本發(fā)明涉及生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體地，涉及一種三維生物標(biāo)志物檢測(cè)裝置、該三維生物標(biāo)志物檢測(cè)裝置的制備方法及利用該三維生物標(biāo)志物檢測(cè)裝置檢測(cè)生物標(biāo)志物的方法。

背景技術(shù)：

傳統(tǒng)的生物標(biāo)記物檢測(cè)法——96孔板的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)，因其繁瑣的實(shí)驗(yàn)步驟和大體積的樣品量(50-100微升/孔)而難以實(shí)現(xiàn)方便、低成本、高通量、高信息量的檢測(cè)。目前提高信息量的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)是將多個(gè)捕獲抗體分別定點(diǎn)固定在同一個(gè)96孔里，同一個(gè)樣品加入一個(gè)孔里便能同時(shí)檢測(cè)多種生物標(biāo)志物，而結(jié)合上的酶標(biāo)二抗催化底物原位產(chǎn)生發(fā)光產(chǎn)物，再通過(guò)捕捉圖片分析其亮度而同時(shí)定量一個(gè)樣品里多個(gè)標(biāo)志物的含量。此方法并沒(méi)有脫離原96孔板的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)的操作手法和樣品體積用量，因此也難以實(shí)現(xiàn)方便的高通量檢測(cè)。而384孔及更高通量的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)要求反應(yīng)總體積小、加樣體積準(zhǔn)確，因而需要依靠昂貴的自動(dòng)化設(shè)備，使大多數(shù)普通實(shí)驗(yàn)室望而卻步，只能依賴(lài)人工操作進(jìn)行96孔板的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)。

如上所述，生物標(biāo)記物檢測(cè)的微小化是高通量檢測(cè)的一個(gè)要求。最簡(jiǎn)單的微小化便是將96孔板的二維平面酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)的操作方法直接挪用至384孔板或更多孔的孔板。許多文獻(xiàn)中也利用微流道達(dá)到納升甚至皮升量級(jí)的反應(yīng)體系，但是需要借助微流泵等復(fù)雜儀器，且無(wú)法實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)。另一種微小化便是將二維平面的微小酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)提升至三維反應(yīng)空間。三維酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)相對(duì)二維的優(yōu)點(diǎn)在于其能提供更多的位點(diǎn)固定捕獲抗體以提高捕獲效率，進(jìn)而增強(qiáng)信號(hào)及靈敏度。常用的三維基底是聚乙二醇水凝膠，其含水量高，使捕獲抗體能更好的保持活性。然而，由于物質(zhì)擴(kuò)散在水凝膠中比較慢，顧慮到檢測(cè)時(shí)間，這些微小水凝膠的直徑一般僅為幾百微米，而高度僅不到10微米，使人工加樣十分困難，需依賴(lài)自動(dòng)化設(shè)備。而且，水凝膠需保持半濕的狀態(tài)以防干癟而影響抗體的活性。另外，由于水凝膠含水量高，樣品滴加在水凝膠上會(huì)被稀釋?zhuān)粌H降低檢測(cè)的靈敏度，亦可能造成檢測(cè)結(jié)果的不可靠性。

因此，一種可供人工簡(jiǎn)便操作、便于儲(chǔ)存、低成本、高通量或高信息含量的三維生物標(biāo)志物檢測(cè)裝置有待開(kāi)發(fā)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問(wèn)題之一。為此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提出一種人工簡(jiǎn)便操作、便于儲(chǔ)存、低成本或高通量的三維生物標(biāo)志物檢測(cè)裝置。

根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種三維生物標(biāo)志物檢測(cè)裝置，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該三維生物標(biāo)志物檢測(cè)裝置包括：三維多孔支架芯片，和載樣板；其中，所述三維多孔支架芯片包括：基板，以及多個(gè)三維多孔支架，所述多個(gè)三維多孔支架形成在所述基板的上表面；所述載樣板包括：基底，多個(gè)親水區(qū)域，所述多個(gè)親水區(qū)域形成在所述基底的上表面，以及多個(gè)疏水區(qū)域，所述多個(gè)疏水區(qū)域形成在所述基底的上表面；所述多個(gè)親水區(qū)域與所述多個(gè)疏水區(qū)域間隔設(shè)置，并且所述多個(gè)親水區(qū)域與所述多個(gè)三維多孔支架相對(duì)應(yīng)。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，利用該三維生物標(biāo)志物檢測(cè)裝置能夠有效地檢測(cè)生物標(biāo)志物。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明提供的三維生物標(biāo)志物檢測(cè)裝置不僅方便儲(chǔ)存，還可以實(shí)現(xiàn)微小化的生物標(biāo)志物檢測(cè)。此外，具有的親疏水區(qū)域的載樣板可以實(shí)現(xiàn)人工的高通量加樣，由此，操作人員可將5微升以上的液體直接滴加至與多個(gè)三維多孔支架對(duì)應(yīng)的親水區(qū)域，不僅減少了操作人員滴加樣品的次數(shù)，更無(wú)需滴加1微升以下的樣品，可以有效減少操作壓力和操作導(dǎo)致的誤差。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述三維多孔支架是經(jīng)過(guò)干燥處理的；任選地，所述三維多孔支架是經(jīng)過(guò)冷凍干燥處理的；任選地，所述三維多孔支架攜帶有親和分子，所述親和分子特異性結(jié)合所述生物標(biāo)志物。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，將三維多孔支架陣列芯片進(jìn)行冷凍干燥后，形成干的三維多孔支架，孔徑變大，不僅利于吸收液體便于檢測(cè)，還方便儲(chǔ)存。并且結(jié)合在支架上的親和分子如捕獲抗體/抗原亦可以通過(guò)冷凍干燥保持其活性，便于長(zhǎng)期儲(chǔ)存。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述三維多孔支架被設(shè)置為陣列式排布。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述三維多孔支架呈圓柱狀。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述三維多孔支架的底部直徑為1-2mm，高300-350微米。由此，三維多孔支架吸水性更強(qiáng)，便于人工加樣，實(shí)現(xiàn)高通量、微小化的生物標(biāo)志物檢測(cè)

