專利名稱：一種口蹄疫病毒抗體的elisa試劑盒及其制備方法
一種口蹄疫病毒抗體的ELISA試劑盒及其制備方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物技術(shù)檢測領(lǐng)域，具體涉及一種口蹄疫病毒(FMDV)抗體的ELISA試劑盒及其制備方法，利用非蛋白多聚體定向偶聯(lián)FMDV人工合成多肽作為抗原快速檢測口蹄疫病毒。
技術(shù)背景
口蹄疫由口蹄疫病毒(FMDV)所致急性、熱性、高度接觸性傳染病。主要侵害偶蹄獸，以發(fā)熱、口腔黏膜及蹄部和乳房皮膚發(fā)生水泡和潰爛為特征，是國際獸疫局規(guī)定的A類傳染病，易通過空氣傳播，傳染性強，流行迅速，偶爾感染人，主要發(fā)生在與患畜密切接觸的人員，多為亞臨床感染。
對畜牧產(chǎn)業(yè)來講，口蹄疫是一個相當大的經(jīng)濟威脅，這種高傳染性疾病影響所有的偶蹄類動物，并且在世界上廣泛傳播。FMD的病原為口蹄疫病毒(Foot- and- mouth disease virus, FMDV)?？谔阋卟《?FMDV)屬于小RNA毒科口蹄疫病毒屬，有A、0、C、 Asial、SAT1、SAT2、SAT3七個血清型，各血清型間無交叉免疫保護，這種血清型可以用傳統(tǒng)的 血清學(xué)方法診斷。
FMDV基因組為單股正鏈RNA，長約8. 5Kb。基因組的中部是一個大的開放閱讀框 (0RF)，編碼病毒的多聚蛋白，該聚蛋白經(jīng)裂解后形成L前導(dǎo)蛋白、Pl區(qū)結(jié)構(gòu)蛋白、P2區(qū)和 P3區(qū)非結(jié)構(gòu)蛋白。FMDV Pl區(qū)結(jié)構(gòu)蛋白最終成熟裂解為4種結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2、VP3、VP4。 研究發(fā)現(xiàn)FMDV抗原位點幾乎都集中在Pl區(qū)，其中VP1、VP2、VP3、位于抗原蛋白衣殼表面， VP4位于衣殼內(nèi)部，4種結(jié)構(gòu)蛋白都具有免疫原性?，F(xiàn)已證明，對于O型口蹄疫，有3個中和性抗原位點在VPl上，位于21 40、141 160、200 213位氨基酸，其中141 160位及200 213位氨基酸為B細胞表位，引發(fā)體液免疫反應(yīng)。從病毒衣殼蛋白分離的VPl可誘導(dǎo)動物產(chǎn)生針對該表位的中和性抗體。
目前世界各地對病毒類疾病的診斷方法主要有病毒分離、分子生物學(xué)診斷 (RT-PCR)和基于血清學(xué)試驗的免疫過氧化物酶細胞單層測定法(IPMA)，中和試驗(SN)，間接免疫熒光試驗(ILFT)，和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)等等。與其他方法與相比，ELISA檢測操作簡便，易于標準化，快速敏感，非常適合進行大規(guī)模流行病調(diào)查和疫病監(jiān)測。ELISA檢測又分為間接ELISA和競爭ELISA。傳統(tǒng)的ELISA法檢測中，包被抗原的用量大，一般需要 5 ομ g/mL。由于抗原的使用量大，使得其檢測成本也較為高昂，不利于該方法的推廣使用。目前市面上銷售的產(chǎn)品主要為荷蘭賽迪診斷公司的口蹄疫病毒O型抗體檢測試劑盒， 它只能檢測O型口蹄疫病毒，不能檢測其他血清型，且價格昂貴。
近年來，人們已經(jīng)開始嘗試利用衣殼蛋白上的抗原表位設(shè)計重組基因工程抗原， 或者使用人工合成的特異免疫活性多肽來檢測和預(yù)防FMD。如能將合成多肽更廣泛地用于疾病診斷的試劑中，可以縮短產(chǎn)品的研發(fā)時間，簡化生產(chǎn)程序，降低生產(chǎn)成本。但是合成多肽成功地用于疾病的診斷的成功例子很少。這是由于保持包被多肽在固相(ELISA板)上正確方向性的技術(shù)問題一直未解決，從而嚴重影響了多肽與目標抗體的結(jié)合，導(dǎo)致多肽ELISA 的靈敏度偏低，非特異背景讀值偏高
發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測口蹄疫病毒(FMDV)抗體的ELISA試劑盒，利用非蛋白多聚體定向偶聯(lián)FMDV人工合成反應(yīng)原性多肽作為抗原，以獲得靈敏度高、特異性高、操作簡單、并快速檢測口蹄疫病毒的ELISA檢測試劑盒。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種口蹄疫病毒(FMDV)抗體的ELISA試劑盒的制備方法。
