專利名稱：：一種豬細小病毒活疫苗的制作方法一種豬細小病毒活疫苗
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種豬細小病毒活疫苗，屬于微生物學動物用生物制品領域。
背景技術：
：豬細小病毒病是由豬細小病毒(PorcineParvovirus-PPV)感染而引起的胚胎感染及死亡，而母豬不表現明顯癥狀的繁殖障礙性疾病。本病廣泛分布于世界各地，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經濟損失。豬細小病毒是一種非常頑固的病原，該病會導致傳染性不孕，是一種特別常見而且特別重要的疾病。豬細小病毒在豬的小腸中繁殖，通常不表現臨床癥狀。世界各地均有分布，如果在豬場里取樣化驗，大多會檢測到這種病原，這種病毒在環(huán)境中可存活數月之久，且對大多數消毒劑都具有抵抗力，因此，這種病分布非常廣泛，且很難根除。至今各地分離到的PPV經血凝抑制(HJ)試驗及血清中和(SN)試驗證明，同屬一個血清型。豬細小病毒(PPV)是引起母豬繁殖障礙的主要病原之一。PPV病的主要傳染源是感染了PPV的母豬。仔豬、胚胎主要是被感染PPV的母豬在其生產前經胎盤或在其生產后經口垂直感染。公豬、育肥豬主要是通過被污染的食物、環(huán)境，經呼吸道、消化道感染。初產母豬主要是經PPV陽性公豬交配時感染。該病在我國污染十分嚴重，陽性率為90%以上，幾乎很難找到一個PPV陰性的豬場，說明PPV病是普遍存在的。正由于豬細小病毒感染面廣且感染后造成嚴重的經濟損失，許多學者進行了豬細小病毒病診斷防治的研究。疫苗接種是預防PPV感染，提高母豬繁殖率的有效方法。一般的免疫程序為在母豬配種前24周，頸部肌肉分點注射疫苗；種公豬于8月齡時首次免疫接種，以后每年一次，每次頸部肌肉分點注射疫苗。在豬體內被動免疫水平很低的情況下接種滅活苗，不會影響其免疫力，當第二次免疫接種時，PPV疫苗可提供良好和持久的免疫應答，以對抗PPV感染引起的繁殖障礙。因此，研制出一種簡單、實用、有效的PPV疫苗成為各國專家學者共同努力的目標。目前己經研制出并大規(guī)模使用的疫苗有滅活疫苗和弱毒細胞培養(yǎng)凍干活疫苗。此外，隨著免疫學和分子生物學的日益發(fā)展，也有許多正在研制的或有發(fā)展前景的新型疫苗。在國外PaulPS，MengelingWL(AmJVetRes,1980,41:2007-2011)，FujisakiY，KurikamiY(NatlInstAnimHealth(Tokyo)，1982，22:36-37)，先后研制出弱毒疫苗。Paul和Mengeling的PPV毒株NADL-2是最先應用于臨床的弱毒疫苗株，該毒株通過PFK(Porcinefetalkidney)細胞培養(yǎng)制苗，每代培養(yǎng)物用免疫熒光顯微法、血細胞凝集試驗來檢査PPV的感染。血凝效價的范圍在2512，而細胞感染率的范圍在5%80%;用于制苗的54代PPV培養(yǎng)物的感染效價為106CCID5。/ml;血凝效價為64/0.5ml。因PFK(Porcinefetalkidney)細胞的制備涉及到豬，其豬源及質量直接影響到所制備細胞的品質。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的是通過利用蝕斑純化技術對上世紀80年代從美國引進的一株豬細小病毒弱毒NADL-2株中，克隆出一株具有良好免疫原性和安全性的小蝕斑病毒，通過在傳代細胞中的培養(yǎng)，以工廠化生產方法生產出安全、有效的預防豬細小病毒活疫苗。