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述基底的至少上表面是由親水材料形成的。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例所述多個(gè)親水區(qū)域的至少一部分設(shè)置為陣列排布；或者，所述多個(gè)親水區(qū)域的至少一部分被設(shè)置為條狀。由此利于一種生物標(biāo)志物的檢測(cè)，并且人工加樣方便快捷。

在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了一種制備上述三維生物標(biāo)志物檢測(cè)裝置的方法，包括以下步驟：提供基板，并在所述基板的上表面形成多個(gè)三維多孔支架，以便獲得三維多孔支架芯片；以及提供基底，并在所述基底的上表面形成多個(gè)親水區(qū)域和多個(gè)疏水區(qū)域，以便獲得載樣板；其中，所述多個(gè)親水區(qū)域與所述多個(gè)疏水區(qū)域間隔設(shè)置，并且所述多個(gè)親水區(qū)域與所述多個(gè)三維多孔支架相對(duì)應(yīng)。

通過(guò)本發(fā)明的方法制備的三維生物標(biāo)志物檢測(cè)裝置不僅方便儲(chǔ)存，還可以實(shí)現(xiàn)微小化的生物標(biāo)志物檢測(cè)；此外，具有的親疏水區(qū)域的載樣板可以實(shí)現(xiàn)人工的高通量加樣，操作簡(jiǎn)便的同時(shí)可以有效減少誤差。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述三維多孔支架是在-12攝氏度至-20攝氏度下形成，或者在常溫下形成所述三維多孔支架后，將所述三維多孔支架進(jìn)行冷凍干燥。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，在形成所述三維多孔支架時(shí)加入甘油。由此可以提高支架在冷凍干燥后的透光性，從而降低三維多孔支架的光學(xué)干擾，提高信號(hào)傳輸?shù)馁|(zhì)量。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，在形成所述三維多孔支架后，在所述三維多孔支架上添加親和分子，并對(duì)所述三維多孔支架進(jìn)行封閉處理。由此利于捕獲待檢測(cè)的生物標(biāo)志物樣品，并對(duì)并對(duì)三維多孔支架進(jìn)行封閉處理以對(duì)親和分子進(jìn)行保護(hù)。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述基底的至少上表面是由親水材料形成的，并且所述多個(gè)疏水區(qū)域的至少一部分是通過(guò)在所述基底的上表面施加疏水材料而形成，或者所述多個(gè)疏水區(qū)域的至少一部分是通過(guò)在所述基底的上表面形成納米級(jí)的粗糙表面而形成。由此，利于含水樣品在親水區(qū)聚集，加樣簡(jiǎn)便快捷。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述疏水材料包括選自su-8(環(huán)氧基紫外負(fù)型光刻膠)、如chf3、十八烷基三氯硅烷(ots)、聚二甲硅氧烷(pdms)、正硫基十八醇、氟代烷基硅氧烷聚合物、聚四氟乙烯、三氧化鋁/二氧化硅混合涂層和氧化鈦的至少一種。

在本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提出了一種利用上述三維生物標(biāo)志物檢測(cè)裝置檢測(cè)生物標(biāo)志物的方法，包括：將含有生物標(biāo)志物的含水樣品加載至所述載樣板；使所述載樣板的親水區(qū)域與所述三維多孔支架芯片的所述三維多孔支架接觸；以及對(duì)所述三維多孔支架芯片進(jìn)行檢測(cè)；其中，所述三維多孔支架預(yù)先攜帶特異性識(shí)別所述生物標(biāo)志物的親和分子。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，每個(gè)所述三維多孔支架吸收1～2微升的所述含水樣品。由此，加樣量增加，減少了操作人員滴加樣品的次數(shù)，更無(wú)需操作人員滴加1微升以下的樣品，從而減少操作的壓力和操作導(dǎo)致的誤差。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，通過(guò)涂布或者點(diǎn)樣的方式，將含有生物標(biāo)志物的含水樣品加載至所述載樣板。通過(guò)這樣的加樣方式，無(wú)需自動(dòng)加樣儀也可以進(jìn)行加樣，尤其在采用人工加樣時(shí)，還可以減少操作人員滴加樣品的次數(shù)，方便快捷。

利用本申請(qǐng)的三維生物標(biāo)志物檢測(cè)裝置可以實(shí)現(xiàn)微小化的生物標(biāo)志物檢測(cè)，而且經(jīng)過(guò)冷凍干燥后的三維多孔支架孔徑變大，能夠吸收更多液體，由此，根據(jù)載樣板對(duì)應(yīng)的三維多孔支架的數(shù)量以及每個(gè)三維多孔支架的能夠吸收液體的量，操作人員每次可將5微升以上的液體直接滴加至載樣板上與多個(gè)三維多孔支架對(duì)應(yīng)的親水區(qū)域，不僅減少了操作人員滴加樣品的次數(shù)，更無(wú)需滴加1微升以下的樣品，有效提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確度。

