子宮肌瘤診治標(biāo)志物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地設(shè)及GPSM2基因在子宮肌瘤的診斷、治療中的用 途。
【背景技術(shù)】
[0002] 子宮肌瘤是女性生殖器官中最常見的一種良性腫瘤，也是人體中最常見的腫瘤之 一，又稱為纖維肌瘤、子宮纖維瘤。由于子宮肌瘤主要是由子宮平滑肌細(xì)胞增生而成，其中 有少量纖維結(jié)締組織作為一種支持組織而存在，故稱為子宮平滑肌瘤較為確切，簡稱子宮 肌瘤?，F(xiàn)有技術(shù)中常用的子宮肌瘤檢查方法包括：
[0003] 1.超聲檢查
[0004] 為目前最為常用的輔助診斷方法。它可顯示子宮增大，形狀不規(guī)則，肌瘤數(shù)目、部 位、大小及肌瘤內(nèi)部是否均勻或液化、囊變等。超聲檢查既有助于診斷子宮肌瘤，并為區(qū)別 肌瘤是否有變性提供參考，又有助于與卵巢腫瘤或其他盆腔腫塊鑒別。
[0005] 2.診斷性刮宮
[0006] 通過宮腔探針探測子宮腔大小及方向，感覺宮腔形態(tài)，了解宮腔內(nèi)有無腫塊及其 所在部位。對于子宮異常出血的患者常需鑒別子宮內(nèi)膜病變，診斷性刮宮具有重要價值。
[0007] 3.宮腔鏡檢查
[000引在宮腔鏡下可直接觀察宮腔形態(tài)、有無寶生物，有助于黏膜下肌瘤的診斷。
[0009] 4.腹腔鏡檢查
[0010] 當(dāng)肌瘤須與卵巢腫瘤或其他盆腔腫塊鑒別時，可行腹腔鏡檢查，直接觀察子宮大 小、形態(tài)、腫瘤生長部位并初步判斷其性質(zhì)。
[0011] 5.磁共振檢查
[0012] -般情況下，無需采用磁共振檢查，如果需要鑒別診斷是子宮肌瘤還是子宮肉瘤， 磁共振尤其是增強延遲顯像有助于鑒別子宮肌瘤和子宮肉瘤。在腹腔鏡手術(shù)前，磁共振檢 查也有助于臨床醫(yī)師在術(shù)前和術(shù)中了解肌瘤的位置，減少殘留。
[0013] 但是上述檢測方法不能用于子宮肌瘤早期診斷。隨著對子宮肌瘤的組織發(fā)生學(xué)、 內(nèi)分泌學(xué)和分子遺傳學(xué)等的研究，對子宮肌瘤的發(fā)病機制和促進(jìn)子宮肌瘤生長的因素已有 了更進(jìn)一步的認(rèn)識。近年來，易感基因的研究逐漸成為子宮肌瘤研究的熱點。確定子宮肌瘤 的易感基因從而確定易感人群，為預(yù)防和治療疾病奠定基礎(chǔ)，將有可能為藥物治療的研究 提供新祀點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 本發(fā)明的目的在于提供一種可用于子宮肌瘤早期診斷的分子標(biāo)志物。相比現(xiàn)有的 子宮肌瘤的診斷方法，使用基因標(biāo)志物來診斷子宮肌瘤具有及時性、特異性和靈敏性，從而 使患者在疾病早期就能知曉疾病風(fēng)險，針對風(fēng)險高低，采取相應(yīng)的預(yù)防和治療措施。
[0015] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0016] 本發(fā)明提供了檢測GPSM2基因表達(dá)的產(chǎn)品在制備診斷子宮肌瘤的工具中的應(yīng)用。
[0017] 進(jìn)一步，所述檢測GPSM2基因表達(dá)的產(chǎn)品包括檢測GPSM2基因 mRNA水平的產(chǎn)品、和/ 或檢測GPSM2蛋白水平的產(chǎn)品。
[0018] 進(jìn)一步，所述檢測GPSM2基因表達(dá)的產(chǎn)品包括:通過RT-PCR、實時定量PCR、免疫檢 巧。、原位雜交或忍片檢測GPSM2基因表達(dá)W診斷子宮肌瘤的產(chǎn)品。
[0019] 進(jìn)一步，所述用RT-PCR診斷子宮肌瘤的產(chǎn)品至少包括一對特異擴增GPSM2基因的 引物;所述用實時定量PCR診斷子宮肌瘤的產(chǎn)品至少包括一對特異擴增GPSM2基因的引物； 所述用免疫檢測診斷子宮肌瘤的產(chǎn)品包括:與GPSM2蛋白特異性結(jié)合的抗體;所述用原位雜 交診斷子宮肌瘤的產(chǎn)品包括:與GPSM2基因的核酸序列雜交的探針;所述用忍片診斷子宮肌 瘤的產(chǎn)品包括:蛋白忍片和基因忍片；其中，蛋白忍片包括與GPSM2蛋白特異性結(jié)合的抗體， 基因忍片包括與GPSM2基因的核酸序列雜交的探針。
