專利名稱：檢測(cè)牛腸道病毒和口蹄疫病毒的核苷酸序列和檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測(cè)牛腸道病毒和口蹄疫病毒的核苷酸序列和檢測(cè)試劑盒，尤指多重 RT-PCR檢測(cè)牛腸道病毒和口蹄疫病毒的檢測(cè)核苷酸序列和試劑盒，不僅適用于對(duì)動(dòng)物組織樣本的準(zhǔn)確檢測(cè)，還可適用于動(dòng)物活體樣本(咽喉拭子、肛門拭子、糞便、血清、皰疹皮、皰疹液、眼結(jié)膜分泌物等)的檢測(cè)，可用于牛腸道病毒的國(guó)內(nèi)篩查和出入境檢疫，以及牛腸道病毒和口蹄疫病毒的同時(shí)檢測(cè)和鑒別診斷等，屬于動(dòng)物疫病檢測(cè)、檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
牛腸道病毒和口蹄疫病毒都是小RNA病毒科成員。小RNA病毒是一個(gè)極為繁雜的病毒科，可分為鼻病毒屬、口蹄疫病毒屬、腸道病毒屬、心病毒屬和甲肝病毒屬等5個(gè)屬，共 200多種病毒，能引起人和動(dòng)物的多種疾病，如甲肝、口蹄疫等，在醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)研究中均具有重大意義。腸道病毒是脊椎動(dòng)物腸道中原有的棲居者，病原性不明顯，通常引起輕度或不顯性感染，但常因侵犯其他器官而引起各種臨床綜合征，或者在一定條件下引發(fā)顯著癥狀，例如牛腸道病毒、豬腸道病毒、禽腸道病毒、人腸道病毒等等。2005年初北京的牛場(chǎng)中發(fā)生牛腸道病毒感染，嚴(yán)重影響了畜牧業(yè)生產(chǎn)。部分牛場(chǎng)的產(chǎn)奶牛普遍(約80%)出現(xiàn)了嚴(yán)重腹瀉癥狀水樣腹瀉，有泡沫，少數(shù)(10-15%)嚴(yán)重的還有鮮血，體溫變化不明顯，食欲下降，基本沒有死亡，但產(chǎn)奶量大幅下降(約30%)。約兩周后康復(fù)，康復(fù)后大多數(shù)奶牛的產(chǎn)奶量不能恢復(fù)到病前的水平，特別是日產(chǎn)35千克以上高產(chǎn)奶牛。嚴(yán)重降低了生產(chǎn)性能，并且還有污染奶制品的可能。據(jù)跟蹤調(diào)查，該病兩年發(fā)生一次。 我們?cè)诎l(fā)病的牛場(chǎng)中已經(jīng)分離到了牛腸道病毒。隨著豬鏈球菌2型病和高致病性藍(lán)耳病的相繼爆發(fā)，條件性致病菌/病毒對(duì)畜牧業(yè)生產(chǎn)和公共衛(wèi)生安全方面的威脅，或者說潛在的危險(xiǎn)也逐漸為人們所認(rèn)識(shí)。因此我們認(rèn)為隨著人們對(duì)牛腸道病毒認(rèn)識(shí)的加深和對(duì)公共衛(wèi)生安全的重視日益加強(qiáng)，牛腸道病毒很有可能在將來被列為法檢項(xiàng)目，在這種情況下我們提前針對(duì)牛腸道病毒建立快速、準(zhǔn)確、敏感的診斷方法，進(jìn)行技術(shù)儲(chǔ)備顯得格外重要，因此開展了牛腸道病毒快速檢測(cè)技術(shù)研究?？谔阋卟《究梢愿腥九继銊?dòng)物引起急性、熱性、接觸性傳染病，最易感染的動(dòng)物是黃牛、水牛、豬、駱駝、羊、鹿等，黃羊、麝、野豬、野牛等野生動(dòng)物也易感染此病。本病以牛最易感染，羊的感染率低。口蹄疫在亞洲、非洲和中東以及南美均有流行，在非流行區(qū)也有散發(fā)病例?？谔阋甙l(fā)病后一般不致死，但會(huì)使病獸的口、蹄部出現(xiàn)大量水皰，高燒不退，使實(shí)際畜產(chǎn)量銳減。另外，有個(gè)別口蹄疫病毒的變種可傳染給人。因此，每次爆發(fā)后只能屠宰和集體焚毀染病牲畜以絕后患。由于口蹄疫傳播迅速、難于防治、補(bǔ)救措施少，被稱為畜牧業(yè)的 “頭號(hào)殺手”。牛腸道病毒與口蹄疫病毒同屬于小RNA病毒科成員，在形態(tài)結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成、部分理化性質(zhì)和對(duì)環(huán)境的抵抗力方面有很多相近之處，而國(guó)外研究報(bào)道了多起牛腸道病毒與口蹄疫病毒同時(shí)分離到的病例，因此針對(duì)牛腸道病毒和口蹄疫病毒建立鑒別診斷方法也具有重大意義。在檢驗(yàn)檢疫過程中，快速、準(zhǔn)確、敏感的診斷是檢測(cè)疫病的關(guān)鍵所在。多重PCR可以同時(shí)區(qū)別鑒定兩種或兩種以上的病原，操作也比較簡(jiǎn)單易行，具有高效性、系統(tǒng)性和經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便性等特點(diǎn)，適用于多種病原的鑒別診斷。因此我們針對(duì)牛腸道病毒基因和口蹄疫病毒基因建立多重RT-PCR快速檢測(cè)技術(shù)，用于牛腸道病毒和口蹄疫病毒的鑒別診斷。這種檢測(cè)方法的建立將為我國(guó)出入境牛腸道病毒和口蹄疫病毒的檢驗(yàn)檢疫奠定良好的技術(shù)基礎(chǔ)，可在各口岸和各養(yǎng)殖企業(yè)推廣應(yīng)用，以及時(shí)檢出牛腸道病毒和口蹄疫病毒，保障公共衛(wèi)生安全，保障我國(guó)牛及其產(chǎn)品進(jìn)出口貿(mào)易的正常進(jìn)行，推動(dòng)外貿(mào)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。