本發(fā)明用經過克隆純化的豬細小病毒ZH克隆株病毒通過接種對其敏感的傳代細胞單層細胞，37。C培養(yǎng)56天，當80%以上的細胞出現細胞病變時，收獲病毒細胞培養(yǎng)物；將收獲病毒細胞培養(yǎng)物經熒光抗體法測定，0.lml病毒含量應^10"FA-TCID5。、含毒病毒液對1%豚鼠紅細胞血凝價應》1:256為合格；將收獲病毒細胞培養(yǎng)液加入常規(guī)的凍干保護劑，充分混合后分裝后經冷凍干燥而制成凍干活疫苗。具體實施方案1.毒種克隆純化豬細小病毒弱毒株NADL-2病毒(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供)在瓊脂糖作為覆蓋物的傳代細胞株ST細胞.(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供)上形成了大、中、小三種蝕斑，從中篩選到符合我們要求的小蝕斑克隆株能在ST細胞上產生明顯細胞病變(CPE)、高增殖力的弱毒株，并命名為豬細小病毒ZH株(PorcineParvovirusZH，本菌株已于2008年10月13日送交北京市大屯中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCCNo2702)。2.豬細小病毒ZH株的特性(1)蝕斑形狀接種后96120h，出現肉眼可見的蝕斑。蝕斑形態(tài)較規(guī)則，略呈圓形，斑徑約為lmm以下的小蝕斑。(2)蝕斑培養(yǎng)物病毒含量測定1)TCID5o測定ZH株培養(yǎng)物的病毒滴度平均為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>，而原始毒株、大蝕斑和中蝕斑培養(yǎng)物的病毒滴度分別為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>。2)FA-TCIDm測定用細胞生長液含10%犢牛血清的細胞生長液(MEM培養(yǎng)基和犢牛血清購自美國HYclone公司)將ZH株培養(yǎng)物作10倍系列稀釋，取l(T、10—6、10—73個稀釋度病毒液，與ST細胞同步接種細胞"飛片"(飛片在細胞培養(yǎng)瓶中放置的用于培養(yǎng)單層細胞的1/2塊蓋玻片)，每個滴度4管，每孔加病毒稀釋液100^、ST細胞懸液900叱。同時設病毒陽性對照和細胞陰性對照，37"培養(yǎng)7296小時，用熒光抗體法計算FA-TCID5。。每0.lml病毒含量應》10611FA-TCID冊。(3)病毒粒子形態(tài)在病毒培養(yǎng)物中觀察到直徑為22nm圓形或六角形的病毒粒子。(4)理化特性測定結果病毒在5(TC和55'C水浴作用30min，增殖滴度無明顯變化，70'C水浴作用30min增殖滴度有較大的下降，而75'C和8CTC水浴作用30min感染性完全喪失；56。C作用15min、30min感染力無顯著下降，作用45min時開始下降，而作用60min時增殖滴度有較大的下降。ZH株病毒對酸堿的敏感性不強，能耐受pH3.09.0的環(huán)境。ZH株病毒不但對胰蛋白酶不敏感，而且胰蛋白酶處理后病毒的增殖滴度還略有升高。(5)病毒的血凝性ZH株病毒能夠凝集豚鼠的紅細胞，血凝價可達1:29;該病毒血凝特性能夠被特異性兔抗豬細小病毒陽性血清(購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)所抑制，中和后再接種ST傳代細胞，37'C培養(yǎng)未出現病變，盲傳2代，也無病變產生。