[0020] 所述用實時定量PCR診斷子宮肌瘤的產(chǎn)品至少包括的一對特異擴增GPSM2基因的 引物如沈Q ID NO.3和沈Q ID NO.4所示。
[0021] 所述檢測GPSM2基因表達(dá)的產(chǎn)品可W是檢測GPSM2基因表達(dá)的試劑、也可W是包含 所述試劑的試劑盒、忍片、試紙等，也可W是使用所述試劑的高通量測序平臺。
[0022] 所述診斷子宮肌瘤的工具包括但不限于忍片、試劑盒、試紙、或高通量測序平臺； 高通量測序平臺是一種特殊的診斷子宮肌瘤的工具，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，對一個 人的基因表達(dá)譜的構(gòu)建將成為十分便捷的工作。通過對比疾病患者和正常人群的基因表達(dá) 譜，容易分析出哪個基因的異常與疾病相關(guān)。因此，在高通量測序中獲知GPSM2基因的異常 與子宮肌瘤相關(guān)也屬于GPSM2基因的用途，同樣在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0023] 本發(fā)明還提供了一種診斷子宮肌瘤的工具，所述工具包括檢測GPSM2基因表達(dá)的 試劑;所述試劑包括檢巧UGPSM2基因 mRNA的引物和/或探針、檢巧UGPSM2蛋白的抗體。
[0024] 所述工具包括但不限于忍片、試劑盒、試紙、或高通量測序平臺。
[0025] 其中，所述忍片包括基因忍片、蛋白質(zhì)忍片;所述基因忍片包括固相載體W及固定 在固相載體的寡核巧酸探針，所述寡核巧酸探針包括用于檢測GPSM2基因轉(zhuǎn)錄水平的針對 GPSM2基因的寡核巧酸探針;所述蛋白質(zhì)忍片包括固相載體W及固定在固相載體的GPSM2蛋 白的特異性抗體;所述基因忍片可用于檢測包括GPSM2基因在內(nèi)的多個基因（例如，與子宮 肌瘤相關(guān)的多個基因）的表達(dá)水平。所述蛋白質(zhì)忍片可用于檢測包括GPSM2蛋白在內(nèi)的多個 蛋白質(zhì)(例如與子宮肌瘤相關(guān)的多個蛋白質(zhì)）的表達(dá)水平。通過將多個與子宮肌瘤的標(biāo)志物 同時檢測，可大大提高子宮肌瘤診斷的準(zhǔn)確率。
[0026] 其中，所述試劑盒包括基因檢測試劑盒和蛋白免疫檢測試劑盒;所述基因檢測試 劑盒包括用于檢測GPSM2基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑;所述蛋白免疫檢測試劑盒包括GPSM2蛋白的 特異性抗體。進(jìn)一步，所述試劑包括使用RT-PCR、實時定量PCR、免疫檢測、原位雜交或忍片 方法檢測GPSM2基因表達(dá)水平過程中所需的試劑。優(yōu)選度，所述試劑包括針對GPSM2基因的 引物和/或探針。根據(jù)GPSM2基因的核巧酸序列信息容易設(shè)計出可W用于檢測GPSM2基因表 達(dá)水平的引物和探針。
[0027] 所述試紙包括檢測GPSM2基因表達(dá)的試劑。
[002引所述高通量測序平臺包括檢測GPSM2基因表達(dá)的試劑。
[00巧]與GPSM2基因的核酸序列雜交的探針可W是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、PNA或其它 衍生物。所述探針的長度沒有限制，只要完成特異性雜交、與目的核巧酸序列特異性結(jié)合， 任何長度都可W。所述探針的長度可短至25、20、15、13或10個堿基長度。同樣，所述探針的 長度可長至60、80、100、150、300個堿基對或更長，甚至整個基因。由于不同的探針長度對雜 交效率、信號特異性有不同的影響，所述探針的長度通常至少是14個堿基對，最長一般不超 過30個堿基對，與目的核巧酸序列互補的長度W15-25個堿基對最佳。所述探針自身互補序 列最好少于4個堿基對，W免影響雜交效率。