一般PCR僅應(yīng)用一對(duì)引物，通過 PCR擴(kuò)增產(chǎn)生一個(gè)核酸片段，主要用于單一致病因子等的鑒定。多重PCR(multiplex PCR)，又稱多重引物PCR或復(fù)合PCR，它是在同一 PCR反應(yīng)體系里加上兩對(duì)以上引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段的PCR反應(yīng)，其反應(yīng)原理，反應(yīng)試劑和操作過程與一般PCR相同。多重PCR的用途主要有兩方面1、多種病原微生物的同時(shí)檢測(cè)或鑒定；2、病原微生物、某些遺傳病及癌基因的分型鑒定。多種病原微生物的同時(shí)檢測(cè)或鑒定，是在同一 PCR 反應(yīng)管中同時(shí)加上多種病原微生物的特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增?？捎糜谕瑫r(shí)檢測(cè)多種病原體或鑒定出是那一型病原體感染，可系統(tǒng)組合的有①肝炎病毒的感染，在同一病人或同一供血者體內(nèi)，有時(shí)存在多種肝炎病毒重疊感染，有時(shí)是甲乙丙型肝炎病毒重疊；有時(shí)可能是甲乙型肝炎病毒重疊；有時(shí)是乙丙型肝炎病毒重疊。②腸道致病性細(xì)菌的檢測(cè)，如傷寒，痢疾和霍亂，有時(shí)具有較相同的腸道癥狀，有時(shí)痢疾霍亂同存一病人并同時(shí)發(fā)病。③性病的檢測(cè)，如梅毒，淋病及艾滋病的診斷。④戰(zhàn)傷細(xì)菌及生物戰(zhàn)劑細(xì)菌的檢測(cè)，如破傷風(fēng)桿菌，產(chǎn)氣莢膜桿菌，炭疽桿菌，鼠疫桿菌等偵檢。⑤需特殊培養(yǎng)的無芽胞厭氧菌，如脆弱類桿菌、艱難桿菌的鑒定等。某些病原微生物，某些遺傳病或癌基因，型別較多，或突變或缺失存在多個(gè)好發(fā)部位，多重PCR可提高其檢出率并同時(shí)鑒定其型別及突變等可系統(tǒng)應(yīng)用的有乙型肝炎病毒的分型；乳頭瘤病毒的分型；單純皰疹病毒的分型；杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥的分型及癌基因的檢測(cè)等。多重PCR的特點(diǎn)有1、高效性，它是在同一PCR反應(yīng)管中同時(shí)加上多種病原微生物的特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可用于同時(shí)檢測(cè)多種病原體或鑒定出是哪一型病原體感染； 2、系統(tǒng)性，多重PCR很適宜于成組病原體的檢測(cè)，如肝炎病毒、腸道致病性細(xì)菌等的同時(shí)偵檢；3、經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便性，多種病原體在同一反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)檢出，大大的節(jié)省時(shí)間，節(jié)省試劑，節(jié)約經(jīng)費(fèi)開支，為臨床提供更多更準(zhǔn)確的診斷信息。因此近年來，多重PCR在獸醫(yī)診斷、檢測(cè)領(lǐng)域得到了大量應(yīng)用。本發(fā)明首次將多重PCR技術(shù)應(yīng)用于牛腸道病毒和口蹄疫病毒的同時(shí)檢測(cè)和鑒別診斷領(lǐng)域，提供了針對(duì)牛腸道病毒和口蹄疫病毒的特異性引物序列、試劑盒和檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一組特異性強(qiáng)、靈敏度高的同時(shí)鑒別、檢測(cè)牛腸道病毒和口蹄疫病毒的核苷酸序列，包括2對(duì)引物序列。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供快速、準(zhǔn)確、使用方便的同時(shí)鑒別、檢測(cè)牛腸道病毒和口蹄疫病毒的多重PCR檢測(cè)試劑盒。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案
選擇牛腸道病毒和口蹄疫病毒5’ -非編碼區(qū)基因序列作為靶區(qū)域，在多重序列比對(duì)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。引物長(zhǎng)度為20個(gè)堿基左右，GC含量為50%—60%，引物內(nèi)無二級(jí)結(jié)構(gòu)和重復(fù)性，引物間和引物內(nèi)無互補(bǔ)序列，引物間的熔解溫度(Tm值)相差小于5°C。一組檢測(cè)牛腸道病毒的核苷酸序列，如下
1)5，-GGG GAG TAG TCC GAC TCC GC—3，(SEQ ID NO 1)
2)5，- CRG AGC TAC CAC YGG GDff TGT GG -3，(SEQ ID NO 2)
R代表嘌呤，此處為A或G ;Y代表嘧啶，此處為T或C ;D代表A或G或T ； W代表A或
T ；
一組檢測(cè)口蹄疫病毒的核苷酸序列，如下
