乳動(dòng)物等人畜共患傳染性疾病。常常表現(xiàn)為禽類呼吸道和消化 道疾病癥狀，感染家禽嗜睡、發(fā)燒、體重下降、鼻腔和眼睛異樣分泌物、氣囊炎、腹膜炎、心包 炎、肝周炎以及產(chǎn)蛋禽產(chǎn)蛋量下降，病死率可達(dá)30%;觀賞鳥類感染后表現(xiàn)為食欲減退、體 重減輕、腹瀉、黃色糞便、竇炎、呼吸道炎癥以及肝脾腫大、氣囊炎、心包炎、腹膜炎等癥狀。 該病偶爾也會(huì)感染牛、羊和其它哺乳動(dòng)物，引起動(dòng)物生殖道炎性病變、孕畜流產(chǎn)等癥狀。人 類在自然條件下可感染該病，主要引起呼吸道感染、肺炎和菌血癥，所以臨床上又稱之為鸚 鵡熱(psittacosis)或鳥疫(Ornithosis)。
[0003][0004] 目前國(guó)內(nèi)外對(duì)鸚鵡熱衣原體的主要檢測(cè)手段包括兩大類即抗原檢測(cè)和血清學(xué)檢 測(cè)?？乖瓩z測(cè)方法有直接染色，免疫組織化學(xué)染色，病原分離和鑒定，免疫熒光技術(shù)，聚合酶 鏈反應(yīng)，雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)。血清學(xué)檢測(cè)方法有補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)，間接血凝試驗(yàn)，膠 體金試紙條法等。
[0005] 直接染色病原法方法操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快，但是靈敏性和特異性一般，結(jié)果判定需要 有豐富的專業(yè)技術(shù)經(jīng)驗(yàn)，判定結(jié)果受主觀影響較大，尤其辨認(rèn)衣原體的EB和RB時(shí)候相當(dāng)困 難。
[0006] 病原分離鑒定方法病原分離需要禽胚或細(xì)胞，分離過程比較復(fù)雜并對(duì)試驗(yàn)操作要 求較高一般基層試驗(yàn)室難以進(jìn)行。免疫熒光抗體技術(shù)特異性強(qiáng)、敏感性高，是衣原體抗原鑒 定比較理想的方法，但熒光顯微鏡價(jià)格昂貴不適合作為常規(guī)檢測(cè)方法。聚合酶鏈反應(yīng)雖然 有較高的特異性和敏感性制備模板比較復(fù)雜所需樣本量大，且需要PCR儀等貴重儀器，檢測(cè) 試劑昂貴。
[0007] 雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法具有簡(jiǎn)便，靈敏，高效等特點(diǎn)但目前國(guó)內(nèi)沒有能 夠檢測(cè)禽衣原抗原的ELISA試劑盒。補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)操作繁瑣、敏感性低、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、需要較 高的專業(yè)知識(shí)，因此在臨床應(yīng)用中受到較多限制。
[0008]間接血凝試驗(yàn)方法操作程序簡(jiǎn)單、不需要特殊設(shè)備，但是結(jié)果判定受主觀因素影 響較大，而且耦合抗原多為全菌體，可能與部分革蘭氏陰性菌存在交叉反應(yīng)，結(jié)果易產(chǎn)生假 陽(yáng)性。膠體金試紙條法操作簡(jiǎn)單易行但檢測(cè)敏感性較低。
[0009] 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)是用于血清抗體檢測(cè)的常用方法，若能選擇并制備適宜的包被 抗原及通用性好的酶聯(lián)二抗用于禽衣原體病ELISA抗體檢測(cè)，則可達(dá)到通用性好、操作簡(jiǎn) 便、所需時(shí)間短、降低操作人員主觀因素影響的目標(biāo)，從而彌補(bǔ)上述對(duì)鸚鵡熱衣原體檢測(cè)方 法的不足。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種酶聯(lián)免疫檢測(cè)禽鸚鵡 熱衣原體的試劑盒。