本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過(guò)本發(fā)明的實(shí)踐了解到。

附圖說(shuō)明

本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點(diǎn)從結(jié)合下面附圖對(duì)實(shí)施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中：

圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的三維生物標(biāo)志物檢測(cè)裝置的三維多孔支架芯片的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的三維生物標(biāo)志物檢測(cè)裝置的載樣板的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的利用本發(fā)明的三維生物標(biāo)志物檢測(cè)裝置檢測(cè)生物標(biāo)志物時(shí)，三維多孔支架芯片與載樣板結(jié)合狀態(tài)的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖4顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的利用本發(fā)明的三維生物標(biāo)志物檢測(cè)裝置檢測(cè)生物標(biāo)志物時(shí)，三維多孔支架芯片與載樣板結(jié)合狀態(tài)的部分結(jié)構(gòu)示意圖；

圖5顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的三維生物標(biāo)志物檢測(cè)裝置檢測(cè)人白蛋白濃度的曲線(xiàn)圖，其中圖5a為人白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖，圖5b為未知濃度的人白蛋白樣品的檢測(cè)準(zhǔn)確性的直線(xiàn)圖；

圖6根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的三維生物標(biāo)志物檢測(cè)裝置檢測(cè)乙酰氨基酚對(duì)heparg人肝癌細(xì)胞分泌人白蛋白量的影響的檢測(cè)曲線(xiàn)圖。

具體實(shí)施方式

下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，所述實(shí)施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類(lèi)似的標(biāo)號(hào)表示相同或類(lèi)似的元件或具有相同或類(lèi)似功能的元件。下面通過(guò)參考附圖描述的實(shí)施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。

在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供了一種三維生物標(biāo)志物檢測(cè)裝置，下面參考附圖對(duì)該三維生物標(biāo)志物檢測(cè)裝置進(jìn)行詳細(xì)描述。參考圖1，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，三維生物標(biāo)志物檢測(cè)裝置包括三維多孔支架芯片100和載樣板200；其中，三維多孔支架芯片100包括基板110以及多個(gè)三維多孔支架120；載樣板200包括基底210、多個(gè)親水區(qū)域220以及多個(gè)疏水區(qū)域230；多個(gè)親水區(qū)域220與多個(gè)疏水區(qū)域230間隔設(shè)置，并且多個(gè)親水區(qū)域220與多個(gè)三維多孔支架120相對(duì)應(yīng)，以方便三維多孔支架芯片100和載樣板200的對(duì)接。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的三維生物標(biāo)志物檢測(cè)裝置不僅方便儲(chǔ)存，還可以實(shí)現(xiàn)微小化的生物標(biāo)志物檢測(cè)。此外，具有親疏水區(qū)域的載樣板可以實(shí)現(xiàn)人工的高通量加樣，由此，操作人員可將5微升以上的液體直接滴加至與多個(gè)三維多孔支架對(duì)應(yīng)的親水區(qū)域，不僅減少了操作人員滴加樣品的次數(shù)，更無(wú)需滴加1微升以下的樣品，可以有效減少操作壓力和操作導(dǎo)致的誤差。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，三維多孔支架120是經(jīng)過(guò)干燥處理的，任選地，是可以經(jīng)過(guò)冷凍干燥處理的。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，三維多孔支架120通過(guò)冷凍干燥后程海綿狀，孔徑變大，其吸水性能好，可以解決物質(zhì)在水凝膠中擴(kuò)散的問(wèn)題，從而使三維多孔支架可以做到幾百微米高度的尺寸，方便人工加樣。而且三維多孔支架120經(jīng)冷凍干燥處理后，樣品滴加到支架上不會(huì)被稀釋?zhuān)瑥亩岣吡藱z測(cè)結(jié)果的可信度。此外，三維多孔支架120經(jīng)冷凍干燥處理后，其機(jī)械性能提高，彈性變高，不易碎。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，三維多孔支架120可以攜帶有親和分子，親和分子特異性結(jié)合生物標(biāo)志物。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，親和分子的種類(lèi)并不受特別限制，可以是抗體/抗原(比如igg、igm等)，也可以是蛋白(比如酶)、糖蛋白(比如親和素，生物素)、核酸序列(比如dna序列、rna序列、適配體)、短肽者多肽等。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，三維多孔支架120的排布不受特別限制，可以根據(jù)儀器需求、檢測(cè)需求等制作成各種排布形式。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，三維多孔支架120的排布被設(shè)置為陣列式排布，例如可以是如6×16陣列(即橫排16排，縱排6列)。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，三維多孔支架120的形狀不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，三維多孔支架120可以呈圓柱狀。根據(jù)本發(fā)明的另一些實(shí)施例，三維多孔支架120的底部直徑可以為1-2mm，高度可以為300-350微米。由此，三維多孔支架吸水性更強(qiáng)，便于人工加樣，實(shí)現(xiàn)高通量、微小化的生物標(biāo)志物檢測(cè)。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，三維多孔支架中含有甘油。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在制作三維多孔支架時(shí)，加入甘油可以提高支架在冷凍干燥后的透光性，從而降低三維多孔支架的光學(xué)干擾，提高信號(hào)傳輸?shù)馁|(zhì)量。