為實現(xiàn)上述目的本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下一種口蹄疫病毒抗體的ELISA試劑盒，包括非蛋白多聚體定向偶聯(lián)口蹄疫病毒反應(yīng)原性多肽抗原包被液包被的酶標板；陽性血清和陰性血清各I管，其中陽性血清為FMDV標準陽性血清稀釋液，陰性血清為FMDV標準陰性血清稀釋液；用辣根過氧化物酶標記羊抗豬 IgG的稀釋液的酶標二抗I瓶；抗體稀釋液I瓶；底物顯色液I瓶；終止液I瓶。
所述非蛋白多聚體定向偶聯(lián)口蹄疫病毒反應(yīng)原性多肽抗原包被液是非蛋白多聚體定向偶聯(lián)口蹄疫病毒反應(yīng)原性多肽抗原用包被液按照O. 01 μ g/mL- 5 μ g/mL濃度稀釋； 偶聯(lián)口蹄疫病毒反應(yīng)原性多肽抗原是通過以下方法制備得到的1)選取反應(yīng)原性多肽溶解，得到多肽溶液；2)取非蛋白多聚體溶解，得到非蛋白多聚體溶液；3)在多肽溶液或非蛋白多聚體溶液中加入偶聯(lián)劑，混合均勻；4)將多肽溶液與非蛋白多聚體溶液混合均勻，攪拌反應(yīng)，使多肽偶聯(lián)到非蛋白多聚體·上；5)用透析袋去除未參與結(jié)合的偶聯(lián)劑及游離多肽，純化，凍干，得到偶聯(lián)多肽；其中口蹄疫病毒反應(yīng)原性多肽為SEQ ID NO:1 SEQ ID NO: 18系列多肽中的一種或幾種。
優(yōu)選的，所述偶聯(lián)劑為1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)_碳二亞胺(EDC)、N, N' -二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)U-乙基-3- (3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞基胺鹽酸鹽(EEDQ)、戊二醛中的一種或兩種以上混合。
優(yōu)選的，所述非蛋白多聚體為具有可偶聯(lián)基團的多糖，可偶聯(lián)基團為氨基(-NH2)， 羧基(-C00H)，巰基(-SH)中的至少一種。
本發(fā)明中通過DNAStar、Genebank、ProtScale等分析軟件對豬口蹄疫病毒蛋白的抗原表位進行預(yù)測，確定天然抗原的氨基酸序列，然后尋找該肽段所針對的抗原決定簇 (印itopes)。使用ELISA檢測不同多肽與豬口蹄疫病毒抗血清的反應(yīng)，最后選出具有良好反應(yīng)的口蹄疫病毒反應(yīng)原性多肽。
本發(fā)明中所述偶聯(lián)多肽抗原包被液包被的酶標板是用非蛋白多聚體定向偶聯(lián)多肽抗原包被液包被酶標板，每孔100 μ L, 4°C過夜包被,包被濃度為O. 01 μ g/mL- 5 μ g/mL, 用PBST洗滌液250 μ I/孔洗滌2-4次后拍干，用封閉液150 μ I/孔，37°C封閉lh，洗滌液 PBST 250 μ I/孔洗滌3次后拍干，放入真空袋中，加入干燥劑，抽真空，4°C保存；所述包被液為1.59g Na2CO3, 2. 93g NaHCO3溶于800mL雙蒸水中，調(diào)節(jié)pH值至9· 6，并定容至1000mL。本發(fā)明中所采用的酶標板為至少8孔的酶標板，優(yōu)選的為48孔或96孔的酶標板。本發(fā)明中所述的辣根過氧化物酶標記羊抗豬IgG的稀釋液是用HRP保護液按照辣根過氧化物酶標記羊抗豬IgG與HRP保護液體積比為1: 2000-10000的比例稀釋，酶標二抗每瓶量為 12mL ;所述 HRP 保護液為 O. 1% BSA，l.Og BSA, 0.25% EDTA, 2. 5gEDTA，加PBS 至 IOOOmL0本發(fā)明中所述的FMDV標準陽性血清稀釋液是用抗體稀釋液按照體積比為1:16-64的比例將FMDV標準陽性血清稀釋，每管量為ImL ；FMDV標準陰性血清稀釋液用抗體稀釋液按照體積比為1:16-64的比例將FMDV標準陰性血清稀釋，每管量為lmL。本發(fā)明中所述的抗體稀釋液為O. 1%BSA,1. Og BSA加入PBS至IOOOmL ;每瓶量為12mL0 本發(fā)明中所述的底物顯色液為50mg TMB, IOmL DMS0，9. 8g檸檬酸和L 2mL 30%H2O2加蒸餾水定容至IOOOmL ;每管量為12mL。本發(fā)明中所述的終止液包括雙蒸水178. 3mL和98%的濃硫酸21. 7mL,每管量為6mT, η
本發(fā)明所述的口蹄疫病毒抗體的ELISA檢測試劑盒還包括I瓶洗滌液，所述洗滌液為O. 2g KH2PO4, 2. 9g Na2HPO4 · 12Η20，8· Og NaCl，0. 2g KC1，0. 5mL Tween-20 (0. 05% V/V)，力口雙蒸水定容至IOOmL, pH值為7. 4。一種口蹄疫病毒抗體的ELISA試劑盒的制備方法，包括以下步驟
