免疫測(cè)定待測(cè)組分的方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】
[00011 本申請(qǐng)為國(guó)際申請(qǐng)PCT/JP2007/071344于2009年6月25日進(jìn)入中國(guó)國(guó)家階段、申請(qǐng) 號(hào)為200780048145.7、發(fā)明名稱(chēng)為"免疫測(cè)定待測(cè)組分的方法"的分案申請(qǐng)。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及免疫測(cè)定含有血紅蛋白，免疫測(cè)定試劑的樣品中的待測(cè)組分的方法， 以及抑制血紅蛋白在免疫測(cè)定方法中的干擾的方法。
【背景技術(shù)】
[0003] 在免疫測(cè)定血液中的存在于血細(xì)胞，如紅細(xì)胞和白細(xì)胞外的待測(cè)組分的方法中， 將通過(guò)從全血中除去血細(xì)胞而制得的血清或血漿用作樣品。然而，由于血細(xì)胞的去除需要 特殊設(shè)備，如離心機(jī)，并且比較麻煩，因此已經(jīng)有建議用全血作為樣品的測(cè)定方法(見(jiàn)專(zhuān)利 文獻(xiàn)1)。當(dāng)用全血作為樣品時(shí)，存在著測(cè)量受到樣品中因溶血而污染的血細(xì)胞組分，如血紅 蛋白或血細(xì)胞膜組分干擾的問(wèn)題。這些組分影響光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)，抑制免疫反應(yīng)，并且還吸附 待測(cè)物質(zhì)?，F(xiàn)在已有一些關(guān)于用全血作為樣品進(jìn)行免疫測(cè)定的方法的報(bào)道，這些方法未伴 有溶血避免了這些問(wèn)題(見(jiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn)2，3，4和5)。
[0004] 當(dāng)測(cè)量血細(xì)胞中的組成，如細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)時(shí)，必須將血細(xì)胞溶解，因此不能使用 沒(méi)有伴有溶血的上述方法。在這種情況下，使用的方法包括用流式細(xì)胞術(shù)分離感興趣的血 細(xì)胞，然后將分離出的細(xì)胞溶解，并測(cè)量血細(xì)胞中的預(yù)期組分，但這些方法需要特殊設(shè)備進(jìn) 行流式細(xì)胞術(shù)，并且比較麻煩。
[0005] 另一方面，作為測(cè)量細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的便利方法的例子，將用表面活性劑制備的全 血中的血細(xì)胞溶解物作為測(cè)量樣品免疫測(cè)定MxA蛋白的方法已有報(bào)道(非專(zhuān)利文獻(xiàn)1和2)。
[0006] [專(zhuān)利文獻(xiàn)1]日本專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)亻_(kāi)平No.(jp-A)H1〇-48214(未審查，公開(kāi)的日本專(zhuān)利 申請(qǐng)）
[0007] [專(zhuān)利文獻(xiàn) 2]JP-A(特開(kāi)平)H06-265554
[0008] [專(zhuān)利文獻(xiàn)3]W0 96/04558
[0009] [專(zhuān)利文獻(xiàn)4]W0 〇2/732〇3
[0010] [專(zhuān)利文獻(xiàn) 5] JP-A(特開(kāi)平）2004-45395
[0011] [非專(zhuān)利文獻(xiàn) 1 ] Journal of Interferon Research，（USA)，1992，Vol · 12，No · 2， p.67-74
[0012] [非專(zhuān)利文獻(xiàn)2]Pediatric Research，（USA)，1997，Vol · 41，No · 5，p · 647-650

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013][本發(fā)明要解決的問(wèn)題]
