一種用于檢測豬細(xì)小病毒和豬圓環(huán)病毒2型病毒及其混合感染的試劑盒和方法
【專利摘要】本發(fā)明的一個目的是提供一種檢測豬細(xì)小病毒和豬圓環(huán)病毒2型病毒的核苷酸引物，分別為PPVF、PPVR、PCV2F和PCV2R，其中序列PPVF和PPVR為檢測豬細(xì)小病毒的正義引物和反義引物，序列PCV2F和PCV2R為檢測豬圓環(huán)病毒2型的正義引物和反義引物。本發(fā)明提供的豬細(xì)小病毒和豬圓環(huán)病毒2型兩重PCR檢測方法，一次反應(yīng)能同時檢測出PPV和PCV2兩種病毒，所用2對引物特異性較好，引物相互之間有較低的同源性及互補性，所述引物敏感性較好。該方法具有簡便、快速、經(jīng)濟、高效等優(yōu)勢，利于臨床的大量檢測，在臨床診斷上具有較好的應(yīng)用前景。
【專利說明】—種用于檢測豬細(xì)小病毒和豬圓環(huán)病毒2型病毒及其混合感染的試劑盒和方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明提供了一種檢測豬細(xì)小病毒、豬圓環(huán)病毒2型病毒及其混合感染的試劑盒和方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
技術(shù)背景
[0002]豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus, PP V)、豬圓環(huán)病毒2型病毒(Porcinecircocirus type2，PCV2)是目前常見的引起豬繁殖障礙病的DNA病毒。目前，
[0003]很多豬場都存在上述病毒引起的疾病，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。臨床上常呈現(xiàn)混合感染，主要表現(xiàn)為受感染母豬產(chǎn)死胎、畸形胎、木乃伊胎及病弱仔豬，不容易區(qū)分。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的一個目的是提供一種檢測豬細(xì)小病毒和豬圓環(huán)病毒2型病毒的核
[0005]苷酸引物，分別為PPVF、PPVR、PCV2F和PCV2R，其中序列PPVF和PPVR為檢測豬細(xì)小病毒的正義引物和反義引物，序列PCV2F和PCV2R為檢測豬圓環(huán)病毒2型的正義引物和反義引物。
[0006]本發(fā)明的第二個目的是提供一種用于檢測豬細(xì)小病毒和豬圓環(huán)病毒2型病 [0007]毒的試劑盒，由以下組分組成:(I) DNA提取試劑為購自北京康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司的DNA提取試劑盒；(2) 2 X PCR Mix，包含終濃度為0.4mM的dNTP、4.0mM的MgS04、80mM的KCl、20mM的Tris-Cl和0.1U/ μ L的Taq DNA聚合酶；(3)引物混合液，含終濃度
12μ M的豬細(xì)小病毒正義引物和反義引物，同時含終濃度為10 μ M的豬圓環(huán)病毒2型正義引物和反義引物；(4) DNA陽性對照，包含35 μ g/mLPPV和30 μ g/mLPCV2 ； (5)陰性對照=DEPC水；(6)高壓滅菌水；
[0008]本發(fā)明的第三個目的是提供一種用于檢測豬細(xì)小病毒和豬圓環(huán)病毒2型病毒及其混合感染的方法，包括如下步驟:
[0009](I)提取樣品總DNA ；
[0010](2)用權(quán)利要求1中所述引物對待測樣本進(jìn)行PCR擴增，PCR反應(yīng)體系為:2XPCRMixl2.5 μ L、引物混合液2 μ L、模板I μ L、高壓滅菌水9.5 μ L，總體積25 μ L ;擴增條件為94°C預(yù)變性5min，94°C變性30S，57°C退火30S，72°C延伸45S，循環(huán)35cycles，最后72°C延伸8min。同時設(shè)陰性對照和陽性對照，陽性對照含
[0011]35 μ g/mLPPV 和 30 μ g/mLPCV2，陰性對照為 DEPC 水；
[0012](3)電泳；
[0013](4)結(jié)果分析。
[0014]本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明提供的豬細(xì)小病毒和豬圓環(huán)病毒2型兩重PCR檢測方法，一次反應(yīng)能同時檢測出PPV和PCV2兩種病毒，所用2對引物特異性較好，引物相互之間有較低的同源性及互補性，所述引物敏感性較好。該方法具有簡便、快速、經(jīng)濟、高效等優(yōu)勢，利于臨床的大量檢測，在臨床診斷上具有較好的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為PPV、PCV2兩重PCR以及單項PCR電泳圖結(jié)果