O用非蛋白多聚體偶聯(lián)口蹄疫病毒反應(yīng)原性多肽抗原包被液包被酶標板將非蛋白多聚體偶聯(lián)多肽抗原用包被液稀釋，然后將稀釋的偶聯(lián)多肽抗原包被酶標板，每孔100 μ L，4°C過夜包被，包被濃度為0. 01 μ g/mL- 5 μ g/mL,次日用PBST洗滌液250 μ I/孔洗滌2_4次后拍干，用封閉液150 μ I/孔，37°C封閉lh，洗滌液PBST 250 μ I/孔洗滌3次后拍干，放入真空袋中，加入干燥劑，抽真空，4°C保存；
2)抗體稀釋液(AD)配制稱取1.Og BSA (O. 1%)，加PBS至1000mL，4°C保存；
3)底物液顯色液配制4mLTMB (50mg TMB溶于IOmL DMSO中)，9. 8g檸檬酸，1. 2mL30% H2O2加蒸餾水定容至IOOOmL，4°C避光保存；
4)終止液配制雙蒸水178.3mL，逐滴加入濃硫酸(98%) 21. 7mL ；
5)陰陽性血清稀釋用抗體稀釋液按陽性血清/陰性血清與抗體稀釋劑按體積比為1:16-1:64稀釋，ImL/管分裝，4°C保存；
6)酶標二抗配制用HRP保護液按HRP保護液與辣根過氧化物酶標記羊抗豬IgG體積比為1:2000-1:10000的比例稀釋辣根過氧化物酶標記羊抗豬IgG，4°C保存；
7)試劑盒的組裝將非蛋白多聚體定向偶聯(lián)口蹄疫病毒反應(yīng)原性多肽抗原包被的酶標板I塊、ImL/管的陰陽性血清各I管、12mL/瓶的抗體稀釋液I瓶、12mL/瓶的酶標二抗I瓶、12mL/瓶的底物顯色液I瓶、6mL/瓶的終止液I瓶、操作說明書一份組裝成ELISA試劑盒。上述制備方法中所述的包被液為1. 59g Na2CO3, 2. 93g NaHCO3溶于800mL雙蒸水中，調(diào)節(jié)pH值至9. 6，并定容至1000mL。相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明采用非蛋白多聚體定向偶聯(lián)口蹄疫病毒反應(yīng)原性多肽抗原作為包被抗原，有效提高多肽與目標抗體的結(jié)合效率，從而顯著提高可檢測靈敏度，同時顯著降低非特異背景讀值，特異性高，本發(fā)明的口蹄疫病毒抗體的ELISA試劑盒具有操作簡單、診斷速度快、在進行大規(guī)模檢測中經(jīng)濟方便等優(yōu)點，是一種便于普及的好方法，具有廣泛的應(yīng)用前景。采用本發(fā)明的ELISA檢測試劑盒檢測口蹄疫病毒抗體，包被抗原用量可減至10ng/mL，降低了檢測成本，有利于推廣使用。下面結(jié)合具體的實施方式對本發(fā)明作進一步詳細說明。
具體實施例方式本發(fā)明中所采用的偶聯(lián)多肽的制備方法如下
O口蹄疫病毒反應(yīng)原性多肽的篩選
有效多肽段的選擇和確定，通過DNAStar、Genebank、ProtScale等分析軟件對豬口蹄疫病毒蛋白的抗原表位進行預(yù)測，確定天然抗原的氨基酸序列，然后尋找該肽段所針對的抗原決定簇(印itopes)，使用ELISA檢測不同多肽與豬口蹄疫病毒抗血清的反應(yīng)，最后選出具有良好反應(yīng)的口蹄疫病毒反應(yīng)原性多肽，本發(fā)明中采用以下篩選出來的多肽如下
Pl Lys Tyr Ser Asp Ala Arg Val Ser Asn Val Arg Gly Asp Leu Arg Val Leu AlaGln Lys Ala Glu Arg Ala Leu Pro Thr Ser Ser Asn Tyr ；
P2 Lys Tyr Ser Asp Ala Arg Ala Ser Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu AlaGln Lys Ala Glu Arg Ala Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr ；
P3 His Gln Thr Asn Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala GluArg Thr Leu Pro Thr Ser Phe Asn Phe ；
P4 Ser Lys Tyr Gly Asp Thr Ser Thr Asn Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val LeuAla Gln Lys Ala Glu Arg Thr Leu Pro Thr Ser Phe Asn Phe ；
P5 Tyr Gly Asp Thr Ser Thr Asn ThrVal Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala GlnLys Ala Glu Arg Thr Leu Pro Thr Ser Phe Asn Phe ；