3)5，-GCC TGG TCT TTC CAG GTC T -3，(SEQ ID NO 3)
4)5，- CCA GTC CCC TTC TCA GAT C -3，(SEQ ID NO 4)
其中序列1)和2)分別為檢測(cè)牛腸道病毒的正義引物和反義引物，序列3)和4)分別為檢測(cè)口蹄疫病毒的正義引物和反義引物。我們采用多重PCR檢測(cè)技術(shù)建立了同時(shí)檢測(cè)牛腸道病毒和口蹄疫病毒的檢測(cè)方法，對(duì)反應(yīng)的各種條件進(jìn)行了優(yōu)化，其中包括引物的篩選，Mg2+使用濃度的優(yōu)化，引物濃度的優(yōu)化，反應(yīng)體系的確定等。由于使用RT-PCR固體酶顆粒體系與使用反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV+ Taq 酶體系都能檢測(cè)出牛腸道病毒和口蹄疫病毒，而且靈敏度一致，所以兩種體系均可以應(yīng)用于檢測(cè)。使用RT-PCR固體酶顆粒體系成本較高但操作簡(jiǎn)單，使用反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV+ Taq酶體系操作較復(fù)雜但成本比較低?？梢愿鶕?jù)需要，選擇檢測(cè)試劑盒的組成。本發(fā)明提供的一種檢測(cè)牛腸道病毒和口蹄疫病毒多重RT-PCR檢測(cè)試劑盒A，由以下組分組成
1)裂解液購(gòu)自INVITR0GEN公司，貨號(hào)15596-026，按5ml/管進(jìn)行分裝，6管/盒。2) RT-PCR反應(yīng)液，900 μ L/管進(jìn)行分裝，1管/盒。表1為RT-PCR反應(yīng)液配方。表1 RT-PCR反應(yīng)液配方__
f分I終濃度
5 X RT緩沖液_IX RT緩沖液
10 X PCR緩沖液Ti PCR緩沖液
MgCl23. OmM
dNTP0.2mM
軍fe道病毒正義引0. 2 μ M
牛腸道病毒反義引物 0.2μΜ_
Π蹄疫病毒正義引物 0.2μΜ @帝疫病毒反義引物|θ.2μΜ 5XRT緩沖液、10XPCR緩沖液、MgCl2、dNTP均購(gòu)于Promega公司；引物均委托大連寶生物生物工程有限公司合成，其中10XPCR緩沖液的組成為500mM KCl UOOmM Tris-HCl(pH9. 0 25°C )>1.0%Triton X-100。3) Taq DNA 聚合酶(5 U/μ L，購(gòu)自 Promega 公司，貨號(hào)M1665S) 240 μ L/管，1 管
/ jS. ο4)反轉(zhuǎn)錄酶 M-MLV (200U/μ 1，購(gòu)自 Promega 公司，貨號(hào)Ml 701 )250 μ L/管，1 管盒O5 )DEPC水(用自來水兩次蒸餾，經(jīng)過Millipore MILLI-Q PF PLUS純水儀純化，收取電阻率彡18. 0ΜΩ. cm的水，Millipore-Q純化水加入DEPC至終濃度為0. 1%，37°C攪拌處理12hr，151bf/in2 (1.034X IO5Pa)高壓蒸汽滅菌15分鐘)ImL/管，5管/盒。6)陰性對(duì)照牛腸道病毒和口蹄疫病毒陰性組織樣品，用0. Olmol/L pH7. 2 PBS緩沖鹽水制成20%懸液，70°C作用1小時(shí)。7)牛腸道病毒陽(yáng)性對(duì)照為體外轉(zhuǎn)錄的非感染性RNA片段。按照下面的序列合成牛腸道病毒保守區(qū)基因片段EAV-5，UTR，長(zhǎng)度為819bp，克隆在pMD19-T載體上，以純化的質(zhì)粒為模板，用 Promega 公司的 Ribo MAXTM Large Scale RNA Production System_T7 試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄；將體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用DNase除去其中的DNA模板后經(jīng)TRIZOL提取后進(jìn)行測(cè)定后，即得到制備牛腸道病毒陽(yáng)性對(duì)照品所需的RNA陽(yáng)性對(duì)照品母液。牛腸道病毒EAV-5，UTR目的片段基因序列具有序列表中SEQ ID NO 5所示的核苷酸序列。8) 口蹄疫病毒陽(yáng)性對(duì)照為體外轉(zhuǎn)錄的非感染性RNA片段。按照下面的序列合成口蹄疫病毒保守區(qū)基因片段FMD-5，UTR，長(zhǎng)度為432bp，克隆在pMD19-T載體上，以純化的質(zhì)粒為模板，用 Promega 公司的 Ribo MAXTM Large Scale RNA Production System_T7 試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄；將體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用DNase除去其中的DNA模板后經(jīng)TRIZOL提取后進(jìn)行測(cè)定后，即得到制備牛腸道病毒陽(yáng)性對(duì)照品所需的RNA陽(yáng)性對(duì)照品母液。口蹄疫病毒FMD—5，UTR目的片段基因序列具有序列表中SEQ ID NO 6所示的核苷酸序列。