[0016]圖2為PPV、PCV2兩重PCR特異性電泳圖結(jié)果
[0017]圖3(3a、3b)為PPV、PCV2兩重PCR敏感性電泳圖結(jié)果
【具體實施方式】
[0018]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0019]實施例1豬細(xì)小病毒(PPV)、豬圓環(huán)病毒2型病毒(PCV2)、兩重PCR檢測方法建立。
[0020]I引物設(shè)計:在GenBank中查找多個毒株,對其進(jìn)行同源性分析,利用Primer5對上述保守區(qū)進(jìn)行引物設(shè)計，對設(shè)計出來的兩種病毒引物進(jìn)行引物二聚體分析，以避免引物之間形成穩(wěn)定的引物二聚體，并對每對引物的擴增序列進(jìn)行同源性或互補性分析，避免它們之間有較高的同源性或互補性，從而確定2種病毒的引物序列，見表1。
[0021]表1
[0022]
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測豬細(xì)小病毒和豬圓環(huán)病毒2型病毒及其混合感染的試劑盒和方法，其特征在于檢測豬細(xì)小病毒和豬圓環(huán)病毒2型的核苷酸引物為PPVF、PPVR、PCV2F和PCV2R，其中序列PPVF和PPVR分別為檢測豬細(xì)小病毒的正義弓丨物和反義引物，序列PCV2F和PCV2R分別為檢測豬圓環(huán)病毒2型的正義引物和反義引物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于檢測豬細(xì)小病毒和豬圓環(huán)病毒2型病毒及其混合感染的試劑盒和方法，其特征在于，所述的試劑盒由以下組分組成: (1)DNA提取試劑； (2)2 XPCR Mix:由 dNTP、MgSO4'KCl'Tris-Cl 緩沖液和 Taq DNA 聚合酶等組成； (3)引物混合液:內(nèi)含終濃度為12μ M的豬細(xì)小病毒正義引物和反義引物，同時含終濃度為10 μ M的豬圓環(huán)病毒2型正義引物和反義引物。 (4)DNA陽性對照； (5)陰性對照=DEPC^K; (6)高壓滅菌水；
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述DNA提取試劑為DNA提取試劑盒。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，其中所述2XPCRMix包含終濃度為0.4mM 的 dNTP、4.0mM 的 MgS04、80mM 的 KCl、20mM 的 Tris-Cl 和 0.1U / μ L 的 Taq DNA 聚合酶，所述的檢測豬細(xì)小病毒正義引物和反義引物終濃度均為12 μ Μ，所述的檢測豬圓環(huán)病毒2型的正義引物和反義引物終濃度均為10 μ Μ。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，其中所述陽性對照包含30μ g / mLPPV和 30μ g / mLPCV2o
6.一種用于檢測豬細(xì)小病毒和豬圓環(huán)病毒2型病毒及其混合感染的方法，其特征在于所述的方法包括如下步驟: (1)提取樣品總DNA; (2)用權(quán)利要求1中所述引物對待測樣本進(jìn)行PCR擴增； (3)電泳； (4)結(jié)果分析。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，PCR擴增反應(yīng)體系為:2XPCRMixl2.5 μ L、引物混合液2 μ L、模板I μ L、高壓滅菌水9.5 μ L,總體積25 μ L ;擴增條件為94°C預(yù)變性 5min，94°C變性 30S，57°C退火 30S，72°C延伸 45S，循環(huán) 35cycles ;最后 72。。延伸 8min。
【文檔編號】C12Q1/68GK103820572SQ201310737274
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2013年12月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月24日
【發(fā)明者】張志剛, 董劍輝, 張文利, 張曉杰, 李爽 申請人:北京偉嘉人生物技術(shù)有限公司