(6)病毒非結構蛋白NS1基因的擴增和序列鑒定以提取病毒基因組復制型DNA為模板，用設計的Pl和P2引物擴增出了大小約為1.98k的條帶，結果與預期的大小一致，而正常對照細胞中未擴增出目的條帶。擴增產物的電泳結果見附圖1。將其目的條帶回收，與pGEM-TEasy載體(購自Promega公司)連接，轉化至TOPIO(購自Promega公司)，提取質粒，酶切鑒定結果見附圖2，然后陽性質粒送英駿公司測序，結果得到了與預期一樣大小的1.98kb序列。將測得的序列，運用生物學軟件DNAMAN(LynnonBiosoft)進行比對，結果與NADL—2標準株有99.38%的同源性。(7)病毒增殖穩(wěn)定性對克隆篩選的ZH株在ST細胞上傳代的第1代、3代、5代分別進行病毒的TCIDmj檢測和穩(wěn)定性試驗。結果分別為1058TCID5()/0.1ml、1067TCID5o/0.1ml、1059TCID5()/0.1ml，表明豬細小病毒ZH株經傳5代，依然穩(wěn)定，產生CPE明顯，仍保持高的增殖力。(8)安全性1)對乳鼠的安全性選取47日齡的乳鼠5只，每只皮下注射病毒液0.lml。并設不接種的乳鼠5只作為對照，觀察7日。乳鼠應不出現因接種病毒導致的不良反應。2)對妊娠母豬的安全性取懷孕3050日齡PPV抗體陰性(血清HI抗體《1:8)的初產妊娠母豬4頭，各肌肉注射病毒液2ml。連續(xù)觀察21天，應無任何異常；一直觀察到分娩，應無流產、早產、死胎、弱仔等臨床癥狀表現，從其所產全部胎兒的血液或臟器中均不能分離出病毒。(9)免疫原性按本發(fā)明所制訂的豬細小病毒活疫苗的制備方法，將病毒制成疫苗后進行試驗。1)用初產后備母豬5頭(PPVHI抗體《1:8)(HI的測定方法見附注)，配種前肌肉注射疫苗1頭份，在妊娠3050天時，連同條件相同的對照豬4頭，28天后肌肉注射豬細小病毒強毒株106"FA-TCID,觀察至分娩。對照豬應至少3頭出現流產、死胎、木乃伊胎或胎兒重吸收等繁殖障礙癥狀，免疫豬應至少保護4頭。2)將疫苗經頸部肌肉注射5月齡健康易感豬(PPVHI抗體《1:8)4頭，每頭1頭份，接種后28天連同條件相同的對照豬3頭，分別采血，分離血清，測定血清HI抗體水平。對照豬HI效價均應《1:8，免疫豬至少有3頭HI效價>1:128。3)最小免疫劑量豬細小病毒活疫苗(ZH株)的4種不同劑量(l(TFA-TCIDs。/頭份、10"FA-TC瓜。/頭份、10'"FA-TCIDJ頭份和1035FA-TC瓜。/頭份)接種易感母豬后均無不良臨床反應出現。免疫后第50天，用PPV7909標準強毒株攻擊后，當易感母豬的免疫劑量低于10"FA-TCIDV頭份時，有13頭母豬能抵抗強毒的攻擊，當免疫劑量大于等于l(TTCID5。/頭份時所有母豬均能抵抗強毒的攻擊，對照組的豬攻毒后出現采食減少，精神不振，均有不同程度的發(fā)病。最小免疫劑量測定結果表明，當易感母豬免疫劑量大于等于10"FA-TCIDJ頭份時所有母豬均能抵抗強毒的攻擊，因此將研制的豬細小病毒活疫苗(ZH株)的最小免疫劑量確定為10"FA-TCID5。/頭份。本發(fā)明所指"易感母豬"即為經血清學檢査細小病毒抗體陰性，對細小病毒敏感的母豬。