根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，基底210的至少上表面是由親水材料形成的，這里的親水材料的種類(lèi)不受特別限制，帶有極性基團(tuán)的分子、對(duì)水有大的親和能力的材料即可，例如聚環(huán)氧乙烷(peo)、聚甲基丙烯酸羥乙酯、聚甲基丙烯酸羥乙酯(phema)等。根據(jù)本發(fā)明的另一些實(shí)施例，基底210也可以是全部采用親水材料形成的，例如可以采用玻璃(如硅化玻璃)、紙、石英、纖維膜、塑料、聚合物等形成基底210。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，多個(gè)親水區(qū)域220的排布不受特別限制，可以根據(jù)儀器需求、檢測(cè)需求等設(shè)置。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，多個(gè)親水區(qū)域220的排布的至少一部分可以設(shè)置為陣列排布，或者多個(gè)親水區(qū)域220的至少一部分可以被設(shè)置為條狀。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)多個(gè)親水區(qū)域220的排布的至少一部分可以設(shè)置為陣列排布時(shí)，利于一種生物標(biāo)志物的檢測(cè)，并且人工加樣方便快捷；當(dāng)多個(gè)親水區(qū)域220的至少一部分可以被設(shè)置為條狀時(shí)，利于多種生物標(biāo)志物的檢測(cè)，同樣也可以實(shí)現(xiàn)人工加樣的方便快捷。

在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了一種制備上述三維生物標(biāo)志物檢測(cè)裝置的方法，包括以下步驟：

s100：制備三維多孔支架芯片

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，三維多孔支架可以通過(guò)在基板上形成多個(gè)三維多孔支架而完成。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，形成基板的原料并不受特別限制，可以是玻璃、紙、石英、纖維膜、塑料、聚合物等。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以形成三維多孔支架的原料并不受特別限制，可以是聚乙二醇、聚乙二醇二丙烯酸酯、聚苯乙烯、聚(n-異丙基丙烯酰胺)、膠原蛋白、基質(zhì)膠、明膠等聚合物材料。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，三維多孔支架可以是制備好三維多孔支架后再結(jié)合到基板，或者在制備三維多孔支架的同時(shí)結(jié)合到基板。三維多孔支架與基板可通過(guò)化學(xué)或物理結(jié)合。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，如使用自帶或修飾后帶有雙鍵、氨基等功能基團(tuán)的硅化玻璃作為基板，便可以通過(guò)化學(xué)反應(yīng)(例如紫外光交聯(lián))與聚乙二醇二丙烯酸酯、聚(n-異丙基丙烯酰胺)等原料形成的三維多孔支架進(jìn)行結(jié)合。但如果使用不帶或者未修飾功能基團(tuán)的基板，也可以通過(guò)環(huán)氧樹(shù)脂與三維多孔支架進(jìn)行物理固化結(jié)合。

本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“修飾”應(yīng)作廣義理解，可以指任何使得基板具有與多孔支架相結(jié)合的功能基團(tuán)和/或化學(xué)鍵的方式或手段，例如可以是通過(guò)化學(xué)修飾的方式使得基板具有與多孔支架相結(jié)合的功能基團(tuán)和/或化學(xué)鍵。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，三維多孔支架是在-12攝氏度至-20攝氏度下形成，再進(jìn)行干燥處理；或者在常溫下形成三維多孔支架后，將三維多孔支架進(jìn)行冷凍干燥。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，三維多孔支架可以通過(guò)對(duì)形成三維多孔支架的原料進(jìn)行化學(xué)或光學(xué)催化，形成水凝膠后進(jìn)行冷凍干燥；也可以在低溫情況下，例如在-12攝氏度至-20攝氏度條件下，優(yōu)選在-20攝氏度下通過(guò)化學(xué)或光學(xué)催化形成冰膠后再干燥。根據(jù)本發(fā)明的另一些實(shí)施例，三維多孔支架的多孔性質(zhì)可以通過(guò)添加鹽粒、甘油、冰晶等與膠體原液不相容的化學(xué)試劑或固體顆粒制作而成。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，在形成三維多孔支架后，在三維多孔支架上添加親和分子，并對(duì)三維多孔支架進(jìn)行封閉處理。由此利于捕獲待檢測(cè)的生物標(biāo)志物樣品，并對(duì)三維多孔支架進(jìn)行封閉處理以對(duì)親和分子進(jìn)行保護(hù)。

本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“添加”應(yīng)作廣義理解，可以指任何使得三維多孔支架包含親和分子的手段，例如，可以是通過(guò)將親和分子通過(guò)化學(xué)鍵固定或結(jié)合于三維多孔支架上。

