一種豬繁殖與呼吸綜合征復合活疫苗用凍干保護劑的制作方法
【專利摘要】一種豬繁殖與呼吸綜合征復合活疫苗用凍干保護劑，屬于凍干保護劑【技術領域】。該凍干保護劑每1000ml磷酸緩沖液中含有中藥多糖30～100g、中藥黃酮20～60g、維生素6～10g、法氏囊素2～16mg、明膠4～6g和蔗糖40～70g，所述的中藥多糖和中藥黃酮從以下中藥組合物中提取得到：生地、懷牛膝、桑白皮、茯苓、蘆根、淫羊藿、生甘草和問荊。該凍干保護劑能夠大幅度提高了機體的免疫力，提高體液免疫能力，刺激機體產生高效的中和抗體，提高了機體預防疾病的能力。
【專利說明】一種豬繁殖與呼吸綜合征復合活疫苗用凍干保護劑
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于凍干保護劑【技術領域】，具體涉及一種豬繁殖與呼吸綜合征復合活疫苗用凍干保護劑。
【背景技術】
[0002]豬藍耳病又稱豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratorysyndrome, PRRS),是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive andrespiratory syndrome virus, PRRSV)引起的，以妊娠母豬發(fā)生早產、流產、產死胎、弱仔和木乃伊胎，仔豬和育肥豬發(fā)生呼吸道癥狀的疾病。PRRS難以有效的防制，首先是PRRSV以肺巨噬細胞為靶細胞，具有抗體依賴性增強作用(ADE)造成了一定的免疫抑制，其次是PRRSV不斷的發(fā)生著變異，并且PRRS沒有有效的治療藥物，免疫接種是目前控制該病的最主要措施。
[0003]豬繁殖與呼吸綜合征弱毒疫苗具有免疫效果好，免疫期長等優(yōu)點，而且弱毒疫苗還可以用來對母豬免疫接種而使幼仔獲得被動免疫。研究表明，活疫苗的使用在臨床疾病的發(fā)生和嚴重性、病毒血癥持續(xù)期和排毒等情況都有積極的影響?；钜呙绲拿庖呖梢砸鸺毎庖?，可抵抗病毒血癥，防止病毒在肺部繁殖并引起呼吸系統(tǒng)和繁殖系統(tǒng)損害。但是，弱毒疫苗所引起體液免疫的能力低下，產生中和抗體的水平低下，影響了機體抵御病毒攻擊的能力?；钜呙缑庖吆?，PRRSV抗體約在免疫2周后出現(xiàn)，在免疫后四周時達到高峰，但這些抗體沒有中和活性。通常情況下，PRRSV特異性中和抗體產生大約出現(xiàn)在免疫后四周時，并且其滴度在整個免疫期內都呈現(xiàn)較低的滴度。
[0004]近年來，人們針對活疫苗凍干保護劑進行了大量研究，多為耐熱保護劑，解決了疫苗在運輸使用過程中的耐熱問題，但對于提高活疫苗效果方面幾乎沒有提升。
`[0005]多糖是中藥活性成分之一，大量研究表明，多糖及糖復合物在生物體內不僅是作為能量資源和構成材料，更重要的是它存在于一切細胞膜結構中，參與生命現(xiàn)象中細胞的各種活動。多糖類物質是所有生命有機體的重要組成部分，具有清除自由基、提高抗氧化酶活性和抑制脂質過氧化的能力，同時多糖也具有很好的耐熱效果，多種實驗表明中藥多糖可作為耐熱保護劑添加于活疫苗凍干保護劑中。
[0006]維生素是機體代謝中必不可少的有機化合物。機體猶如一座極為復雜的化工廠，不斷地進行著各種生化反應。其反應與酶的催化作用有密切關系。酶要產生活性，必須有輔酶參加。已知許多維生素是酶的輔酶或者是輔酶的組成分子。因此，維生素是維持和調節(jié)機體正常代謝的重要物質。