(10)豬細小病毒ZH株在不同細胞中的增殖1)細胞適應性研究結果將病毒與ST、IBRS-2、PK1豬睪丸傳代細胞系(ST)、豬腎傳代細胞系(PK15)購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；仔豬腎傳代細胞系(1BRS-2)購自中國典型物保藏中心(武漢大學)等同步培養(yǎng)出現了細胞病變，有的在接種后36小時就可以觀察到病變，到72小時病變達到80%以上，主要表現為細胞圓縮、聚集、拉網、脫落。2)DMEM生長液與MEM生長液對病毒增殖影響的比較在同樣的培養(yǎng)條件下，用DMEM和MEM含10。/4賣牛血清的DMEM生長液或MEM生長液(培養(yǎng)基和犢牛血清購自美國HYclone公司)作為細胞生長液，維持液犢牛血清為2%分別培養(yǎng)了3批ST和IBRS-2細胞，并按常規(guī)方法接毒、測毒。在同樣的培養(yǎng)條件下，用謹EM和MEM分別培養(yǎng)了3批ST和IBRS-2細胞，并按常規(guī)方法接毒，結果用兩種不同培養(yǎng)基增殖的病毒的滴度無顯著差異，說明在生產上可以根據情況選擇不同的培養(yǎng)基進行豬細小病毒ZH株的大量培養(yǎng)。3)不同細胞的培養(yǎng)和病毒的繁殖分別在中方瓶、大扁瓶中按常規(guī)方法培養(yǎng)ST、PK15、朋K21、I服S-2，在細胞液中按12呢的比例同歩接種加入豬細小病毒ZH株，37"C培養(yǎng)，觀察細胞病變。當細胞病變達80%時收毒，然后在細胞上用熒光法測定其FA-TCID5。。結果如下表l:表lPPV-ZH株病毒在ST、IBRS-2、PK15細胞中的增殖滴度(FA-TCID.VO.lml)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>比較結果表明，按Reed-Muench法計算，在相同的條件下在豬睪丸原代細胞、IBRS-2、PK-15這3種不同細胞上培養(yǎng)豬細小病毒ZH株，結果病毒在3種細胞中都能穩(wěn)定地增殖，說明3種細胞都能用于豬細小病毒ZH株的增殖培養(yǎng)，其中豬睪丸原代細胞(ST)培養(yǎng)病毒增殖滴渡略高于其他兩種細胞。(11)疫苗的安全性試驗結果表明，超劑量接種懷孕3050天的妊娠母豬，所有試驗動物精神狀態(tài)良好，食欲正常，無異常反應；單劑量3次重復接種后備母豬，未出現異常反應，說明該疫苗單劑量重復注射安全可靠；超劑量疫苗(IO倍使用劑量)接種后備母豬，均未發(fā)現任何異常反應，表明安全可靠；疫苗毒不能水平傳播。以上所有試驗證明疫苗是十分安全的。(12)疫苗免疫效力本發(fā)明研究結果表明，該疫苗可以通過深部肌肉注射免疫效果較好；疫苗的最小免疫劑量為每頭份含毒10"FA-TCID5o;PPVHI抗體效價與攻毒保護具有相關性，當PPVHI抗體滴度^6l。g2時，能夠抵抗強毒的攻擊。采用微量血凝抑制試驗測定3批實驗室產品豬細小病毒病(ZH株)活疫苗免疫母豬后抗體消長和仔豬母源抗體,進行免疫持續(xù)期的評估.免疫母豬的PPVHI抗體在免疫后第7天時即可檢出，7天后逐漸升高，21天后達到高峰，此抗體可維持到150天，以后開始下降，180天后大多數開始為陰性(低于1:64)。仔豬出生后在第3天即可檢測到PPVHI抗體，第14天達到高峰，50天以后持續(xù)下降，第60天抗體大部分為陰性(低于1:64)。免疫豬細小病毒活疫苗(ZH株)的母豬所產仔豬獲得母源抗體維持期為50天。(13)疫苗保存期試驗疫苗在28'C保存9個月的疫苗以及在一15°C以下保存24個月的疫苗2頭份/頭注射47H齡的乳鼠和豬(10頭份)，均無任何臨床不良反應，注射部位也無任何異常變化；在28'C保存9個月的疫苗以及在一15'C以下保存24個月的疫苗分別免疫300500g豚鼠各5只，l頭份/只，免疫后21天，免疫組豚鼠的抗體效價均》6l。