對(duì)合成的引物做HPLC分析，如得到單吸收峰圖譜、而且用紫外分光光度計(jì)測(cè)定 0D260nm/0D280nm的比值在1. 6 — 2. O之間，即視為合格引物。從1 IO4稀釋的牛腸道病毒和口蹄疫病毒細(xì)胞培養(yǎng)液中提取的RNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示本發(fā)明提供的引物對(duì)配合使用，可以擴(kuò)增出特異性的目的條帶。將篩選好的引物濃度從0. 1 μ M至0. 8 μ M以0. 1 μ M為間距遞增。對(duì)引物不同濃度的配比進(jìn)行了比較，從多次重復(fù)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)不同濃度的引物對(duì)于該陽(yáng)性模板擴(kuò)增效率不同，引物濃度在0. 2 μ M時(shí)目的帶較亮，所以選定引物濃度為0. 2 μ M作為檢測(cè)方法的引物濃度。研究表明，Mg2+濃度對(duì)多重PCR擴(kuò)增的結(jié)果有一定影響，故應(yīng)用篩選好的引物濃度，將Mg2+的濃度從1. 5mM至6. OmM以0. 5mM為間距遞增，對(duì)不同Mg2+濃度條件下的擴(kuò)增進(jìn)行了比較，結(jié)果表明Mg2+濃度為3. OmM時(shí)擴(kuò)增效果較好。我們選擇Promega公司生產(chǎn)的Taq DNA聚合酶，一單位的定義74°C作用30分鐘，能將IOnM的dNTPs摻入酸溶性物質(zhì)中所需要的酶量。活性要求具DNA聚合酶活性及 5’一 3’核酸外切酶活性，無3’一 5’核酸外切酶活性及核酸內(nèi)切酶活性；具熱穩(wěn)定性，94°C 1小時(shí)后仍保持50%活性。Taq DNA聚合酶用量(以單位U計(jì))的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)?zāi)０宀捎门Ｄc道病毒細(xì)胞培養(yǎng)物(1 IO4稀釋)提取RNA反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行擴(kuò)增。從多次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果中選定1. 25 U作為使用的Taq DNA聚合酶用量。本發(fā)明還提供了所述檢測(cè)牛腸道病毒和口蹄疫病毒的多重RT-PCR檢測(cè)試劑盒A 的使用方法1)樣品處理對(duì)于組織樣品，用無菌的剪刀和鑷子剪取待檢樣品1.0 g于研缽中充分研磨，再加5 mL PBS混勻，然后將組織懸液轉(zhuǎn)入無菌Eppendorf管中，編號(hào)備用。對(duì)于液體樣本， 用無菌注射器直接吸取至無菌Eppendorf管中，編號(hào)備用。對(duì)于拭子樣品(如咽喉拭子、肛門拭子、眼結(jié)膜拭子等)，在采集拭子后立刻放入含有1.5mLPBS的離心管中，用滅菌剪刀剪去手持部分，密封，渦旋震蕩，靜置0. 5小時(shí)后，用滅菌鑷子反復(fù)擠壓棉拭子，收集擠出的液體至無菌Eppendorf管中，編號(hào)備用。采集或處理的樣本在2 °C 8 °C條件下保存應(yīng)不超過24 h;若需長(zhǎng)期保存，須放置-70 °C冰箱，但應(yīng)避免反復(fù)凍融(最多凍融2次)。采集的樣品密封后，采用保溫壺或保溫桶加冰密封，盡快運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室。2) RNA的提取在樣本處理區(qū)進(jìn)行。取η個(gè)1. 5ml滅菌離心管(η =樣本數(shù)+ 1管陰性對(duì)照+ 1管陽(yáng)性對(duì)照)，作好標(biāo)記。首先加入600 μ L裂解液(裂解液有很強(qiáng)的腐蝕性，切勿沾到皮膚或衣物，否則立即用大量清水沖洗并擦干)，然后分別加入待測(cè)樣本、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照各200 μ L (—份樣本換用一個(gè)吸頭)；再加入200 μ L氯仿，混勻器上振蕩混勻5sec (不宜過于強(qiáng)烈，以免產(chǎn)生乳化層，也可用手顛倒混勻)。12，OOOg離心15min (如有條件，于4°C進(jìn)行離心)。取與上步中相同數(shù)量的1. 5ml 滅菌離心管，加入400 μ L異丙醇(一 20°C預(yù)冷)，作好標(biāo)記。吸取離心后上清液相轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的管中，顛倒混勻。12，OOOg離心15min。輕輕倒去上清，倒置于吸水紙上，沾干液體(不同樣品應(yīng)在吸水紙不同地方沾干)；加入600 μ L 75%乙醇(一 20°C預(yù)冷)，顛倒洗滌。12，OOOg離心lOmin。輕輕倒去上清，倒置于吸水紙上，盡量沾干液體。4，OOOg離心lOsec，將管壁上的殘余液體甩到管底部，用微量加樣器盡量將其吸干(一份樣本換用一個(gè)吸頭，注意吸頭不要碰到有沉淀一面)，室溫干燥3min (不宜過于干燥，以免RNA不溶)。