[0011] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0012] 本發(fā)明提供一種酶聯(lián)免疫檢測(cè)禽鸚鵡熱衣原體的試劑盒，所述試劑盒包括:包被 有鸚鵡熱衣原體重組蛋白Μ0ΜΡ的固相載體，酶標(biāo)抗體，禽鸚鵡熱衣原體陰性對(duì)照血清，禽鸚 鵡熱衣原體陽(yáng)性對(duì)照血清;所述鸚鵡熱衣原體重組蛋白Μ0ΜΡ的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1 所示。
[0013] 進(jìn)一步地，所述固相載體包被鸚鵡熱衣原體重組蛋白Μ0ΜΡ后，經(jīng)抗原保護(hù)劑處理， 所述抗原保護(hù)劑含有2%的β-l，3/1，6葡聚糖，20%的甘油和0.01 %的明膠，余量為PBS。
[0014] 作為優(yōu)選，本發(fā)明為了提供一種酶聯(lián)免疫反應(yīng)試劑盒，所述固相載體為采用酶標(biāo) 板，如96孔酶標(biāo)板。
[0015] 進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了包被有鸚鵡熱衣原體重組蛋白Μ0ΜΡ的酶標(biāo)板的制備方法 為：
[0016] 1)以鸚鵡熱衣原體6BC株總DNA為模板，使用特異性引物M0MP-F和M0MP-R進(jìn)行擴(kuò) 增，得到1143bp的目的片段，核苷酸序列如SEQIDN0.2所示；
[0017] M0MP-F：AAAGAATTCTTGCCTGTAGGGAACCC；
[0018] M0MP-R：GGGGTCGACTTAGAATCTGAATTGAG；
[0019] 2)將擴(kuò)增所得片段回收純化后用EcoRlI和Sail雙酶切回收純化目的片段；
[0020] 3)將酶切好的目的片段與用相同酶切的PET28a( + )載體連接獲得重組表達(dá)質(zhì)粒； [0021] 4)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)內(nèi)，37°C培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；
[0022] 5)將菌液離心收集沉淀，將沉淀重溶于適量體積的pH7.2的roS溶液中，經(jīng)過超聲 裂解處理后離心取沉淀；
[0023 ] 6)重復(fù)第5)步，獲得的沉淀為重組蛋白包涵體；
[0024] 7)將步驟6)的沉淀經(jīng)尿素溶解、透析復(fù)性后，與Ni-NTA瓊脂糖凝膠混勻，低溫結(jié) 合；
[0025] 8)將結(jié)合完畢后的蛋白與Ni-NTA瓊脂糖混合物，倒入空Ni-NTA柱，以20mmol/L咪 唑溶液洗滌，除去雜蛋白；
[0026] 9)以250mmol/L的咪唑溶液洗脫Ni-NTA柱，收集經(jīng)SDS-PAGE分析達(dá)到95%以上純 化程度的重組蛋白Μ0ΜΡ洗脫液；
[0027] 10)將收集的蛋白洗脫液體裝入透析袋中，在20倍體積的PBS溶液中透析去除咪 唑，冷凍抽干獲得干粉重組蛋白Μ0ΜΡ;