根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，親和分子可在制備水凝膠前加入，從而在形成水凝膠時(shí)便以固定親和分子。根據(jù)本發(fā)明的另一些實(shí)施例，親和分子也可以在水凝膠形成后加入。根據(jù)本發(fā)明的另一些實(shí)施例，親和分子也可以在三維多孔支架進(jìn)行冷凍干燥后再固定。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，每個(gè)三維多孔支架可以固定一個(gè)或多個(gè)親和分子，每個(gè)三維多孔支架芯片也可以包含一種或多種固定了親和分子的三維多孔支架。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，親和分子的種類(lèi)并不受特別限制，可以是抗體/抗原(比如igg、igm等)，也可以是蛋白(比如酶)、糖蛋白(比如親和素，生物素)、核酸序列(比如dna序列、rna序列、適配體)、短肽者多肽等。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，抗非特異性吸附的物質(zhì)的種類(lèi)并不受特別限制，可以是牛血清白蛋白、乙醇胺、脫脂牛奶、巰基乙醇(mch)、三乙二醇單-11-巰基十一烷基醚、聚乙烯基吡咯烷酮(pvp)、11-巰基十一烷基-四(乙二醇)(oeg4)、1-巰基十一烷基-六(乙二醇)(oeg6)等寡聚乙二醇、以及聚乙二醇(peg)及其衍生物等。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，三維多孔支架在制備時(shí)可修飾各種基團(tuán)(比如雙鍵、羥基、醛基、翔基等)，以提供親和分子固定所需的基團(tuán)。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，將修飾了親和分子并封閉后的三維多孔支架陣列芯片低溫冷凍并干燥。低溫冷凍后干燥的條件可根據(jù)親和分子的特性而加入必要的保護(hù)劑(比如蔗糖、海藻糖)和適合的緩沖液(比如ph7的tris緩沖液)。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，冷凍干燥后的三維多孔支架芯片可置于低溫或常溫干燥的環(huán)境中保存。

s200：制備載樣板

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，載樣板可以通過(guò)在基底上形成多個(gè)親水區(qū)域和多個(gè)疏水區(qū)域而完成。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，多個(gè)親水區(qū)域與多個(gè)疏水區(qū)域間隔設(shè)置，并且多個(gè)親水區(qū)域與多個(gè)三維多孔支架相對(duì)應(yīng)，由此便于三維多孔支架芯片和載樣的對(duì)接。

根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，基底的至少上表面是由親水材料形成的，這里的親水材料的種類(lèi)不受特別限制，帶有極性基團(tuán)的分子、對(duì)水有大的親和能力的材料即可，例如聚環(huán)氧乙烷(peo)、聚甲基丙烯酸羥乙酯、聚甲基丙烯酸羥乙酯(phema)等。根據(jù)本發(fā)明的另一些實(shí)施例，基底210也可以是全部采用親水材料形成的，例如可以采用玻璃(如硅化玻璃)、紙、石英、纖維膜、塑料、聚合物等形成基底210。

根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，提供基底后，可以預(yù)先對(duì)基底進(jìn)行親水處理，例如使用氧等離子體清潔儀對(duì)基底進(jìn)行清洗。

根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，多個(gè)疏水區(qū)域的至少一部分是通過(guò)在基底的上表面施加疏水材料而形成。根據(jù)本發(fā)明的另一些實(shí)施例，多個(gè)疏水區(qū)域的至少一部分是通過(guò)在基底的上表面形成納米級(jí)的粗糙表面而形成。由此，利于含水樣品在親水區(qū)聚集，加樣簡(jiǎn)便快捷。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，疏水材料包括選自su-8(環(huán)氧基紫外負(fù)型光刻膠)、如chf3、十八烷基三氯硅烷(ots)、聚二甲硅氧烷(pdms)、正硫基十八醇、氟代烷基硅氧烷聚合物、聚四氟乙烯、三氧化鋁/二氧化硅混合涂層和氧化鈦的至少一種。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，形成多個(gè)親水區(qū)域和多個(gè)疏水區(qū)域的方法可以采用影印石版術(shù)(photolithography)、微接觸打印技術(shù)(microcontactprinting)、微流體圖案技術(shù)(microfluidicpatterning)、層流圖案技術(shù)(laminarflowpatterning)、模版圖案技術(shù)(stencilpatterning)、壓印光刻技術(shù)(imprintlithography)、流體光刻技術(shù)(flowlithography)、等離子體處理(plasma)、(contactelectrochemicalreplication)等。

通過(guò)本發(fā)明的方法制備的三維生物標(biāo)志物檢測(cè)裝置不僅方便儲(chǔ)存，還可以實(shí)現(xiàn)微小化的生物標(biāo)志物檢測(cè)；此外，具有的親疏水區(qū)域的載樣板可以實(shí)現(xiàn)人工的高通量加樣，操作簡(jiǎn)便的同時(shí)可以有效減少誤差。

在本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提出了一種利用上述三維生物標(biāo)志物檢測(cè)裝置檢測(cè)生物標(biāo)志物的方法。參考圖3，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該檢測(cè)方法包括：

s100：將含有生物標(biāo)志物的含水樣品加載至載樣板。

本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“生物標(biāo)志物”應(yīng)作廣義理解，可以指夠反映致病因素或毒物從暴露到效應(yīng)過(guò)程中，各個(gè)環(huán)節(jié)性質(zhì)的任何的特異性生物分子,如dna、蛋白質(zhì)、酶、脂質(zhì)、糖類(lèi)等；也指在各種效應(yīng)過(guò)程中反映某種外來(lái)物質(zhì)引發(fā)的生物化學(xué)反應(yīng)以及各種數(shù)據(jù)指標(biāo)。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，生物標(biāo)志物可指處于緩沖液、細(xì)胞培養(yǎng)液中或血液、唾液、尿液等體液中。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，通過(guò)涂布或者點(diǎn)樣的方式，將含有生物標(biāo)志物的含水樣品加載至載樣板。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，生物標(biāo)志物可手動(dòng)或通過(guò)自動(dòng)加樣儀，以一排或一列的方式涂布加載至載樣板上。根據(jù)本發(fā)明的另一些實(shí)施例，生物標(biāo)志物可手動(dòng)或通過(guò)自動(dòng)加樣儀，以點(diǎn)樣或涂布的方式加載至載樣板上。通過(guò)這樣的加樣方式，無(wú)需自動(dòng)加樣儀也可以進(jìn)行加樣，尤其在采用人工加樣時(shí)，還可以減少操作人員滴加樣品的次數(shù)，方便快捷。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以將相同或不同種類(lèi)、相同或不同濃度的生物標(biāo)志物樣品加載至載樣板上，如人白蛋白溶液、其他蛋白、空白對(duì)照等。