加入IlyL DEPC水，輕輕混勻，溶解管壁上的RNA，2，OOOg離心5sec，冰上保存?zhèn)溆?注意此時(shí)的RNA最易受RNA酶降解，請(qǐng)?jiān)?小時(shí)內(nèi)進(jìn)行PCR擴(kuò)增)。3)多重RT-PCR擴(kuò)增從試劑盒中取出RT-PCR反應(yīng)液、反轉(zhuǎn)錄酶M_MLV、Taq DNA 聚合酶，在室溫下融化后，2，OOOg離心5sec。設(shè)所需PCR管數(shù)為η+1 (η =樣本數(shù)+ 1管陰性對(duì)照+ 1管陽(yáng)性對(duì)照)，每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系需要14. 25 μ L RT-PCR反應(yīng)液、0. 5 μ L反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV和0.25yL Taq酶。計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積試管中，充分混合均勻，向每個(gè)PCR管中各分裝15 μ L，轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。在各設(shè)定的PCR管中分別加入制備的RNA溶液各10 μ L，蓋緊管蓋，于400g離心5sec。將PCR管排好放入PCR檢測(cè)儀內(nèi)，記錄樣本擺放順序。反應(yīng)參數(shù)設(shè)置
第一階段，預(yù)變性 420C /45min,94 V /3 min ；
第二階段，94°C /1 min，55°C /1 min，72°C /2 min，30 個(gè)循環(huán)；
第三階段，72°C /7 min，4°C保存，電泳觀察結(jié)果。4)結(jié)果的判定按所需濃度，以IX TAE溶液配制凝膠液，微波爐加熱使完全溶解。 稍微冷卻，加入溴化乙錠(EB至終濃度為5mg/ml)，趁熱倒入制膠槽，高度約0. 5cm,自然凝固后，小心拔出梳子，將平板放入電泳槽中，加樣孔一端朝向陰極。電泳槽內(nèi)倒入足夠的 IXTAE溶解，使之正好漫過制好的瓊脂板。PCR產(chǎn)物與6X加樣緩沖液混合均勻，用微量進(jìn)樣器吸取，移液管頭伸入液面以下，對(duì)準(zhǔn)加樣孔，緩慢推出使樣品垂直落入加樣孔內(nèi)。蓋上電泳槽，調(diào)節(jié)電壓為5v/cm，電泳至溴酚藍(lán)和二甲芐青FF分出一定的距離。小心取出凝膠置于Alpha Imager，進(jìn)行觀察，并成像。樣品出現(xiàn)單一、特異性目的條帶的為陽(yáng)性，否則判為陰性。牛腸道病毒的目的條帶為276bp，口蹄疫病毒的目的條帶為328bp。本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)牛腸道病毒和口蹄疫病毒的多重RT-PCR檢測(cè)試劑盒B， 由以下組分組成
1)裂解液購(gòu)自INVITR0GEN公司，貨號(hào)15596-026，按5ml/管進(jìn)行分裝，6管/盒。2) RT-PCR反應(yīng)液，按900 μ L/管分裝，1管/盒。表2為使用RT-PCR酶顆粒反應(yīng)液配方。表1使用RT-PCR酶顆粒反應(yīng)液配方
'組分I終濃度^
牛腸道病毒正義引物0.2μΜ
牛腸道病毒反義引物0.2μΜ
口蹄疫病毒正義引物0.2μΜ
口蹄疫病毒反義引物|θ.2μ"￥
引物均委托大連寶生物生物工程有限公司合成。3) RT-PCR 酶顆粒，GE Healthcare 公司產(chǎn)品，貨號(hào)27-9556_01，32 管 / 盒。4)DEPC水(用自來水兩次蒸餾，經(jīng)過Millipore MILLI-Q PF PLUS純水儀純化，收取電阻率彡18. 0ΜΩ. cm的水，Millipore-Q純化水加入DEPC至終濃度為0. 1%，37°C攪拌處理12hr，151bf/in2 (1.034X IO5Pa)高壓蒸汽滅菌15分鐘)ImL/管，3管/盒。5)陰性對(duì)照牛腸道病毒和口蹄疫病毒陰性組織樣品，用0. 01mol/L pH7. 2 PBS緩沖鹽水制成20%懸液，70°C作用1小時(shí)。6)牛腸道病毒陽(yáng)性對(duì)照為體外轉(zhuǎn)錄的非感染性RNA片段。按照下面的序列合成牛腸道病毒保守區(qū)基因片段EAV-5，UTR，長(zhǎng)度為819bp，克隆在pMD19-T載體上，以純化的質(zhì)粒為模板，用 Promega 公司的 Ribo MAXTM Large Scale RNA Production System_T7 試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄；將體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用DNase除去其中的DNA模板后經(jīng)TRIZOL提取后進(jìn)行測(cè)定后，即得到制備牛腸道病毒陽(yáng)性對(duì)照品所需的RNA陽(yáng)性對(duì)照品母液。牛腸道病毒EAV-5，UTR目的片段基因序列具有序列表中SEQ ID NO 5所示的核苷酸序列。7) 口蹄疫病毒陽(yáng)性對(duì)照為體外轉(zhuǎn)錄的非感染性RNA片段。