g2，對照組豚鼠的抗體效價均《3iog2，安全試驗和效力試驗證明疫苗在28'C保存9個月的疫苗以及在一15。C以下保存24個月仍然安全有效。(14)關于疫苗的免疫程序為確定疫苗的免疫期，進而制定疫苗的免疫程序，本發(fā)明人將研制的3批豬細小病毒病活疫苗，分別用不同批次的疫苗免疫后備母豬和種公豬，免疫后定期檢測PPVHI抗體并攻毒，試驗結果表明，母豬的免疫期定為5個月，免疫豬細小病毒活疫苗(ZH株)的母豬所產仔豬獲得母源抗體維持期為50天.說明母豬配種前免疫1次，可保護1個產仔周期，公豬免疫l次的免疫期也為5個月。所以在試行規(guī)程中將疫苗的用法用量及免疫程序規(guī)定為按瓶簽注明的頭份，用滅菌生理鹽水或專用稀釋液稀釋疫苗，深部肌肉注射，1頭份/頭/次。留作種用后備豬在2月齡時免疫一次，母豬每次配種前23周各免疫一次，公豬于6月齡時首免，以后每半年免疫l次。3.疫苗制備將形成良好單層的ST細胞消化后制備細胞懸液，按細胞生長液總量的1%2%加入豬細小病毒ZH株種毒液接種到細胞培養(yǎng)瓶中，置37'C培養(yǎng)。接種后72120小時，當細胞病變達到80%以上時，即可收獲。凍融后，收集于滅菌的容器中，并取樣進行檢驗-毒價測定按熒光抗體法進行測定，0.lml病毒含量應》l(f"FA-TCIDs。。(熒光抗體法測定病毒含量用細胞生長液將病毒作IO倍系列稀釋，取10—510—6、10—73個稀釋度病毒液，與ST細胞同步接種細胞"飛片"，每個滴度4管，每孔加病毒稀釋液100叱、ST細胞懸液900叱。同時設病毒陽性對照和細胞陰性對照，37'C培養(yǎng)7296小時，用熒光抗體法計算FA-TCID5。(邵振華，田海燕.多價熒光抗體監(jiān)測外源病毒污染的研究[J].中國獸藥雜志.1997,31(2):1-6.)每O.lml病毒含量應》106.0FA-TCID50)。紅細胞凝集價測定含毒細胞液對1%豚鼠紅細胞血凝價應>1:256。將檢驗合格的細胞毒液，混合于同一滅菌容器內，并按一定比例加入常規(guī)的凍干穩(wěn)定劑，同時加入適宜的抗生素，充分搖勻，定量分裝，使每頭份病毒含量應>105.2FA-TCID50，分裝后按常規(guī)方法進行冷凍真空干燥(中國獸藥典委員會.中國獸藥典二OO五年版三部.中國農業(yè)出版社，2005.)。4豬細小病毒活疫苗(zh株)的質量標準(1)安全檢驗下述兩種方法任擇其一。1)用乳鼠檢驗取47日齡同窩健康乳鼠5只，各皮下注射2頭份，觀察7天，均健活，應無任何臨床不良反應。如有死亡，可重檢一次。2)用豬檢驗用豬細小病毒HI抗體陰性豬2頭，各深部肌肉注射疫苗IO頭份，另取條件相同的2頭豬不接種作為對照，觀察21日，試驗豬和對照豬均應無不良臨床反應。(2)效力檢驗下述兩種方法任擇其一。1)病毒含量測定用不含血清的細胞營養(yǎng)液將疫苗稀釋至1頭份/ML，再作10倍系列稀釋，取10—4、10—5、10—6三個稀釋度的病毒液，與st細胞同歩接種細胞"飛片"，每個滴度4管，每孔加病毒稀釋液IOOPL、ST細胞懸液900A。同時設病毒陽性對照和細胞陰性對照，37。C培養(yǎng)7296小時，用熒光抗體法計算FA-TCIDs。。每頭份疫苗病毒含量應SIO5。FA-TCID,2)抗體檢測用體重350g以上HI抗體陰性(HI抗體效價《1:8)豚鼠5只各肌肉注射疫苗l頭份。