s200：使載樣板的親水區(qū)域與三維多孔支架芯片的三維多孔支架接觸。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，將生物標(biāo)志物加載至載樣板后，將三維多孔支架芯片與載樣板相扣，進(jìn)行孵育、反應(yīng)。如圖3和圖4(圖4是圖3圓圈區(qū)域的放大示意圖)所示，將三維多孔支架芯片與載樣板相扣后，三維多孔支架與親水區(qū)域接觸，三維多孔支架吸收樣品液體。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，每個(gè)三維多孔支架可以吸收1～2微升的含水樣品。由此，操作人員在加樣時(shí)，根據(jù)載樣板對(duì)應(yīng)的三維多孔支架的數(shù)量以及每個(gè)三維多孔支架的能夠吸收液體的量，每次可將5微升以上的液體滴加至載樣板上的親水區(qū)域，一個(gè)區(qū)域可同時(shí)供三維多孔支架芯片上一排或者一列的三維多孔支架使用，加樣量增加，不僅減少了操作人員滴加樣品的次數(shù)，更無(wú)需操作人員滴加1微升以下的樣品，從而減少操作的壓力和操作導(dǎo)致的誤差。

s300：對(duì)三維多孔支架芯片進(jìn)行檢測(cè)；其中，三維多孔支架預(yù)先攜帶特異性識(shí)別生物標(biāo)志物的親和分子。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，載樣板的親水區(qū)域與三維多孔支架芯片的三維多孔支架接觸，使生物標(biāo)志物與親和因子反應(yīng)后，將三維多孔支架芯片以緩沖液清洗數(shù)遍，于吸水紙上吸走多余水分，再與檢測(cè)物質(zhì)孵育、反應(yīng)。檢測(cè)物質(zhì)的加樣方式與生物標(biāo)志物的加樣方式相同。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，檢測(cè)物質(zhì)為修飾了熒光基團(tuán)、催化物(比如酶)或者貴金屬納米顆粒的抗體/抗原、細(xì)胞、微生物、病毒、抗體/抗原、蛋白、小分子、核酸序列(比如dna序列、rna序列)、短肽或多肽等。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，檢測(cè)可以是直接放入酶標(biāo)儀等具有陣列吸收譜/散射譜/消光譜/反射譜測(cè)試功能的儀器里檢測(cè)熒光、化學(xué)發(fā)光或者吸收光的強(qiáng)弱，也可以通過(guò)掃描或拍攝將三維多孔支架芯片上的每個(gè)三維多孔支架的灰度、亮度、顏色深淺、熒光強(qiáng)弱、化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)弱等以圖片形式輸出信號(hào)。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明提供的三維生物標(biāo)志物檢測(cè)裝置可以用于多種信號(hào)方式的檢測(cè)，例如可以檢測(cè)熒光標(biāo)記二抗的熒光強(qiáng)度，由此根據(jù)熒光強(qiáng)度制作曲線(xiàn)；或者檢測(cè)辣根酶標(biāo)記二抗催化四甲基聯(lián)苯胺等底物的光吸收強(qiáng)度，由此根據(jù)吸收強(qiáng)度制作曲線(xiàn)；或者檢測(cè)辣根酶催化的二氨基聯(lián)苯胺等底物的顯色灰度，由此根據(jù)顯色灰度制作灰度定量曲線(xiàn)。

現(xiàn)有技術(shù)中，三維多孔支架芯片的保存和使用均需在含水環(huán)境中，由此在檢測(cè)生物標(biāo)志物時(shí)會(huì)造成物質(zhì)的稀釋和擴(kuò)散，并且吸水性能差，檢測(cè)量低。同時(shí)，由于形成三維多孔支架為聚合物材料，其冷凍干燥后會(huì)變得不透明，干擾檢測(cè)信號(hào)，所以很難想到將三維多孔支架芯片進(jìn)行冷凍干燥處理。而本發(fā)明人經(jīng)過(guò)反復(fù)研究發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明的方法制備的三維生物標(biāo)志物檢測(cè)裝置不僅可以解決物質(zhì)的擴(kuò)散和稀釋問(wèn)題，以提高檢測(cè)結(jié)果的可信度；同時(shí)由于三維多孔支架可以做到幾百微米高度的尺寸，方便人工加樣。此外，雖然經(jīng)過(guò)冷凍干燥處理，卻不會(huì)造成三維多孔支架的光學(xué)干擾，提高了信號(hào)傳輸?shù)馁|(zhì)量。

下面通過(guò)具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行解釋和說(shuō)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解的是，下面的實(shí)施例僅僅是說(shuō)明性的，并不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。并且在下面的實(shí)施例中，除非特別說(shuō)明，所采用的試劑、材料均為市售可得的。