按照下面的序列合成口蹄疫病毒保守區(qū)基因片段FMD-5，UTR，長(zhǎng)度為432bp，克隆在pMD19-T載體上，以純化的質(zhì)粒為模板，用 Promega 公司的 Ribo MAXTM Large Scale RNA Production System_T7 試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄；將體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用DNase除去其中的DNA模板后經(jīng)TRIZOL提取后進(jìn)行測(cè)定后，即得到制備牛腸道病毒陽(yáng)性對(duì)照品所需的RNA陽(yáng)性對(duì)照品母液?？谔阋卟《綟MD—5，UTR目的片段基因序列具有序列表中SEQ ID NO 6所示的核苷酸序列。對(duì)合成的引物做HPLC分析，如得到單吸收峰圖譜、而且用紫外分光光度計(jì)測(cè)定 0D260nm/0D280nm的比值在1. 6 — 2. O之間，即視為合格引物。從1 IO4稀釋的牛腸道病毒和口蹄疫病毒細(xì)胞培養(yǎng)液中提取的RNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示本發(fā)明提供的引物對(duì)配合使用，可以擴(kuò)增出特異性的目的條帶。
將篩選好的引物濃度從0. 1 μ M至0. 8 μ M以0. 1 μ M為間距遞增。對(duì)引物不同濃度的配比進(jìn)行了比較，從多次重復(fù)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)不同濃度的引物對(duì)于該陽(yáng)性模板擴(kuò)增效率不同，引物濃度在0. 2 μ M時(shí)目的帶較亮，所以選定引物濃度為0. 2 μ M作為檢測(cè)方法的引物濃度。 RT-PCR酶顆粒，GE Healthcare公司產(chǎn)品，每個(gè)RT-PCR酶顆粒包含PCR或RT-PCR 所需的所有試劑(反轉(zhuǎn)錄酶、Rnase抑制劑、緩沖液、核苷酸(dNTP)和Taq DNA聚合酶)， 室溫下能穩(wěn)定存放兩年之久。使用簡(jiǎn)單，只需要加入模板和引物，即可進(jìn)行有效擴(kuò)增。 Ready-To-Go PCR Beads (96 reactions)貨號(hào)27-9556_01。本發(fā)明還提供了所述檢測(cè)牛腸道病毒和口蹄疫病毒的多重RT-PCR檢測(cè)試劑盒B 的使用方法
1)樣品處理對(duì)于組織樣品，用無菌的剪刀和鑷子剪取待檢樣品1.0 g于研缽中充分研磨，再加5 mL PBS混勻，然后將組織懸液轉(zhuǎn)入無菌Eppendorf管中，編號(hào)備用。對(duì)于液體樣本，用無菌注射器直接吸取至無菌Eppendorf管中，編號(hào)備用。對(duì)于拭子樣品(如咽喉拭子、肛門拭子、眼結(jié)膜拭子等)，在采集拭子后立刻放入含有1.5mLPBS的離心管中，用滅菌剪刀剪去手持部分，密封，渦旋震蕩，靜置0. 5小時(shí)后，用滅菌鑷子反復(fù)擠壓棉拭子，收集擠出的液體至無菌Eppendorf管中，編號(hào)備用。采集或處理的樣本在2 °C 8 °C條件下保存應(yīng)不超過24 h;若需長(zhǎng)期保存，須放置-70 °C冰箱，但應(yīng)避免反復(fù)凍融(最多凍融2次)。采集的樣品密封后，采用保溫壺或保溫桶加冰密封，盡快運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室。2) RNA的提取在樣本處理區(qū)進(jìn)行。取η個(gè)1. 5ml滅菌離心管(η =樣本數(shù)+ 1管陰性對(duì)照+ 1管陽(yáng)性對(duì)照)，作好標(biāo)記。首先加入600 μ L裂解液(裂解液有很強(qiáng)的腐蝕性，切勿沾到皮膚或衣物，否則立即用大量清水沖洗并擦干)，然后分別加入待測(cè)樣本、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照各200 μ L (—份樣本換用一個(gè)吸頭)；再加入200 μ L氯仿，混勻器上振蕩混勻5sec (不宜過于強(qiáng)烈，以免產(chǎn)生乳化層，也可用手顛倒混勻)。12，OOOg離心15min (如有條件，于4°C進(jìn)行離心)。取與上步中相同數(shù)量的1. 5ml 滅菌離心管，加入400 μ L異丙醇(一 20°C預(yù)冷)，作好標(biāo)記。吸取離心后上清液相轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的管中，顛倒混勻。12，OOOg離心15min。輕輕倒去上清，倒置于吸水紙上，沾干液體(不同樣品應(yīng)在吸水紙不同地方沾干)；加入600 μ L 75%乙醇(一 20°C預(yù)冷)，顛倒洗滌。12，OOOg離心lOmin。輕輕倒去上清，倒置于吸水紙上，盡量沾干液體。4，OOOg離心lOsec，將管壁上的殘余液體甩到管底部，用微量加樣器盡量將其吸干(一份樣本換用一個(gè)吸頭，注意吸頭不要碰到有沉淀一面)，室溫干燥3min (不宜過于干燥，以免RNA不溶)。