[0014]本發(fā)明的目的是提供免疫測(cè)定含血紅蛋白樣品中的待測(cè)組分，以抑制血紅蛋白干 擾的方法和試劑，以及在免疫測(cè)定含血紅蛋白樣品中的待測(cè)組分的方法中抑制血紅蛋白干 擾的方法。
[0015][解決問(wèn)題的手段]
[0016] 本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在免疫測(cè)定樣品中的待測(cè)組分的方法中，所述組分可以通 過(guò)在膽汁酸衍生物存在下與能與所述組分結(jié)合的抗體反應(yīng)而精確測(cè)量，所述膽汁酸衍生物 不同于所述樣品中所固有的膽汁酸衍生物，因此完成了本發(fā)明。更具體地，本發(fā)明涉及以下
[0017] [1]免疫測(cè)定含血紅蛋白樣品中的待測(cè)組分的方法，其包括在與所述樣品中所固 有的膽汁酸衍生物不同的膽汁酸衍生物存在下使待測(cè)組分與能結(jié)合所述組分的抗體反應(yīng)。
[0018] [2]根據(jù)[1]的方法，其包括使含血紅蛋白樣品中的待測(cè)組分進(jìn)一步在聚氧乙烯非 離子型表面活性劑存在下與能結(jié)合所述組分的抗體反應(yīng)。
[0019 ] [ 3 ]根據(jù)[1 ]或[2 ]的方法，其中免疫測(cè)定的方法是夾心法或競(jìng)爭(zhēng)法。
[0020] [4]根據(jù)[1]或[2]的方法，其中使組分與能結(jié)合所述組分的抗體反應(yīng)是：
[0021] (1)使所述組分與能結(jié)合所述組分的第一抗體和能結(jié)合所述組分的標(biāo)記第二抗體 反應(yīng)，
[0022] (2)使所述組分與標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)和既能結(jié)合所述組分又能結(jié)合所述競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì) 的抗體反應(yīng)，或
[0023] (3)使所述組分與競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)和既能結(jié)合所述組分又能結(jié)合所述競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)的標(biāo) 記抗體反應(yīng)。
[0024] [5]根據(jù)[1]_[4]任一項(xiàng)的方法，其中不同于樣品中所固有的膽汁酸衍生物的膽汁 酸衍生物是具有兩性表面活性劑功能的膽汁酸衍生物。
[0025] [6][1]_[4]任一項(xiàng)的方法，其中不同于樣品中所固有的膽汁酸衍生物的膽汁酸衍 生物是具有非離子型表面活性劑功能的膽汁酸衍生物。
[0026] [7][5]的方法，其中具有兩性表面活性劑功能的膽汁酸衍生物是3_[(3_膽酰胺丙 基)二甲銨]丙磺酸鹽（以下簡(jiǎn)稱(chēng)為CHAPS)或3_[ (3-膽酰胺丙基)二甲銨]-2-羥基丙磺酸鹽 (以下簡(jiǎn)稱(chēng)為CHAPS0)。
[0027] [8]根據(jù)[6]的方法，其中具有非離子型表面活性劑功能的膽汁酸衍生物是N，N_雙 (3-D-葡糖酰胺丙基)膽酰胺（以下簡(jiǎn)稱(chēng)為BIGCHAP)或N，N-雙(3-D-葡糖酰胺丙基)脫氧膽酰 胺（以下簡(jiǎn)稱(chēng)為脫氧-BIGCHAP)。
[0028] [9]根據(jù)[2]_[8]任一項(xiàng)的方法，其中聚氧乙烯非離子型表面活性劑是聚氧乙烯烷 基苯基醚。
[0029] [10]根據(jù)[1]-[9]任一項(xiàng)的方法，其中樣品是全血。
[0030] [11]根據(jù)[1]-[10]任一項(xiàng)的方法，其中待測(cè)組分是MxA蛋白。
[0031] [12]含血紅蛋白樣品中的待測(cè)組分的免疫測(cè)定試劑，其包括膽汁酸衍生物和選自 以下（1)-(3)的組分：
[0032] (1)能結(jié)合所述組分的第一抗體和能結(jié)合所述組分的標(biāo)記第二抗體；