[0007]黃酮類化合物是自然界中存在的多元酚類物質，也是自然界藥用植物中的主要活性成分之一。它是指具有15個碳原子并以C6-C3-C6的方式構成的三環(huán)天然有機物，是植物在長期自然選擇中產生的二級代謝產物，現(xiàn)在已分離鑒定的有4000多種。它廣泛存在于果蔬、中草藥中，無毒副作用，它具有顯著的清除機體內自由基、抗老化、抗突變、調血脂降血壓等藥理保健功能，是一類極具開發(fā)前景的天然有機抗氧化劑，這些抗氧化活性物質可以減少和清除機體內自由基，具有預防疾病的作用。
[0008]法氏囊素(bursin,BS)是從禽類特有的體液免疫中樞淋巴器官法氏囊(Bursa offabricius)中分離出來的一種活性三肽物質，其結構為L-Lys-His-Gly-NH2。研究表明，BS能促進禽類和哺乳動物B淋巴細胞前體的分化、增殖，能提高B細胞系Daudi細胞內第二信使cAMP和cGMP水平，加快B細胞內DNA轉錄成mRNA的速度，促進B細胞內蛋白質的生成，從而使B細胞產生和分泌抗體能力加強。
[0009]基于上述【背景技術】，本發(fā)明提出一種豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗用凍干保護劑。該保護劑主要由中藥多糖、中藥黃酮、維生素、法氏囊素等組成。本發(fā)明所制備的凍干保護劑一方面可以提供給活疫苗耐熱保護，另一方面在疫苗使用過程中大大提高了疫苗的使用效果，同時還兼具了提高機體免疫力的功效。

【發(fā)明內容】

[0010]針對現(xiàn)有技術存在的問題，本發(fā)明的目的在于設計提供一種豬繁殖與呼吸綜合征復合活疫苗用凍干保護劑的技術方案，該凍干保護劑能夠大幅度提高了機體的免疫力，提高體液免疫能力，刺激機體產生高效的中和抗體，提高了機體預防疾病的能力。
[0011]所述的一種豬繁殖與呼吸綜合征復合活疫苗用凍干保護劑，其特征在于該凍干保護劑每1000ml磷酸緩沖液中含有中藥多糖30~100g、中藥黃酮20~60g、維生素6~10g、法氏囊素2~16mg、明膠4~6g和鹿糖40~70g,所述的中藥多糖和中藥黃酮從以下中藥組合物中提取得到:生地、懷牛膝、桑白皮、茯苓、蘆根、淫羊藿、生甘草和問荊。
[0012]所述的一種豬繁殖與呼吸綜合征復合活疫苗用凍干保護劑，其特征在于該凍干保護劑每1000ml磷酸緩沖液中含有中藥多糖50~80g、中藥黃酮30~50g、維生素7~9g、法氏囊素4~12mg、明膠5~6g和鹿糖50~60g。
`[0013]所述的一種豬繁殖與呼吸綜合征復合活疫苗用凍干保護劑，其特征在于所述的中藥多糖和中藥黃酮通過以下步驟制得:
a、按生地10~30份、懷牛膝20~40份、桑白皮10~20份，獲茶10~30份、蘆根10~30份，淫羊藿10~30份、生甘草10~20份、問荊10~30份稱取各中藥原料，切碎、洗凈后用冷水浸泡過夜，再加入原料重量15倍的純化水，水浴至90°C，并保持在90°C，熬制2小時,熬制過程中每10分鐘攪拌一次；
b、棄去a中藥渣，收集藥液，室溫冷卻后經1000Orpm離心10分鐘，棄去沉淀，收集上
清；
C、將b中上清進行醇沉，沉淀即為粗制中藥多糖，上清即為粗制中藥黃酮；
d、用滅菌純化水洗滌c中粗制中藥多糖，洗滌后用20倍量的42°C滅菌純化水進行溶解，溶解后，按0.5%比例加入活性炭4°C吸附過夜，吸附后經1000Orpm離心10分鐘，棄去沉淀，收集上清；
e、將d中上清液進行10倍濃縮，制得中藥多糖濃縮液；
f、將e中中藥多糖濃縮液進行真空冷凍干燥制得中藥多糖；
g、將c中粗制中藥黃酮進行減壓真空濃縮，濃縮物用次滅菌注射用水稀釋清洗，再次進行減壓真空濃縮，如此三次后經冷凍真空干燥制成中藥黃酮。
[0014]所述的一種豬繁殖與呼吸綜合征復合活疫苗用凍干保護劑，其特征在于所述的維生素含有維生素BI 15~35%、維生素C 40~70%和維生素E 10~30%。
