酶標(biāo)板包被液、封閉液及酶標(biāo)板制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于酶標(biāo)板包被技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及酶標(biāo)板包被液、酶標(biāo)板封閉液及預(yù)包 被酶標(biāo)板的制作方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)具有高靈敏 度、高特異性、易于標(biāo)準(zhǔn)化等諸多優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)療體外診斷、生命科學(xué)研究、食 品安全檢測等方面。
[0003] ELISA方法是利用了抗原與抗體的特異反應(yīng)以及酶與底物產(chǎn)生的顏色反應(yīng)，原理 為抗原或抗體與酶連接形成酶標(biāo)抗原或抗體，再與對應(yīng)的抗體或抗原反應(yīng)，然后通過酶與 底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，通過測定顏色的變化來進(jìn)行定性或定量測定，測定的對象可以是抗體 也可以是抗原。ELISA方法首先需要將抗原或抗體先結(jié)合在固相載體上，例如聚苯乙烯材質(zhì) 的酶標(biāo)板的微孔中，該過程稱為包被。商業(yè)化的ELISA試劑盒，在出廠之前酶標(biāo)板上就已經(jīng) 預(yù)先包被了抗原或抗體?？乖蚩贵w在酶標(biāo)板中的包被質(zhì)量，即包被在固相載體上的各微 孔中的抗原或抗體的均一度直接決定ELISA試劑盒的檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。
[0004] 抗原或抗體在酶標(biāo)板中的包被質(zhì)量受機(jī)器狀態(tài)、操作手法、包被條件、環(huán)境等因素 的影響，包被過程不可避免的會出現(xiàn)一定幾率的不合格的預(yù)包被酶標(biāo)板。而現(xiàn)有的預(yù)包被 酶標(biāo)板制作方法并不能在包被過程中對包被質(zhì)量進(jìn)行及時(shí)有效的檢測，常規(guī)的檢測方法是 等到包被過程完全結(jié)束后再利用與檢測指標(biāo)相對應(yīng)的成套試劑通過一次到數(shù)次的孵育、洗 板、顯色、終止等步驟才能明確預(yù)包被酶標(biāo)板的質(zhì)量，并且用于測試的預(yù)包被酶標(biāo)板也會因 為測試而報(bào)廢。
[0005] 常規(guī)的檢測方法并不能對不合格品進(jìn)行有效鑒別，不同預(yù)包被酶標(biāo)板質(zhì)量不均， 穩(wěn)定性得不到保障，從而影響檢測結(jié)果的穩(wěn)定性，檢測結(jié)果的穩(wěn)定性不夠是ELISA方法最糟 詬病的缺點(diǎn)之一，"試劑盒穩(wěn)定性"問題在國產(chǎn)ELISA試劑盒產(chǎn)品中尤為突出。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 因此，針對現(xiàn)有的預(yù)包被酶標(biāo)板制作方法不能對包被均一度進(jìn)行有效檢測的技術(shù) 問題，本發(fā)明目的在于提供一種酶標(biāo)板包被液和一種酶標(biāo)板封閉液以及一種配合使用所述 酶標(biāo)板包被液和所述酶標(biāo)板封閉液的可在包被制作過程中進(jìn)行包被均一度檢測的預(yù)包被 酶標(biāo)板的制作方法。
[0007] 本發(fā)明的酶標(biāo)板包被液含有的pH = 9.6的碳酸鹽緩沖溶液，還含有葡萄糖-6-磷酸 氫化酶。
[0008] 所述酶標(biāo)板包被液中，G-6-ro的酶活性為50~500UI/MG;G-6-ro的濃度為5~50μ g/L，優(yōu)選15~35yg/L，更優(yōu)選20~30yg/L，最優(yōu)選25yg/L。
[0009 ]本發(fā)明的酶標(biāo)板封閉液含有pH=8.0的磷酸鹽緩沖液、吐溫-20和BSA，還含有氧化 型輔酶和6-磷酸葡萄糖。