[0033] (2)標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)和既能結(jié)合所述組分又能結(jié)合所述競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)的抗體;以及
[0034] (3)競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)和既能結(jié)合所述組分又能結(jié)合所述競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)的標(biāo)記抗體。
[0035] [13]根據(jù)[12]的試劑，還包括聚氧乙烯非離子型表面活性劑。
[0036] [14]根據(jù)[12]或[13]的試劑，其中膽汁酸衍生物是具有兩性表面活性劑功能的膽 汁酸衍生物。
[0037] [15]根據(jù)[12]或[13]的試劑，其中膽汁酸衍生物是具有非離子型表面活性劑功能 的膽汁酸衍生物。
[0038] [16]根據(jù)[14]的試劑，其中具有兩性表面活性劑功能的膽汁酸衍生物是CHAPS或 CHAPS0〇
[0039] [17]根據(jù)[15]的試劑，其中具有非離子型表面活性劑功能的膽汁酸衍生物是 BIGCHAP 或脫氧-BIGCHAP。
[0040] [18]根據(jù)[13]-[17]任一項(xiàng)的試劑，其中聚氧乙烯非離子型表面活性劑是聚氧乙 稀烷基苯基釀。
[0041] [19]在免疫測(cè)定含血紅蛋白樣品中的待測(cè)組分中抑制血紅蛋白干擾的方法，其包 括在不同于樣品中所固有的膽汁酸衍生物的膽汁酸衍生物存在下使含血紅蛋白樣品中的 待測(cè)組分與能結(jié)合所述組分的抗體反應(yīng)。
[0042] [20]根據(jù)[19]的方法，其中不同于樣品中所固有的膽汁酸衍生物的膽汁酸衍生物 是具有兩性表面活性劑功能的膽汁酸衍生物。
[0043] [21]根據(jù)[19]的方法，其中不同于樣品中所固有的膽汁酸衍生物的膽汁酸衍生物 是具有非離子型表面活性劑功能的膽汁酸衍生物。
[0044] [22]根據(jù)[20]的方法，其中具有兩性表面活性劑功能的膽汁酸衍生物是CHAPS或 CHAPS0〇
[0045] [23]根據(jù)[21]的方法，其中具有非離子型表面活性劑功能的膽汁酸衍生物是 BIGCHAP 或脫氧-BIGCHAP。
[0046] [24]根據(jù)[19]-[23]任一項(xiàng)的方法，其包括使含血紅蛋白樣品中的待測(cè)組分進(jìn)一 步在聚氧乙烯非離子型表面活性劑存在下與能結(jié)合所述組分的抗體反應(yīng)。
[0047][本發(fā)明的效果]
[0048]本發(fā)明提供了使含血紅蛋白樣品中的待測(cè)組分能得以準(zhǔn)確測(cè)量的免疫測(cè)定方法 及用于該方法的試劑，還提供了在免疫測(cè)定含血紅蛋白樣品中的待測(cè)組分的方法中抑制血 紅蛋白干擾的方法。
[0049]本發(fā)明的最佳實(shí)施方式
[0050] (1)含血紅蛋白的樣品
[0051] 本發(fā)明的免疫測(cè)定方法中使用的含血紅蛋白樣品的例子包括含有血紅蛋白的樣 品和懷疑含有血紅蛋白的樣品。含有血紅蛋白的樣品和懷疑含有血紅蛋白的樣品的例子包 括全血，由全血制備的含紅細(xì)胞的血細(xì)胞級(jí)分，懷疑溶血的血漿或血清，紅細(xì)胞和添加了血 紅蛋白的任意樣品。關(guān)于全血，可以使用采集自受試者的血液本身和已處理的血液，優(yōu)選已 處理的血液。這樣處理的例子包括抗凝處理和溶血處理，這些處理可以組合使用。
[0052] 在待測(cè)組分為血細(xì)胞的胞內(nèi)組分的情況下，全血優(yōu)選為經(jīng)溶血處理的血液，尤其 優(yōu)選為經(jīng)抗凝和溶血兩種處理的血液。抗凝處理的例子包括向采集的血液中加入EDTA，肝 素等的處理。溶血處理的例子包括加入表面活性劑或皂苷溶液，與低滲溶液混合，凍融和超 聲。
[0053] (2)待測(cè)組分
[0054]本發(fā)明中的待測(cè)組分不受特別限制，只要其是可能含有血紅蛋白的樣品中的組分 即可，組分的例子包括核酸，蛋白質(zhì)，脂質(zhì)，維生素和多糖。核酸的例子包括DNA，RNA，ATP， ADP，AMP和cAMP。蛋白質(zhì)的例子包括酶，激素和各種類(lèi)型的肽。