[0015]所述的一種豬繁殖與呼吸綜合征復合活疫苗用凍干保護劑，其特征在于所述的法氏囊素通過以下步驟制得:取健康法氏囊組織，將法氏囊組織剔除筋膜和脂肪組織，PH7.2滅菌冷PBS洗凈；按1:1比例加入pH 7.2滅菌冷PBS，在組織勻漿機中進行高速勻衆(zhòng)；勻衆(zhòng)液中加入2.5%的胰蛋白酶,反復凍融3次，12000rpm離心20min,棄沉淀；上清用1000da截留分子量的超濾膜進行超濾，膜下液經0.22um濾膜過濾除菌，濾過液即為法氏囊素粗提液；粗提液經冷凍真空干燥制得法氏囊素凍干粉。
[0016]上述的一種豬繁殖與呼吸綜合征復合活疫苗用凍干保護劑，設計合理，與傳統(tǒng)的凍干保護劑相比其具有以下優(yōu)點:
1.本發(fā)明所制備的凍干保護劑，具有耐熱效果，可提高疫苗運輸、儲藏等便利性。
[0017]2.采用本發(fā)明凍干保護劑所制備的疫苗在免疫注射時可以減少豬只疼痛感，降低豬只的應激反應。
[0018]3.采用本發(fā)明凍干保護劑制備疫苗，可以大大提高活疫苗的使用效果，快速的產生中和抗體，減少免疫空檔期，降低豬只發(fā)病幾率，提高機體抵御疾病的能力。
[0019]4.采用本發(fā)明凍干保護劑制備的疫苗免疫機體后，能促進機體B淋巴細胞前體的分化、增殖，加快B細胞內DNA轉錄成mRNA的速度，促進B細胞內蛋白質的生成，從而使B細胞產生和分泌抗體能力加強，從而可提高機體免疫力。
【具體實施方式】`
[0020]為了使本發(fā)明更加容易理解，下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限止本發(fā)明的范圍，下列實施例中未提及的具體實驗方法，通常按常規(guī)實驗方法進行。
[0021]實施例1:中藥多糖和中藥黃酮的制備
a、按生地20份、懷牛膝30份、桑白皮15份、獲茶20份、蘆根20份、淫羊藿20份、生甘草15份、問荊20份稱取各中藥原料，切碎、洗凈后用冷水浸泡過夜，再加入原料重量15倍的純化水，水浴至90°C，并保持在90°C，熬制2小時，熬制過程中每10分鐘攪拌一次；
b、棄去a中藥渣，收集藥液，室溫冷卻后經1000Orpm離心10分鐘，棄去沉淀，收集上
清；
C、將b中上清進行醇沉，沉淀即為粗制中藥多糖，上清即為粗制中藥黃酮；
d、用滅菌純化水洗滌c中粗制中藥多糖，洗滌后用20倍量的42°C滅菌純化水進行溶解，溶解后，按0.5%比例加入活性炭4°C吸附過夜，吸附后經1000Orpm離心10分鐘，棄去沉淀，收集上清；
e、將d中上清經0.22um濾膜過濾除菌后，進行10倍濃縮，制得中藥多糖濃縮液；
f、將e中中藥多糖濃縮液進行真空冷凍干燥即得到中藥多糖；
g、將c中粗制中藥黃酮進行減壓真空濃縮，濃縮物用次滅菌注射用水稀釋清洗，再次進行減壓真空濃縮，如此三次后，再經0.22um濾膜過濾除菌，然后經冷凍真空干燥即得到中藥黃酮。
[0022]該實施例中步驟a中可以稱取生地10份、懷牛膝20份、桑白皮10份，茯苓10份、蘆根10份，淫羊藿10份、生甘草10份、問荊10份進行加工，也可以稱取生地30份、懷牛膝40份、桑白皮20份，茯苓30份、蘆根30份，淫羊藿30份、生甘草20份、問荊30份進行加工。
[0023]實施例2:法氏囊素的制備
a、取健康法氏囊組織，將法氏囊組織剔除筋膜和脂肪組織，PH7.2滅菌冷PBS洗凈。
[0024]b、稱量法氏囊重量，按1:1 (ff:V)比例加入PH7.2滅菌冷PBS，在組織勻漿機中進行高速勻漿。
[0025]C、勻衆(zhòng)液中加入2.5%的胰蛋白酶,反復凍融3次，12000rpm離心20min,棄沉淀。