P6 Lys Tyr Asp Glu Ser Pro Val Thr Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu AlaGln Lys Ala Ala Arg Thr Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr ；
P7 Lys Tyr Ala Glu Gly Ser Leu Thr Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu AlaGln Lys Ala Ala Arg Pro Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr ；
P8 Lys Tyr Ala Gly Gly Pro Leu Pro Asn Val Arg Gly Asp Leu Arg Val Leu AlaGln Lys Ala Ala Arg Pro Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr ；
P9 Lys Tyr Ala Gly Gly Ser Leu Thr Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu AlaGln Lys Ala Ala Arg Pro Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr ；
PlO Lys Tyr Ala Gly Gly Ser Leu Pro Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu AlaPro Lys Ala Ala Arg Pro Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr ；
Pll Lys Tyr Ala Gly Gly Ser Leu Pro Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu AlaGln Lys Ala Ala Arg Pro Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr ；
P12 Lys Tyr Gly Lys Ser Pro Val Ala Asn Ala Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu ThrPro Lys Ala Ala Arg Pro Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr ；
權(quán)利要求
1.一種口蹄疫病毒抗體的ELISA試劑盒，其特征在于包括非蛋白多聚體定向偶聯(lián)口蹄疫病毒反應(yīng)原性多肽抗原包被液包被的酶標板；陽性血清和陰性血清各I管，其中陽性血清為FMDV標準陽性血清稀釋液，陰性血清為FMDV標準陰性血清稀釋液；用辣根過氧化物酶標記的羊抗豬IgG的稀釋液I瓶；抗體稀釋液I瓶；底物顯色液I瓶；終止液I瓶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的口蹄疫病毒抗體的ELISA試劑盒，其特征在于所述非蛋白多聚體定向偶聯(lián)口蹄疫病毒反應(yīng)原性多肽抗原包被液是非蛋白多聚體定向偶聯(lián)口蹄疫病毒反應(yīng)原性多肽抗原用包被液按照O. 01 μ g/mL- 5 μ g/mL濃度稀釋，偶聯(lián)口蹄疫病毒反應(yīng)原性多肽抗原是通過以下方法制備得到的1)選取反應(yīng)原性多肽溶解，得到反應(yīng)原性多肽溶液；2)取非蛋白多聚體溶解，得到非蛋白多聚體溶液；3)在反應(yīng)原性多肽溶液或非蛋白多聚體溶液中加入偶聯(lián)劑，混合均勻；4)將反應(yīng)原性多肽溶液與非蛋白多聚體溶液混合均勻，攪拌反應(yīng)，使反應(yīng)原性多肽偶聯(lián)到非蛋白多聚體上；5)用透析袋去除未參與結(jié)合的偶聯(lián)劑及游離多肽，純化，凍干，得到多聚體偶聯(lián)反應(yīng)原性多肽；其中口蹄疫病毒反應(yīng)原性多肽為SEQ ID NO:1 SEQ ID NO: 18系列多肽中的一種或幾種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的口蹄疫病毒抗體的ELISA試劑盒，其特征在于所述偶聯(lián)口蹄疫病毒反應(yīng)原性多肽抗原包被液包被的酶標板是用非蛋白多聚體定向偶聯(lián)口蹄疫病毒反應(yīng)原性多肽抗原包被液包被的至少8孔的酶標板，每孔ΙΟΟμ L，4°C過夜包被，包被濃度為O. 01 μ g/mL- 5 μ g/mL,用PBST洗滌液250 μ I/孔洗滌2-4次后拍干，用封閉液150 μ I/ 孔，37°C封閉lh，洗滌液PBST 250 μ I/孔洗滌3次后拍干，放入真空袋中，加入干燥劑，抽真空，4°C保存；所述包被液為1. 59g Na2CO3, 2. 93g NaHCO3溶于800mL雙蒸水中，調(diào)節(jié)pH值至9.6，并定容至IOOOmL0