[0010] 所述酶標(biāo)板封閉液中，NADP+的濃度為0· 1~lmmol/L，優(yōu)選0· 15~0.5mol/L，更優(yōu) 選0 · 2~0 · 4mol/L，最優(yōu)選0 · 3mmol/L;G-6_P的濃度為0 · 05~lmmol/L，優(yōu)選0 · 08~0 · 4mmo 1 / 1^，更優(yōu)選0. lmmol/L。
[0011] 所述酶標(biāo)板封閉液中，吐溫-20的體積分?jǐn)?shù)為0.05%，BSA的濃度為0.5~5g/L，優(yōu) 選0.5~lg/L，更優(yōu)選0.5g/L。
[0012] 本發(fā)明的預(yù)包被酶標(biāo)板的制作方法，其包括步驟：
[0013] 1)用所述酶標(biāo)板包被液溶解待包被的抗體或抗原；
[0014] 2)步驟1)得到的酶標(biāo)板包被液加入待包被的酶標(biāo)板的各個(gè)微孔中，4 °C~37 °C包 被2~10小時(shí)；
[0015] 3)所述酶標(biāo)板用洗滌液洗2~5優(yōu)選3次，并拍干；
[0016] 4)向所述酶標(biāo)板的各個(gè)微孔中加入所述酶標(biāo)板封閉液，37°C (封閉1~2小時(shí)，然后 棄去封閉液、拍干、烘干；
[0017] 步驟4)中酶標(biāo)板封閉液封閉0.5~2小時(shí)后檢測所述酶標(biāo)板的包被均一度。
[0018]步驟1)中溶解后抗體或抗原在所述酶標(biāo)板包被液中的濃度為0.1~10yg/mL，優(yōu)選 1 ~5yg/mL，更優(yōu)選 2yg/mL。
[0019] 步驟2)中所述酶標(biāo)板包被液的加入量為50~100μL孔;步驟3)中，所述洗滌液用 量為350yL/孔/次;步驟4)所述酶標(biāo)板封閉液的加入量為250yL/孔。
[0020] 步驟3)中所述洗滌液可選用通用試劑盒洗滌液，比如含有0.05%吐溫-20的磷酸 鹽緩沖溶液。
[0021] 步驟4)中檢測所述酶標(biāo)板的包被均一度具體是將所述酶標(biāo)板各個(gè)微孔內(nèi)封閉液 在340nm波長處的吸光度，計(jì)算各個(gè)微孔吸光度的變異系數(shù)，所述變異系數(shù)反映所述酶標(biāo)板 的包被均一度。
[0022] 本發(fā)明關(guān)鍵在于利用G-6-PD、G-6-P和NADP+這一組化合物之間的特異性反應(yīng)，G-6-PD可使G-6-P釋放出H+，同時(shí)NADP+還原成還原型輔酶(NADPH)，而利用NADPH在340nm波長 處的特征吸收，可進(jìn)行精確檢測NADPH的量，進(jìn)而可精確檢測G-6-PD的量。
[0023]本發(fā)明的預(yù)包被酶標(biāo)板的制作方法，首先使用添加有G-6-ro的酶標(biāo)板包被液進(jìn)行 包被，在包被過程中G-6-PD與待包被的抗原或抗體一同包被，在包被并洗滌完后進(jìn)行封閉 時(shí)，使用添加有NADP+和G-6-P的酶標(biāo)板封閉液，G-6-H)可使G-6-P釋放出H+，同時(shí)NADP+還原 成NADPH。在封閉過程中或封閉完成時(shí)使用酶標(biāo)儀檢測酶標(biāo)板中各個(gè)微孔中的酶標(biāo)板封閉 液在340nm波長處的吸光度，測得的吸光度即可反映各個(gè)微孔中NADPH的量，也就間接反映 各個(gè)微孔中包被的G-6-PD的量，再根據(jù)各個(gè)微孔的吸光度計(jì)算酶標(biāo)板的變異系數(shù)，所述變 異系數(shù)即反映了 G-6-PD的包被均一度，進(jìn)而可反映一同包被的抗原或抗體的包被均一度， 變異系數(shù)越小，包被均一度越高，以此實(shí)現(xiàn)了酶標(biāo)板包被質(zhì)量的檢測。另外，產(chǎn)生的NADPH具 有抗氧化性可以提高預(yù)包被酶標(biāo)板在保存過程中的穩(wěn)定性。