實(shí)施例1

1、三維多孔支架芯片的制備過(guò)程如下：

(1)三維多孔支架芯片的制備

1g聚乙二醇二丙烯酸酯4000、0.1g光引發(fā)劑ig2959、0.006gn-丙烯酰氧基琥珀酰亞胺溶于6ml甘油和4ml水中，配成預(yù)混液。以?xún)善w玻片(總350微米厚)夾在一片修飾了十八烷基三氯硅烷(ots)的75mm×25mm×1mm的載玻片和修飾了弘甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷(tmspma)同等大小的載玻片中，用移液器將兩片載玻片之間的縫隙灌滿(mǎn)預(yù)混液。將6列×16排陣列，孔徑為1.4mm的光掩膜(即除了6列，16排共96個(gè)1.4mm直徑的透明區(qū)域外，其他皆為黑色不透光的75mm×25mm塑料膜)蓋于載玻片上，通過(guò)紫外光將預(yù)混液交聯(lián)形成直徑1.4mm、高350微米的圓柱體水凝膠。將ots修飾的載玻片和蓋玻片撤走后，用水漂洗結(jié)合在tmspma載玻片上的水凝膠并將其置于-20℃冷凍。待水凝膠凍實(shí)便可置于冷凍干燥機(jī)(fd－1a-50，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)里干燥成多孔支架。

(2)三維多孔支架芯片的捕獲抗體修飾及封閉

將捕獲抗體(如人白蛋白的捕獲抗體)滴加至三維多孔支架芯片上，4℃反應(yīng)過(guò)夜后，加入牛血清白蛋白(bsa)封閉液在室溫下封閉4個(gè)小時(shí)。用5mtris(ph7)緩沖液沖洗十分鐘三次后，將三維多孔支架芯片浸沒(méi)于25％(質(zhì)量體積比)的蔗糖溶液中置于-20℃冷凍，凍實(shí)后干燥。儲(chǔ)存于-20℃真空的環(huán)境儲(chǔ)存。

2、載樣板的制備過(guò)程如下：

(1)親疏水間隔模具

本實(shí)施例制備的親疏水間隔pdms模具可用于75mm×25mm的載玻片，使其形成16道2毫米寬、25毫米長(zhǎng)的親水通道，其余面積為疏水表面。將16條高2毫米、寬2.5毫米、長(zhǎng)30毫米的pmma塑料條以2毫米的間隔粘于一塊75毫米×30毫米的1毫米厚的pmma板，再將其置于10厘米直徑的培養(yǎng)皿內(nèi)制做成親疏水間隔模具的倒模。取出184siliconeelastomerkit有機(jī)硅彈性體中的聚硅氧烷彈性體(siliconeelastomer)和固化劑(curingagent)以10∶1的比例配制共22克的液態(tài)膠體，充分調(diào)勻。使用抽真空泵(shzd(iii)，鞏義市予華儀器有限公司)把配制好的液態(tài)膠體抽直至無(wú)氣泡存在。將無(wú)氣體的液態(tài)膠體緩緩倒入粘有pmma條的培養(yǎng)皿中，膠體需灌入pmma條之間的2毫米間隔，并整體膠體高度高于pmma條，即4毫米左右。把灌滿(mǎn)pdms的培養(yǎng)皿置于70攝氏度加熱4小時(shí)，使液態(tài)膠體充分交聯(lián)形成固體pdms模具。pdms凝固后，用刀片沿著底部75mm×30mm大小的pmma板割開(kāi)，慢慢把pdms從倒模具出揭下來(lái)，形成75毫米×30毫米并有17條2毫米高、2毫米寬、30毫米長(zhǎng)的突出的pdms模具。用透明膠把pdms模具上突出的橫條上的灰塵粘干凈。

(2)采用微接觸印刷術(shù)制作載樣板

這里采用載玻片作為基底，載玻片的大小為75mm×25mm×1mm。將載玻片進(jìn)行氧等離子體(plasma)親水處理。使用氧等離子體清潔儀(harrickplasma，pdc-32g)，rf為最高檔位。預(yù)先用真空泵抽氣1分鐘后，plasma處理1分鐘。在事先制備好的pdms模具上的突起橫條上均勻涂上10μl/條的1％十八烷基三氯硅烷(ots)(溶于正己烷)，晾干10秒。把涂好ots的pdms模具扣在plasma處理好的載玻片上，輕按20秒。晾干3分鐘。16通道(6列16排)的載樣板便制作完成。

由此獲得本發(fā)明的三維生物標(biāo)志物檢測(cè)裝置。

實(shí)施例2

除形成三維多孔支架的原料選用聚乙二醇、光引發(fā)劑、甘油、水，形成疏水材料選用ots以外，按照與實(shí)施例1相同的方式制備三維生物標(biāo)志物檢測(cè)裝置。

實(shí)施例3

除形成三維多孔支架的原料選用聚(n-異丙基丙烯酰胺)、光引發(fā)劑、甘油、水，形成疏水材料選用pdms以外，按照與實(shí)施例1相同的方式制備三維生物標(biāo)志物檢測(cè)裝置。

測(cè)試實(shí)施例1

應(yīng)用實(shí)施例1制備的三維生物標(biāo)志物檢測(cè)裝置檢測(cè)樣品中人白蛋白的濃度。

(1)人白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

從-20℃真空環(huán)境中取出修飾了人白蛋白的捕獲抗體的三維多孔支架芯片，待回溫至室溫后，從真空包裝中取出芯片。

分別將6微升、不同濃度(濃度梯度為0、1、10、20、50、100、200、1000、2000、10000、100000ng/ml)的人白蛋白溶液涂抹于載樣板中與三維多孔支架對(duì)應(yīng)的多個(gè)親水區(qū)域通道。