[0055]本發(fā)明中的優(yōu)選組分包括細(xì)胞內(nèi)含有的物質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)由各種細(xì)胞因子，如干擾素 誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。
[0056]組分的具體例子是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)由I-型干擾素誘導(dǎo)產(chǎn)生的MxA蛋白（Mol.Cell.Biol.， 9,5062-5072,1989；J.Virol.64,1171-1181,1990)〇
[0057] (3)膽汁酸衍生物
[0058] 本發(fā)明中的膽汁酸衍生物是與樣品中所固有的膽汁酸衍生物不同的膽汁酸衍生 物。與樣品中所固有的膽汁酸衍生物不同的膽汁酸衍生物不受特別限制，只要其是能促成 本發(fā)明的免疫測(cè)定方法和抑制血紅蛋白干擾的方法的膽汁酸衍生物即可，優(yōu)選為具有兩性 表面活性劑功能或非離子型表面活性劑功能的膽汁酸衍生物。
[0059] 具有兩性表面活性劑功能的膽汁酸衍生物的例子包括3_[(3_膽酰胺丙基）二甲 銨]丙磺酸鹽（以下簡(jiǎn)稱(chēng)為CHAPS)和3_[(3_膽酰胺丙基)二甲銨]-2-羥基丙磺酸鹽（以下簡(jiǎn) 稱(chēng)為 CHAPS0)。
[0060] 具有非離子型表面活性劑功能的膽汁酸衍生物的例子包括N，N_雙(3-D-葡糖酰胺 丙基)膽酰胺（以下簡(jiǎn)稱(chēng)為BIGCHAP)和N，N-雙(3-D-葡糖酰胺丙基)脫氧膽酰胺（以下簡(jiǎn)稱(chēng)為 脫氧-BIGCHAP)。
[0061] 膽汁酸衍生物顯示出抑制血紅蛋白在待測(cè)組分與能結(jié)合該組分的抗體的反應(yīng)中 的干擾的效果，尤其是，優(yōu)選使用CHAPS，CHAPSO，BIGCHAP和脫氧-BIGCHAP。
[0062] 膽汁酸衍生物以臨界膠束濃度（cmc)的1至50倍的濃度范圍使用，尤其優(yōu)選cmc濃 度的1至10倍。在本發(fā)明中，膽汁酸衍生物可以單獨(dú)使用（一種類(lèi)型），或者可以?xún)煞N或兩種 以上類(lèi)型的膽汁酸衍生物組合的形式使用。
[0063] (4)聚氧乙烯非離子型表面活性劑
[0064] 聚氧乙烯非離子型表面活性劑在本發(fā)明的免疫測(cè)定方法中起增強(qiáng)測(cè)量靈敏度的 作用，其優(yōu)選在免疫反應(yīng)期間存在。
[0065]本發(fā)明中的聚氧乙烯非離子型表面活性劑的例子包括聚氧乙烯烷基苯基醚，聚氧 乙稀烷基釀和聚氧乙稀脫水山梨糖醇脂肪酸醋，優(yōu)選聚氧乙稀烷基苯基釀。聚氧乙稀烷基 苯基醚中的烷基的例子包括辛基和壬基。聚氧乙烯烷基苯基醚的具體例子(市場(chǎng)上可以買(mǎi) 到的產(chǎn)品）是Nonidet P-40(聚氧乙稀壬基苯基醚）。
[0066]在本發(fā)明中，聚氧乙烯非離子型表面活性劑可以單獨(dú)使用（一種類(lèi)型），或者可以 兩種或兩種以上類(lèi)型的聚氧乙烯非離子型表面活性劑組合的形式使用。在本發(fā)明的免疫測(cè) 定方法中，聚氧乙烯非離子型表面活性劑的濃度優(yōu)選為0.01 %_2.0%，更優(yōu)選0.05%-1.8%，尤其優(yōu)選0.1%-1.4%。
[0067] (5)抗體和標(biāo)記抗體
[0068] 本發(fā)明的免疫測(cè)定方法中所使用的抗體不受特殊限制，只要其為特異性結(jié)合待測(cè) 組分的抗體即可;并且，可以使用多克隆抗體或單克隆抗體，但優(yōu)選單克隆抗體。此外，本發(fā) 明中使用的抗體包括抗體片段。具體例子包括除去了 Fc部分的抗體片段，如通過(guò)將抗體用 木瓜蛋白酶處理后得到的Fab，通過(guò)胃蛋白酶處理得到的F(ab '）2和通過(guò)胃蛋白酶處理及還 原處理得到的Fab '。尤其是，優(yōu)選抗體片段為F(ab '）2。
[0069] 本發(fā)明中所使用的抗體可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法用待測(cè)組分或其部分作為抗原獲得，也 可以使