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的口蹄疫病毒抗體的ELISA試劑盒，其特征在于所述辣根過氧化物酶標記羊抗豬IgG的稀釋液是用HRP保護液按照辣根過氧化物酶標記羊抗豬IgG與 HRP保護液體積比為1: 2000-10000的比例稀釋，酶標二抗每瓶量為12mL ;所述HRP保護液為 O. 1%BSA1. Og, O. 25%EDTA2. 5g，加 PBS 至 IOOOmL0
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的口蹄疫病毒抗體的ELISA試劑盒，其特征在于所述FMDV標準陽性血清稀釋液是用抗體稀釋液按照體積比為1:16-64的比例將FMDV標準陽性血清稀釋，每管量為ImL ;FMDV標準陰性血清稀釋液用抗體稀釋液按照體積比為1:16-64的比例將FMDV標準陰性血清稀釋，每管量為lmL。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的口蹄疫病毒抗體的ELISA試劑盒，其特征在于所述抗體稀釋液為O. 1%BSA,1. Og BSA加入PBS至IOOOmL ;每瓶量為12mL。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的口蹄疫病毒抗體的ELISA檢測試劑盒，其特征在于所述底物顯色液為50mg TMB ,IOmL DMS0，9. 8g檸檬酸和L 2mL 30% H2O2加蒸餾水定容至 IOOOmL ;每管量為12mL。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的口蹄疫病毒抗體的ELISA試劑盒，其特征在于所述終止液包括雙蒸水178. 3mL和98%的濃硫酸21. 7mL,每管量為6mL。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的口蹄疫病毒抗體的ELISA試劑盒，其特征在于其還包括I 瓶洗滌液，所述洗滌液為 O. 2g KH2PO4, 2. 9g Na2HPO4 · 12Η20，8· Og NaCl，0.2g KCl，0.5mL Tween-20 (0. 05% V/V)，加雙蒸水定容至 IOOmL, pH 值為 7. 4。
10.一種口蹄疫病毒抗體的ELISA試劑盒的制備方法，其特征在于包括以下步驟1)用非蛋白多聚體定向偶聯(lián)口蹄疫病毒反應(yīng)原性多肽抗原包被液包被酶標板；2)抗體稀釋液配制；3)底物液顯色液配制；4)終止液配制；5)陰陽性血清稀釋；6)酶標二抗配制；7)試劑盒的組裝將非蛋白多聚體定向偶聯(lián)口蹄疫病毒反應(yīng)原性多肽抗原包被的酶標板I塊、陰陽性血清各I管、抗體稀釋液I瓶、酶標二抗I瓶、底物顯色液I瓶、終止液I瓶、 操作說明書一份組裝成ELISA檢測試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)檢測領(lǐng)域，具體涉及一種口蹄疫病毒(FMDV)抗體的ELISA試劑盒及其制備方法，利用非蛋白多聚體定向偶聯(lián)FMDV人工合成多肽作為抗原快速檢測口蹄疫病毒。本發(fā)明采用非蛋白多聚體定向偶聯(lián)多肽抗原作為包被液，有效提高多肽與目標抗體的結(jié)合效率，從而顯著提高可檢測靈敏度，同時顯著降低非特異背景讀值，特異性高。本發(fā)明的口蹄疫病毒抗體ELISA檢測試劑盒具有操作簡單、診斷速度快、在進行大規(guī)模檢測中經(jīng)濟方便等優(yōu)點，是一種便于普及的好方法，具有廣泛的應(yīng)用前景。采用本發(fā)明的ELISA檢測試劑盒檢測口蹄疫病毒抗體，包被抗原用量可減至10ng/mL，降低了檢測成本，有利于推廣使用。
文檔編號G01N33/68GK102998460SQ201210427310
公開日2013年3月27日 申請日期2012年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月31日
發(fā)明者李其昌, 陳善真, 李中圣, 劉小琴, 羅均, 趙焱, 陳克宏, 王貴平 申請人:廣東現(xiàn)代農(nóng)業(yè)集團研究院有限公司