[0028] 11)將重組蛋白干粉以pH9.6、50mM碳酸鹽緩沖液稀釋為終濃度0.5yg/mL，加入酶 標(biāo)板各孔，4°C孵育16小時(shí)，用洗滌緩沖液PBST沖洗酶標(biāo)板，再用封閉液(含5%脫脂奶粉的 PBST溶液)封閉，以封閉液200yL/孔封閉，37°C溫育2小時(shí)，倒掉封閉液，PBST洗滌3次甩干以 封閉液200yL/孔封閉，37°C溫育2小時(shí)，倒掉封閉液，PBST洗滌3次甩干以封閉液200yL/孔封 閉，37°C溫育2小時(shí)，倒掉封閉液，PBST洗滌3次甩干倒掉封閉液，洗滌，甩干；
[0029] 12)封閉好的微孔板每孔加入200微升的抗原保護(hù)劑，37°C孵育4小時(shí)后，倒掉抗原 保護(hù)劑，洗滌，甩干，晾干，即獲得包被有鸚鵡熱衣原體重組蛋白Μ0ΜΡ的酶標(biāo)板。
[0030] 進(jìn)一步地，為了使檢測(cè)試劑盒具有更好的通用性，所述酶標(biāo)抗體為辣根過氧化物 酶標(biāo)記的兔抗禽I gG。
[0031] 進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供了所述禽鸚鵡熱衣原體陽(yáng)性對(duì)照血清的制備方法，具體 如下：
[0032] 1)取鸚鵡熱衣原體6BC株滅活抗原，將抗原以2SP溶液稀釋至蛋白濃度為2mg/mL;
[0033] 2)選擇8周齡，衣原體抗體為陰性SPF雞，進(jìn)行免疫；
[0034] 3)首免:將氟氏完全佐劑與衣原體抗原等量混合，充分乳化，取lmL頸部皮下多點(diǎn) 注射；
[0035] 4)二免:首免后第14天，取氟氏不完全佐劑與衣原體抗原等量混合，充分乳化，取 lmL頸部皮下多點(diǎn)注射；
[0036] 5)三免:二免后第7天，同二免方法加強(qiáng)免疫一次；
[0037] 6)四免:三免后第7天，肌肉和頸部皮下各注射衣原體抗原lmL;
[0038] 7)1周后采血，經(jīng)衣原體IHA試劑盒測(cè)定血清抗體效價(jià)，選取效價(jià)2 1:256的SPF雞， 進(jìn)行心臟采血，無菌分離血清，水浴滅活，即獲得禽鸚鵡熱衣原體陽(yáng)性對(duì)照血清。
[0039] 進(jìn)一步地，所述禽鸚鵡熱衣原體陰性對(duì)照血清的制備方法為：
[0040] 選取2~4只SPF雞，優(yōu)選2只，分別采血、分離血清，水浴滅活，經(jīng)過衣原體間接血凝 (IHA)試劑盒檢測(cè)，收集結(jié)果為陰性的禽血清，混合，即為禽鸚鵡熱衣原體陰性對(duì)照血清。
[0041] 進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括洗滌緩沖液、酶標(biāo)抗體稀釋溶液、樣本稀釋緩沖液、 顯色液和終止液。
[0042]其中，所述洗滌緩沖液為含0.5%。吐溫-20、pH7.2的磷酸鹽緩沖液(PBST);
[0043] 所述酶標(biāo)抗體稀釋溶液為含有1.0 %牛血清白蛋白、0.1 %。硫柳汞鈉、5 %甘油、5 % 海藻糖的PH7.2的磷酸鹽緩沖液；
[0044] 所述樣本稀釋緩沖液為含有1 %小牛血清、0.3%Triton-100、0.1%。硫柳汞鈉的 pH7.2的磷酸鹽緩沖液；
[0045]所述終止液為強(qiáng)酸，優(yōu)選為蒸餾水配制的出504。
[0046] 進(jìn)一步地，所述顯色液包括顯色劑A和顯色劑B:顯色劑A為含1.46 %磷酸氫二鈉， 0.93 %檸檬酸，0.045 %過氧化氫的水溶液;顯色劑B為含0.03 %四甲基聯(lián)苯胺，0.096 %檸 檬酸，0.019%乙二胺四乙二酸鈉鹽，2%DMS0,4%甘油的水溶液。
[0047]本發(fā)明還提供了所述試劑盒的操作步驟：
[0048]用樣本稀釋液將陽(yáng)性對(duì)照血清，陰性對(duì)照血清和樣本以1:100倍稀釋，以100μL7孔 加入到重組蛋白包被板內(nèi)（其中陽(yáng)性和陰性對(duì)照設(shè)復(fù)孔），37°C溫育30min，倒掉反應(yīng)