[0026]d、上清用1000da截留分子量的超濾膜進行超濾，膜下液即為法氏囊素粗提液。
[0027]e、將d中粗提液通過0.22um濾膜過濾除菌，然后經冷凍真空干燥制成法氏囊素凍干粉。
[0028]實施例3: —種豬繁殖與呼吸綜合征復合活疫苗用凍干保護劑的制備
在每1000ml磷酸緩沖液中加入中藥多糖80g、中藥黃酮50g、維生素8g(維生素BI 2g、維生素C 4g和維生素E 2g)、法氏囊素12mg、明膠5g和蔗糖50g，即得到豬繁殖與呼吸綜合征復合活疫苗用凍干保護劑。其中中藥多糖和中藥黃酮按照實施例1中的步驟制得，法氏囊素按照實施例2中的步驟制得。磷酸緩沖液由氯化鈉6~10g，氯化鉀0.05~0.5g，磷酸氫二鈉I~1.2g，磷酸二氫鉀0.05~0.5g，氯化鈣0.05~0.2g，含6個結晶水的氯化鎂0.05~0.2g溶于1000ml雙蒸水中，經116°C，高壓滅菌30分鐘得到。
[0029]實施例4:一種豬繁殖與呼吸綜合征復合活疫苗用凍干保護劑的制備` 在每1000ml磷酸緩沖液中加入中藥多糖30g、中藥黃酮20g、維生素6g (維生素BI0.9g、維生素C 4.2g和維生素E 0.9g)、法氏囊素2mg、明膠4g和蔗糖40g，即得到豬繁殖與呼吸綜合征復合活疫苗用凍干保護劑。其中中藥多糖和中藥黃酮按照實施例1中的步驟制得，法氏囊素按照實施例2中的步驟制得。磷酸緩沖液由氯化鈉6~10g，氯化鉀0.05~0.5g，磷酸氫二鈉I~1.2g，磷酸二氫鉀0.05~0.5g，氯化鈣0.05~0.2g，含6個結晶水的氯化鎂0.05~0.2g溶于1000ml雙蒸水中，經116°C，高壓滅菌30分鐘得到。
[0030]實施例5: —種豬繁殖與呼吸綜合征復合活疫苗用凍干保護劑的制備
在每1000ml磷酸緩沖液中加入中藥多糖100g、中藥黃酮60g、維生素IOg (維生素BI3.5g、維生素C 4g和維生素E 2.5g)、法氏囊素16mg、明膠6g和蔗糖70g，即得到豬繁殖與呼吸綜合征復合活疫苗用凍干保護劑。其中中藥多糖和中藥黃酮按照實施例1中的步驟制得，法氏囊素按照實施例2中的步驟制得。磷酸緩沖液由氯化鈉6~10g，氯化鉀0.05~0.5g，磷酸氫二鈉I~1.2g，磷酸二氫鉀0.05~0.5g，氯化鈣0.05~0.2g，含6個結晶水的氯化鎂0.05~0.2g溶于1000ml雙蒸水中，經116°C，高壓滅菌30分鐘得到。
[0031 ] 實施例6:凍干保護劑的使用方法
1.豬繁殖與呼吸綜合征病毒懸液制備 (O生產用毒種制備
將已長成單層的Marc-145細胞,棄去生長液,按生長液1%量接種病毒，37°C吸附I小時，加入細胞維持液，置37°C繼續(xù)培養(yǎng)，40小時后開始觀察，當細胞病變達到80%時，收獲細胞培養(yǎng)物，置_20°C保存。
[0032](2)制苗材料的選擇:選擇生長良好的Marc-145單層細胞。
[0033](3)制苗用細胞毒液的繁殖將已長成良好單層的Marc-145細胞，棄去生長液，用pH值7.2-7.6的MEM維持液將生產用毒種稀釋3-4倍，按生長液量的1%接種稀釋后的病毒，37°C吸附I小時，加細胞維持液，置37°C繼續(xù)旋轉培養(yǎng)。接毒后，每天觀察細胞病變情況，病變細胞達80%時，即可收獲細胞培養(yǎng)物，反復凍融3次，置-20°C以下凍結保存。
[0034]2.疫苗制備
將無菌檢驗和病毒含量檢測合格的細胞毒液，混合于同一滅菌容器內，按1:1 (v:v)t匕例加入實施例3、4或5中制備的凍干保護劑，充分混勻后定量分裝，冷凍真空干燥制成豬繁殖與呼吸綜合征凍干活疫苗(實驗)，每頭份病毒含量應> IO6 0TCID500