將芯片的每一排支架對(duì)準(zhǔn)載樣板上相對(duì)應(yīng)的載樣通道相扣上，在防蒸發(fā)的環(huán)境中，室溫孵育一個(gè)小時(shí)。用酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)的tris緩沖液(50mm,ph8.0)沖洗3次，于一張吸水紙上吸干多余水分。以同樣的方式在新的載樣板上涂抹辣根酶標(biāo)記的抗人白蛋白抗體，將吸干水分的芯片與之相扣，如孵育樣品一樣孵育一個(gè)小時(shí)后再度沖洗3次。

將芯片朝下(即支架朝下)架于酶標(biāo)儀檢測(cè)適配器(spectramaxm5/m5e，moleculardevices)上放入酶標(biāo)儀讀取450nm的吸收值，此為背景值。將芯片吸干多余水分后，與涂抹了辣根酶底物液的新載樣板扣上反應(yīng)15分鐘后，立即扣在涂抹了0.18m硫酸終止液的載樣板上，吸附在支架上的液體變成黃色。同樣將芯片朝下架于酶標(biāo)儀檢測(cè)適配器上放入酶標(biāo)儀讀取450nm的吸收值，此為信號(hào)值。

根據(jù)讀取數(shù)值，繪出人白蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(參見(jiàn)圖5a)。

(2)檢驗(yàn)人白蛋白樣品濃度的準(zhǔn)確性

為測(cè)試芯片檢測(cè)的準(zhǔn)確性，將6微升實(shí)際濃度為25、50、250、500、750ng/ml的人白蛋白溶液分別涂抹于實(shí)施例1制備的載樣板中與三維多孔支架對(duì)應(yīng)的多個(gè)親水區(qū)域通道。從-20℃真空環(huán)境中取出修飾了人白蛋白的捕獲抗體的三維多孔支架芯片，待回溫至室溫后，從真空包裝中取出芯片，與涂布了白蛋白溶液的載樣板相扣。其余按照與人白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備的相同步驟，讀取信號(hào)值。將信號(hào)值減去背景值即可得到絕對(duì)吸收值，套入圖5a中的人白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)換算出樣品濃度。參見(jiàn)圖5b，以實(shí)際濃度為橫軸，換算的樣品濃度為縱軸，如換算濃度完全相等于實(shí)際濃度(完全落在虛線(xiàn)上)既認(rèn)為檢測(cè)100％準(zhǔn)確。

(3)未知濃度的人白蛋白樣品檢測(cè)

從-20℃真空環(huán)境中取出修飾了人白蛋白的捕獲抗體的三維多孔支架芯片，待回溫至室溫后，從真空包裝中取出芯片。將6微升未知濃度的人白蛋白溶液涂抹于實(shí)施例1制備的載樣板的其中一個(gè)通道。其余按照與人白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備的相同步驟，讀取信號(hào)值。將信號(hào)值減去背景值即可得到絕對(duì)吸收值，套入圖5a中的人白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)即可換算樣品濃度。

測(cè)試實(shí)施例2

應(yīng)用實(shí)施例1制備的三維生物標(biāo)志物檢測(cè)裝置對(duì)乙酰氨基酚對(duì)heparg人肝癌細(xì)胞分泌人白蛋白量的影響進(jìn)行檢測(cè)。

以3000個(gè)細(xì)胞/孔的密度將heparg種植在三維的細(xì)胞培養(yǎng)芯片上(參考x.li,x.zhang,s.zhao,j.wang,g.liuandy.du,labonachip,2014,14,471-481)，用添加了10％胎牛血清、100u/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、2mmglutamax、0.5μm氫化可的松半琥酯和4μg/ml胰島素的william’se培養(yǎng)基在37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5天后，將三維細(xì)胞培養(yǎng)芯片上培養(yǎng)的細(xì)胞劃分為6組，分別加入20、10、5、2.5、1.25mm乙酰氨基酚和0.1％二甲基亞砜處理24小時(shí)。從-20℃真空環(huán)境中取出修飾了人白蛋白的捕獲抗體的三維多孔支架芯片，待回溫至室溫后，從真空包裝中取出芯片，將芯片與三維細(xì)胞培養(yǎng)芯片相扣，使三維多孔支架芯片和三維細(xì)胞培養(yǎng)芯片上細(xì)胞分泌的白蛋白進(jìn)行反應(yīng)。其余按照與人白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備的相同步驟，讀取信號(hào)值。將信號(hào)值減去背景值即可得到絕對(duì)吸收值，套入圖5a中的人白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)即可換算樣品濃度。將不同濃度的乙酰氨基酚處理的細(xì)胞所分泌的白蛋白量除以0.1％二甲基亞砜處理的細(xì)胞所分泌的白蛋白量以得到相對(duì)白蛋白表達(dá)量，參見(jiàn)圖6。

在本說(shuō)明書(shū)的描述中，參考術(shù)語(yǔ)“一個(gè)實(shí)施例”、“一些實(shí)施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實(shí)施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)包含于本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施例或示例中。在本說(shuō)明書(shū)中，對(duì)上述術(shù)語(yǔ)的示意性表述不必須針對(duì)的是相同的實(shí)施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例或示例中以合適的方式結(jié)合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以將本說(shuō)明書(shū)中描述的不同實(shí)施例或示例以及不同實(shí)施例或示例的特征進(jìn)行結(jié)合和組合。

盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，可以理解的是，上述實(shí)施例是示例性的，不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行變化、修改、替換和變型。