[0030] 進(jìn)一步，所述GPSM2蛋白的特異性抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體。所述GPSM2蛋 白的特異性抗體包括完整的抗體分子、抗體的任何片段或修飾（例如，，嵌合抗體、scFv、 化6、尸(曰6'）2、尸乂等。只要所述片段能夠保留與6口512蛋白的結(jié)合能力即可。用于蛋白質(zhì)水平 的抗體的制備時本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且本發(fā)明可W使用任何方法來制備所述抗體。
[0031] 在本發(fā)明的具體實施方案中，所述檢測6口512基因1111?酷的引物包括569 10^.3和 SEQ ID NO.4所示的引物對。
[0032] 本發(fā)明還提供了 GPSM2基因和/或其表達(dá)產(chǎn)物的抑制劑在制備治療子宮肌瘤的藥 物中的應(yīng)用。所述抑制劑包括抑制GPSM2基因表達(dá)的試劑、和/或抑制GPSM2基因表達(dá)產(chǎn)物的 試劑。
[0033] 進(jìn)一步，所述抑制GPSM2基因表達(dá)的試劑包括抑制基因轉(zhuǎn)錄的試劑、抑制基因翻譯 的試劑;所述抑制GPSM2基因表達(dá)產(chǎn)物的試劑包括抑制GPSM2基因 mRNA的試劑、抑制GPSM2蛋 白的試劑。所述抑制GPSM2基因 mRNA的試劑包括抑制mRNA穩(wěn)定性的試劑、抑制mRNA翻譯活性 的試劑。所述抑制GPSM2蛋白的試劑包括抑制GPSM2蛋白穩(wěn)定性的試劑、抑制GPSM2蛋白活性 的試劑、抑制GPSM2蛋白功能的試劑。
[0034] 進(jìn)一步，抑制GPSM2基因 mRNA的試劑包括針對GPSM2基因 mRNA的雙鏈核糖核酸;抑 制GPSM2蛋白功能的試劑包括GPSM2抗原蛋白的腫瘤疫苗、抑制GPSM2蛋白功能的抗體。所述 抗體可W是多克隆抗體，或是單克隆抗體。
[0035] 在本發(fā)明的具體實施方案中，所述針對GPSM2基因 mRNA的雙鏈核糖核酸是siRNA。 為了確保GPSM2基因能夠被高效剔除或沉默，根據(jù)GPSM2基因的mRNA序列設(shè)計了 siRNA特異 性片段。siRNA的設(shè)計根據(jù)已發(fā)表的通用設(shè)計原則化化ashir et.al 2001，Schwarz et.al 2003,趾vorova et.al 2003，Reynolds et.al 2004，Hsieh et.al 2004，Ui-Tei et.al 2004)，通過在線工具完成設(shè)計，該在線工具為：siRNASelectionProgram of肺itehead Institute(BingbingYuan et.al 2004，http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/)和 BLOCK-iTTM RNAi Designer ofINVITR0GEN(winner of the 2004Frost&Sul1ivan Excellence in Research AwarcUhttps ://rnaidesigner. invitrogen. com/sirna/)。為了 進(jìn)一步提高SiRNA片斷的有效性，綜合兩個在線設(shè)計工具的優(yōu)點來設(shè)計用于篩選的SiRNA片 斷。最后，通過同源性比對(NCBI BLAST)來過濾S iRNA序列，W提高S iRNA片斷的特異性并減 少RNAi干擾的脫祀效應(yīng)。
[0036] 優(yōu)選地，所述siRNA的序列如沈Q ID NO.7和沈Q ID NO.8所示。
[0037] 本發(fā)明還提供了一種用于治療子宮肌瘤的藥物組合物，所述藥物組合物包括上面 所述的GPSM2基因和/或其表達(dá)產(chǎn)物的抑制劑