加入IlyL DEPC水，輕輕混勻，溶解管壁上的RNA，2，OOOg離心5sec，冰上保存?zhèn)溆?注意此時(shí)的RNA最易受RNA酶降解，請(qǐng)?jiān)?小時(shí)內(nèi)進(jìn)行PCR擴(kuò)增)。3)多重RT-PCR擴(kuò)增從試劑盒中取出多重RT-PCR反應(yīng)液，在室溫下融化后， 2，00(^離心5紹(。設(shè)所需PCR管數(shù)為n+l(n =樣本數(shù)+ 1管陰性對(duì)照+ 1管陽(yáng)性對(duì)照)， 每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系需要15 μ L RT-PCR反應(yīng)液和0. 5顆RT-PCR酶顆粒。計(jì)算好反應(yīng)液的使用量((η+1) X 15)，加入一適當(dāng)體積試管中，向其中加入((η+1) X0. 5)顆RT-PCR酶顆粒， 充分混合均勻，向每個(gè)PCR管中各分裝15 μ L，轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。在各設(shè)定的PCR管中分別加入制備的RNA溶液各10 μ L，蓋緊管蓋，于400g離心5sec。將PCR管排好放入PCR檢測(cè)儀內(nèi)，記錄樣本擺放順序。反應(yīng)參數(shù)設(shè)置
第一階段，預(yù)變性 420C /45min,94 V /3 min ；
第二階段，94°C /1 min，55°C /1 min，72°C /2 min，30 個(gè)循環(huán)；
第三階段，72°C /7 min，4°C保存，電泳觀察結(jié)果。4)結(jié)果的判定按所需濃度，以IX TAE溶液配制凝膠液，微波爐加熱使完全溶解。 稍微冷卻，加入溴化乙錠(EB至終濃度為5mg/ml)，趁熱倒入制膠槽，高度約0. 5cm,自然凝固后，小心拔出梳子，將平板放入電泳槽中，加樣孔一端朝向陰極。電泳槽內(nèi)倒入足夠的 IXTAE溶解，使之正好漫過制好的瓊脂板。PCR產(chǎn)物與6X加樣緩沖液混合均勻，用微量進(jìn)樣器吸取，移液管頭伸入液面以下，對(duì)準(zhǔn)加樣孔，緩慢推出使樣品垂直落入加樣孔內(nèi)。蓋上電泳槽，調(diào)節(jié)電壓為5v/cm，電泳至溴酚藍(lán)和二甲芐青FF分出一定的距離。小心取出凝膠置于Alpha Imager，進(jìn)行觀察，并成像。樣品出現(xiàn)單一、特異性目的條帶的為陽(yáng)性，否則判為陰性。牛腸道病毒的目的條帶為276bp，口蹄疫病毒的目的條帶為328bp。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明選擇牛腸道病毒EAV_5’UTR和口蹄疫病毒FMD_5’UTR基因編碼區(qū)作為靶區(qū)域，設(shè)計(jì)引物建立并優(yōu)化了牛腸道病毒和口蹄疫病毒多重RT-PCR檢測(cè)方法，取得了優(yōu)異的技術(shù)效果1)快速可同時(shí)進(jìn)行牛腸道病毒和口蹄疫病毒的檢測(cè)，將兩個(gè)目的基因同時(shí)檢出，比普通PCR時(shí)間縮短了一半；與細(xì)胞培養(yǎng)病毒分離相比，更是從21天縮短到了 6h。2)靈敏由于篩選出了特異性的、擴(kuò)增效率高的引物，優(yōu)化了反應(yīng)體系，用所建立的方法對(duì)以10倍梯度稀釋的牛腸道病毒和口蹄疫病毒細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明稀釋到10_6倍仍為陽(yáng)性。3)特異由于采用了特異性的引物，建立的牛腸道病毒和口蹄疫病毒多重RT-PCR 檢測(cè)方法在檢測(cè)所收集的牛腸道病毒和口蹄疫病毒以及牛的其他病毒病原時(shí)，牛腸道病毒和口蹄疫病毒為陽(yáng)性，其他病毒的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，未發(fā)現(xiàn)交叉反應(yīng)。4)穩(wěn)定重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示所建立方法的穩(wěn)定性良好。 5 )用途較廣可分別應(yīng)用于牛腸道病毒檢測(cè)、口蹄疫病毒檢測(cè)、牛腸道病毒和口蹄疫病毒的同時(shí)檢測(cè)，以及牛腸道病毒和口蹄疫病毒的鑒別診斷等。下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1、試劑盒的配制和使用
1、試劑盒A的配制組成，見表3。其中，所述RT-PCR反應(yīng)液的配方見表1。表3試劑盒配制組成__
權(quán)利要求
1.一組檢測(cè)牛腸道病毒和口蹄疫病毒的核苷酸序列，其特征在于，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :1至SEQ ID NO :4，其中序列SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2分別為檢測(cè)牛腸道病毒的正義引物和反義引物；序列SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4分別為檢測(cè)口蹄疫病毒的正義引物和反義引物。