21日后，連同條件相同的對照豚鼠2只，釆血，測定抗體，對照豚鼠應為陰性，注苗豚鼠其HI效價應》1:64。如達不到上述要求，可復檢一次?；蛴秘i細小病毒HI抗體陰性豬4頭(HI抗體效價《1:8)，各深部肌肉注射疫苗1頭份，另取條件相同的2頭豬不接種作為對照，28日后，連同條件相同的對照豬92頭，采血，測定抗體，對照豬應為陰性，注苗豬應全部出現抗體反應，其HI效價應》1:64。(3)用途用于預防豬細小病毒感染。(4)用法與用量按瓶簽注明的頭份，用滅菌生理鹽或專用稀釋液稀釋疫苗，深部肌肉注射，l頭份/頭/次。留作種用后備豬在2月齡時免疫一次，母豬每次配種前23周免疫一次，公豬于6月齡時首免，以后每半年免疫l次。本發(fā)明涉及的豬細小病毒ZH株(本菌株已于2008年10月13日送交北京市大屯中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCCNo2702)。附圖1豬細小病毒ZH株PCR擴增基因電泳圖A:Marker;B:ST細胞對照；C:ZH病毒培養(yǎng)物NS1。附圖2重組質粒酶切鑒定電泳圖1:Marker(DL15000);7:Marker(DL2000);2,3,4，5，6為陽性質粒。本發(fā)明的優(yōu)點本發(fā)明所涉及的豬細小病毒ZH株(CGMCCNo2702)是一株與NADL-2具有極高的同源性、保持高的增殖力，病毒含量明顯高于原始毒株而且穩(wěn)定，具有更好的免疫原性。使用傳代細胞增殖豬細小病毒病毒生產豬細小病毒活疫苗，對穩(wěn)定疫苗質量非常有利。本發(fā)明所涉及的疫苗用于預防豬細小病毒感染安全有效，且免疫豬細小病毒活疫苗的母豬所產仔豬獲得母源抗體維持期為50天。權利要求1.一種豬細小病毒活疫苗，其特征在于含有豬細小病毒CGMCCNoCGMCCNo2702病毒和常用的凍干保護劑，每頭份疫苗病毒含量應≥105.0FA-TCID50。2.—種豬細小病毒活疫苗的制備方法，其特征在于用豬細小病毒CGMCCNo2702病毒通過接種豬睪丸傳代細胞ST的單層細胞，37'C培養(yǎng)56天，當80%以上的細胞出現細胞病變時，收獲病毒細胞培養(yǎng)物；將收獲病毒細胞培養(yǎng)物經熒光抗體法測定，0.lml病毒含量應》106°FA-TCID5。、含毒病毒液對1%豚鼠紅細胞血凝價應>1:256為合格；將收獲病毒細胞培養(yǎng)液加入常用的凍干保護劑，充分混合后分裝后經冷凍干燥而制成凍干活疫苗。3.如權利2所述的一種豬細小病毒活疫苗的制備方法，其特征在于可以用仔豬腎傳代細胞系1BRS-2細胞取代制苗過程培養(yǎng)病毒所用的ST細胞。全文摘要本發(fā)明涉及一種豬細小病毒活疫苗。本發(fā)明所涉及的豬細小病毒ZH株(CGMCCNo2702)是一株與NADL-2具有極高的同源性、保持高的增殖力，病毒含量明顯高于原始毒株而且穩(wěn)定，具有更好的免疫原性。以該毒株作為活疫苗生產毒株制備的疫苗，超劑量接種懷孕30～50天的妊娠母豬、單劑量3次重復接種后備母豬、超劑量疫苗(10倍使用劑量)接種后備母豬，均未發(fā)現任何異常反應；免疫豬細小病毒活疫苗的母豬所產仔豬獲得母源抗體維持期為50天。疫苗毒不能水平傳播。文檔編號A61K39/125GK101380470SQ200810224278公開日2009年3月11日申請日期2008年10月15日優(yōu)先權日2008年10月15日發(fā)明者劉業(yè)兵,曄孫,邵振華,金銀珍申請人:北京海淀中海動物保健科技公司