[0035]同時將將無菌檢驗和病毒含量檢測合格的細胞毒液，混合于同一滅菌容器內，按1:1 (V:V)比例加入蔗糖牛奶保護劑，充分混勻后定量分裝，經冷凍真空干燥制成豬繁殖與呼吸綜合征凍干活疫苗(對照)，每頭份病毒含量應≥IO6 0TCID500
[0036]3.疫苗檢驗
(1)隨保存時間，各項指標檢驗結果
將上述制備的兩批疫苗放置常溫(25°C)進行保存，病每隔一個月進行病毒含量檢測，檢測結果見表1:
表1保存期檢測結果(25 °C)
【權利要求】
1.一種豬繁殖與呼吸綜合征復合活疫苗用凍干保護劑，其特征在于該凍干保護劑每1000ml磷酸緩沖液中含有中藥多糖30~100g、中藥黃酮20~60g、維生素6~10g、法氏囊素2~16mg、明膠4~6g和鹿糖40~70g,所述的中藥多糖和中藥黃酮從以下中藥組合物中提取得到:生地、懷牛膝、桑白皮、茯苓、蘆根、淫羊藿、生甘草和問荊。
2.如權利要求1所述的一種豬繁殖與呼吸綜合征復合活疫苗用凍干保護劑，其特征在于該凍干保護劑每1000ml磷酸緩沖液中含有中藥多糖50~80g、中藥黃酮30~50g、維生素7~9g、法氏囊素4~12mg、明膠5~6g和鹿糖50~60g。
3.如權利要求1所述的一種豬繁殖與呼吸綜合征復合活疫苗用凍干保護劑，其特征在于所述的中藥多糖和中藥黃酮通過以下步驟制得: a、按生地10~30份、懷牛膝20~40份、桑白皮10~20份，獲茶10~30份、蘆根10~30份、淫羊藿10~30份、生甘草10~20份、問荊10~30份稱取各中藥原料，切碎、洗凈后用冷水浸泡過夜，再加入原料重量15倍的純化水，水浴至90°C，并保持在90°C，熬制2小時,熬制過程中每10分鐘攪拌一次； b、棄去a中藥渣，收集藥液，室溫冷卻后經1000Orpm離心10分鐘，棄去沉淀，收集上清； C、將b中上清進行醇沉，沉淀即為粗制中藥多糖，上清即為粗制中藥黃酮； d、用滅菌純化水洗滌c中粗制中藥多糖，洗滌后用20倍量的42°C滅菌純化水進行溶解，溶解后，按0.5%比例加入活性炭4°C`吸附過夜，吸附后經1000Orpm離心10分鐘，棄去沉淀，收集上清； e、將d中上清經0.22um濾膜過濾除菌后，進行10倍濃縮，制得中藥多糖濃縮液； f、將e中中藥多糖濃縮液進行真空冷凍干燥即得到中藥多糖； g、將c中粗制中藥黃酮進行減壓真空濃縮，濃縮物用次滅菌注射用水稀釋清洗，再次進行減壓真空濃縮，如此三次后，再經0.22um濾膜過濾除菌，然后經冷凍真空干燥即得到中藥黃酮。
4.如權利要求1所述的一種豬繁殖與呼吸綜合征復合活疫苗用凍干保護劑，其特征在于所述的維生素含有維生素BI 15~35%、維生素C 40~70%和維生素E 10~30%。
5.如權利要求1所述的一種豬繁殖與呼吸綜合征復合活疫苗用凍干保護劑，其特征在于所述的法氏囊素通過以下步驟制得:取健康法氏囊組織，將法氏囊組織剔除筋膜和脂肪組織，pH7.2滅菌冷PBS洗凈；按1:1比例加入pH 7.2滅菌冷PBS，在組織勻漿機中進行高速勻衆(zhòng)；勻衆(zhòng)液中加入2.5%的胰蛋白酶,反復凍融3次，12000rpm離心20min,棄沉淀；上清用1000da截留分子量的超濾膜進行超濾，膜下液經0.22um濾膜過濾除菌，濾過液即為法氏囊素粗提液；粗提液經冷凍真空干燥制得法氏囊素凍干粉。
【文檔編號】A61P37/04GK103495180SQ201310426405
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年9月18日 優(yōu)先權日:2013年9月18日
【發(fā)明者】李陽, 閆艷麗, 劉雪, 王二先, 徐曉艷, 盛璐絲 申請人:浙江美保龍生物技術有限公司