2.一種檢測(cè)牛腸道病毒和口蹄疫的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，由以下組分組成1)裂解液；2)RT-PCR反應(yīng)液，包括PCR緩沖液、RT緩沖液、MgCL2、dNTP、牛腸道病毒正義引物、牛腸道病毒反義引物、口蹄疫病毒正義引物、口蹄疫病毒反義引物；3)反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV；4)Taq DNA聚合酶；5)DEPC 水；6)陰性對(duì)照牛腸道病毒和口蹄疫病毒陰性組織樣品，用0.01mol/L pH7. 2 PBS緩沖鹽水制成20%懸液，70°C作用1小時(shí)；7)牛腸道病毒陽(yáng)性對(duì)照為體外轉(zhuǎn)錄的非感染性RNA片段，其對(duì)應(yīng)的DNA序列為序列表SEQ ID No. 5所示的核苷酸序列；8)口蹄疫病毒陽(yáng)性對(duì)照為體外轉(zhuǎn)錄的非感染性RNA片段，其對(duì)應(yīng)的DNA序列為序列表SEQ ID No. 6所示的核苷酸序列；其中，牛腸道病毒正義引物為序列表SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列，牛腸道病毒反義引物為序列表SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列，口蹄疫病毒正義引物為序列表SEQ ID No. 3 所示的核苷酸序列，口蹄疫病毒反義引物為序列表SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)牛腸道病毒和口蹄疫病毒的檢測(cè)試劑盒，其特征在于， 所述RT-PCR反應(yīng)液包括IX PCR緩沖液、IX RT緩沖液、3mM MgCL2、0. 2mM dNTP、0. 2 μΜ牛腸道病毒正義引物、0.2 μ M牛腸道病毒反義引物、0.2 μ M 口蹄疫病毒正義引物、0.2 μΜ 口蹄疫病毒反義引物。
4.一種檢測(cè)牛腸道病毒和口蹄疫病毒的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，由以下組分組成1)裂解液；2)RT-PCR反應(yīng)液，包括牛腸道病毒正義引物、牛腸道病毒反義引物、口蹄疫病毒正義引物、口蹄疫病毒反義引物；3)RT-PCR酶顆粒；4)DEPC 水；5)陰性對(duì)照牛腸道病毒和口蹄疫病毒陰性組織樣品，用O.Olmol/LpH7. 2 PBS緩沖鹽水制成20%懸液，70°C作用1小時(shí)；6)牛腸道病毒陽(yáng)性對(duì)照為體外轉(zhuǎn)錄的非感染性RNA片段，其對(duì)應(yīng)的DNA序列為序列表SEQ ID No. 5所示的核苷酸序列；7)口蹄疫病毒陽(yáng)性對(duì)照為體外轉(zhuǎn)錄的非感染性RNA片段，其對(duì)應(yīng)的DNA序列為序列表SEQ ID No. 6所示的核苷酸序列；其中，牛腸道病毒正義引物為序列表SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列，牛腸道病毒反義引物為序列表SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列，口蹄疫病毒正義引物為序列表SEQ ID No. 3 所示的核苷酸序列，口蹄疫病毒反義引物為序列表SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)牛腸道病毒的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述RT-PCR反應(yīng)液包括0.2 μ M牛腸道病毒正義引物、0.2 μ M牛腸道病毒反義引物、0.2 μ M 口蹄疫病毒正義引物、0. 2 μ M 口蹄疫病毒反義引物。
全文摘要
本發(fā)明公開了檢測(cè)牛腸道病毒和口蹄疫病毒的核苷酸序列，該檢測(cè)牛腸道病毒和口蹄疫病毒的核苷酸序列如序列表SEQIDNO1至SEQIDNO4，其中序列SEQIDNO1和SEQIDNO2分別為檢測(cè)牛腸道病毒的正義引物和反義引物，序列SEQIDNO3和SEQIDNO4分別為檢測(cè)口蹄疫病毒的正義引物和反義引物。本發(fā)明進(jìn)一步公開了含有上述引物的檢測(cè)牛腸道病毒和口蹄疫病毒的試劑盒。本發(fā)明所述的試劑盒具有快速、靈敏、特異、穩(wěn)定、重復(fù)性好的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12R1/93GK102181578SQ20111008454
公開日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2011年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月6日
發(fā)明者喬彩霞, 劉來福, 吳丹, 吳濤, 周琦, 張偉, 張向東, 張鶴曉, 柏亞鐸, 段向英, 汪琳, 蒲靜, 谷強(qiáng), 郭錚蕾, 高志強(qiáng), 齊瑋 申請(qǐng)人:中華人民共和國(guó)北京出入境檢驗(yàn)檢疫局