[0024]本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于:本發(fā)明的預(yù)包被酶標(biāo)板的制作方法可在預(yù)包被酶標(biāo) 板的制作過程中，即封閉過程中，通過測定酶標(biāo)板微孔內(nèi)的酶標(biāo)板封閉液的吸光度來對抗 原或抗體的包被均一度進(jìn)行無損檢測，及時(shí)檢測預(yù)包被酶標(biāo)板的質(zhì)量，對不合格的預(yù)包被 酶標(biāo)板進(jìn)行鑒別，不僅可保證預(yù)包被酶標(biāo)板的品質(zhì)，而且檢測過程不影響預(yù)包被酶標(biāo)板的 后續(xù)使用。
【附圖說明】
[0025] 圖1為實(shí)施例1中的常規(guī)檢測方法的檢測數(shù)據(jù)對比圖。
[0026] 圖2為實(shí)施例2中的牛奶樣品中AFM1的檢測數(shù)據(jù)對比圖。
[0027]圖3為實(shí)施例3中的玉米粉樣品中AFB1的檢測數(shù)據(jù)對比圖。
[0028] 圖4為實(shí)施例4中的全脂乳清粉樣品中葉酸的檢測數(shù)據(jù)對比圖。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 實(shí)例1鏈霉親和素預(yù)包被酶標(biāo)板的制作
[0030] 1.1試劑配置
[0031] 制作過程需要使用到的試劑包括酶標(biāo)板包被液、洗滌液和封閉液，可根據(jù)表1中的 成分及參數(shù)或含量進(jìn)行配置。
[0032] 表 1
[0034] 1.2制作步驟
[0035] 1)用酶標(biāo)板包被液溶解鏈霉親和素，鏈霉親和素濃度為2yg/mL;
[0036] 2)向待包被的96孔的酶標(biāo)板的各微孔中加入溶有鏈霉親和素的酶標(biāo)板包被液 (100μL孔），4°C包被過夜；
[0037] 3)用洗滌液洗板3次(350μ!7孔/次），并拍干；
[0038] 4)加入封閉液(250μ!7孔），37 °C封閉2小時(shí);使用酶標(biāo)儀檢測酶標(biāo)板各個(gè)微孔內(nèi)封 閉液在340nm波長處的吸光度，根據(jù)測得的各個(gè)微孔的吸光度計(jì)算出酶標(biāo)板的變異系數(shù)，變 異系數(shù)超過5%的計(jì)為不合格。棄去封閉液、拍干、烘干(37°C，lh)即得預(yù)包被酶標(biāo)板，真空 干燥包裝，避光保存。
[0039] 1.3效果檢驗(yàn)
[0040] 不合格產(chǎn)品檢出：共包被酶標(biāo)板50塊，其中2塊變異系數(shù)超過5%，不合格率為4%。
[0041] 分別取一塊合格和不合格的預(yù)包被酶標(biāo)板，用常規(guī)檢測方法進(jìn)行包被均一度檢 測，即分別使用生物素標(biāo)記辣根過氧化物酶對鏈霉親和素的包被均一度進(jìn)行檢測。
[0042] 步驟為：
[0043 ] A、將生物素標(biāo)記辣根過氧化物酶溶液用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)稀釋10000倍，然后 加入到酶標(biāo)板的各孔中（1〇〇μLν孔），37°C避光孵育30分鐘。
[0044] B、使用洗滌液洗滌酶標(biāo)板3次，并拍干。
[0045] C、加入3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色液（1 OOyL/孔），37°C避光顯色15分鐘。 [0046] D、使用1M的硫酸作為終止液（lOOyL/孔），終止顯色反應(yīng)。
[0047] Ε、檢測450nm波長的吸光度，計(jì)算變異系數(shù)。
[0048]如圖1所示，經(jīng)本發(fā)明篩選，結(jié)果為合格的預(yù)包被酶標(biāo)板變異系數(shù)為4.33%，不合 格的預(yù)包被酶標(biāo)板變異系數(shù)為7.82%，說明通過本發(fā)明篩選的酶標(biāo)板包被更為均勻。
[0049] 實(shí)施例2黃曲霉毒素 Ml單克隆抗體預(yù)包被酶標(biāo)板的制作
[0050] 2.1試劑配置
[0051]根據(jù)表2中的成分及參數(shù)或含量配置酶標(biāo)板包被液、洗滌液和封閉液 [0052]表 2
[0054] 2.2制作步驟
[0055] 參考實(shí)施例1，區(qū)別在于步驟1)中鏈霉親和素代替為AFM1單克隆抗體，AFM1單克隆 抗體濃度為0.5y