用于豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒培養(yǎng)的細胞株及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒（PRRSV）培養(yǎng)的細胞株及其應用。該細胞株對PRRSV高度敏感且穩(wěn)定，并能持續(xù)穩(wěn)定增殖高滴度PRRSV。該細胞株無支原體、細菌、真菌、外源病毒的污染，并且不存在三致的危險，安全性高。將該細胞株用于PRRSV的增殖培養(yǎng)，其較之Marc145母細胞更有利于PRRSV的復制與增殖。因此，采用該細胞株進行高滴度PRRSV的增殖培養(yǎng)有利于獲得有關PRRSV研究與疫病防治方面的更全面信息，進行更加直接有效的研究。對PRRSV高敏感的猴腎細胞系Marc145-1株及高滴度PRRSV的增殖方法在PRRSV研究與疫病防治過程中具有廣闊的開發(fā)和應用前景。
【專利說明】用于豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒培養(yǎng)的細胞株及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于畜牧類生物制藥【技術領域】，涉及一種用于豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒培養(yǎng)的細胞株，以及該細胞株在豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒培養(yǎng)中的應用。
【背景技術】
[0002]豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征是由豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒(Porcinreproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起的一種豬的高度傳染性疾病，又稱豬藍耳病。本病以妊娠母豬的繁殖障礙(流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎)及各種年齡豬特別是仔豬的呼吸道癥狀為特征。該病自1987年在美國被發(fā)現(xiàn)以來，曾經(jīng)迅速傳遍世界各個養(yǎng)豬國家，在豬群密集、流動頻繁的地區(qū)更易流行，造成了嚴重的經(jīng)濟損失。近幾年，該病在我國呈現(xiàn)明顯的高發(fā)趨勢，能引起不同品種、不同日齡、不同飼養(yǎng)管理模式的保育豬、仔豬和懷孕豬高發(fā)病率、高死亡率，給我國的養(yǎng)豬業(yè)造成了不可估量的損失。
[0003]PRRSV病毒的穩(wěn)定性受PH和溫度的影響較大，在PH小于5或大于7的條件下，其感染力降低95%以上；在PH7.5的培養(yǎng)液中可于_20°C和_80°C長期保存，在4°C則緩慢失去感染力；對有機溶劑敏感，對常用的化學消毒劑抵抗力不強。
[0004]PRRSV病毒能在多種細胞上生長，但Marcl45是目前各實驗室培養(yǎng)PRRSV最常用的細胞。用Marcl45細胞接種豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒，細胞病變以聚集為特征，由于細胞病變死亡，病毒無法繼續(xù)繁殖，經(jīng)過反復凍融收獲病毒液，病毒液只能收獲一次，收獲量小，病毒滴度低，強毒病毒含量在106_°~107_°TCID5(l/ml,弱毒毒株病毒含量在108_°~108 5TCID5Q/ml?？梢姡F(xiàn)有的Marcl45細胞雖然適合PRRSV的增殖，但是病毒滴度比較低，病毒含量不能滿足疫苗和診斷抗原的制備。
[0005]因此，目前存在的問題是為了獲得關于疫苗、診斷試劑盒等治療手段的更全面信息，進行更加直接有效的研究，需要克隆出一株對PRRSV高度敏感且穩(wěn)定，并能持續(xù)穩(wěn)定增殖高滴度PRRSV的Marc 145細胞株。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術問題是針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種用于PRRSV培養(yǎng)的細胞株，該細胞株對PRRSV高度敏感且穩(wěn)定，并能持續(xù)穩(wěn)定增殖高滴度PRRSV。該細胞株無支原體、細菌、真菌、外源病毒的污染，并且不存在三致的危險，安全性高。
[0007]本發(fā)明還進一步提供了一種上述細胞株在豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒培養(yǎng)中的應用。該細胞株較之Marcl45母細胞更有利于PRRSV的復制與增殖，采用該細胞株進行高滴度PRRSV的增殖培養(yǎng)有利于獲得有關PRRSV研究與疫病防治方面的更全面信息，進行更加直接有效的研究。
[0008]為此，本發(fā)明提供了一種用于PRRSV培養(yǎng)的細胞株，其中，所述細胞株為猴腎細胞系 Marc 145-1 株(Monke y kidney cell line strain Marcl45_l),其保藏編號為:CCTCCN0:C2012185，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2012年12月10日。上述培養(yǎng)為增殖培養(yǎng)。
[0009]本發(fā)明中，所用術語“猴腎細胞系Marcl45_l株”是指從猴腎細胞系Marcl45母細胞克隆獲得的新細胞株，也稱為Marcl45-1細胞，簡稱Marcl45_l。
[0010]本發(fā)明中，所述猴腎細胞系Marcl45-1株具有以下特征:
[0011](1)從形態(tài)上觀察，猴腎細胞系Marc 145-1株比Marc 145母細胞形態(tài)規(guī)則，細胞之間界限明顯，整齊，細胞折光性強，胞質(zhì)飽滿，核質(zhì)清晰。細胞易于傳代和瓶壁分離。細胞變小，密度增大。
[0012](2)對PRRSV具有高敏感性；
[0013](3)病毒增殖過程中細胞的病變特征表現(xiàn)為細胞崩解，收獲的病毒液為Marcl45母細胞的4倍，病毒滴度提高f 2個滴度，并且這種敏感性可以穩(wěn)定遺傳；
[0014](4)細胞生長速度變快，倍增時間提前了 Id (天)。
[0015]在本發(fā)明的一個【具體實施方式】中，所述猴腎細胞系Marcl45-1株通過以下方法構建完成，其包括:
[0016]步驟一，Marc 145細胞有限稀釋法克隆培養(yǎng)
[0017]將實驗室保存的無支原體、細菌、真菌、外源病毒污染的Marcl45細胞(哈爾濱獸醫(yī)研究所)經(jīng)胰蛋白酶消化制成單細胞懸液，細胞計數(shù)后進行連續(xù)梯度稀釋，然后分別接種于96孔細胞培養(yǎng)板，37°C 5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)l(Tl4d，挑選有單個細胞生長的細胞孔中的細胞轉入24孔板培養(yǎng)，并依次將細胞擴大培養(yǎng)到12孔板、6孔板、T25細胞培養(yǎng)瓶，獲得亞克隆細胞株；
[0018]步驟二，對豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒敏感的Marcl45細胞株的篩選。
[0019]挑選細胞狀態(tài)比較好的幾株克隆細胞分別接種于96孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，待細胞長滿單層接種豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒，于37°C 5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h，觀察細胞病變，并以未接毒的細胞作為陰性對照，挑選病變最明顯的Marcl45細胞株進行傳代，獲得Marcl45-1株，即，猴腎細胞系Marcl45_l株，并用液氮保存。
[0020]本發(fā)明還提供了一種根據(jù)本發(fā)明所述的細胞株在豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒培養(yǎng)中的應用，其包括:
[0021]步驟B，將豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒接種于猴腎細胞系Marcl45-1株進行培養(yǎng);
[0022]步驟C，收獲病毒液。
[0023]根據(jù)本發(fā)明，在步驟B中，所述的培養(yǎng)為增殖培養(yǎng)。
[0024]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，在步驟B之前還包括步驟A，培養(yǎng)猴腎細胞系Marcl45-1株。在步驟A中，所述的培養(yǎng)為增殖培養(yǎng)。
[0025]在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施例中，在步驟C之后還包括步驟D，對步驟C中收獲的病毒液進行毒價測定。
[0026]根據(jù)本發(fā)明，所述豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒包括豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒強毒株NVDC-JXAl株、豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒弱毒株NVDC-JXAl-R株、豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒弱毒株ATCCVR-2332株、豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒弱毒株CH-1R株以及豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒弱毒株HBR株。
[0027]優(yōu)選地，所述豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒包括豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒強毒株NVDC-JXAl株、豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒弱毒株NVDC-JXAl-R株及豬繁殖以及呼吸系統(tǒng)綜合征病毒CH-1R株。
[0028]在本發(fā)明的一個具體實施例中，采用猴腎細胞系Marcl45_l株對豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒NVDC-JXAl株的增殖培養(yǎng)。將猴腎細胞系Marcl45-1株接種于細胞培養(yǎng)瓶，加入含8%胎牛血清的DMEM細胞生長液，于37°C 5%C02條件下48h可以長成單層，0.001M0I接種豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒NVDC-JXAl株，加入含2%胎牛血清的DMEM維持液，于37°C培養(yǎng)36~48h有80%的細胞出現(xiàn)細胞病變，以細胞崩解為主要特征，分別收獲上清液和細胞中的病毒，豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒NVDC-JXAl株的滴度均可以達到IO8 tlTCID5ci/ml ο
[0029]在本發(fā)明的一個具體實施例中，采用猴腎細胞系Marcl45_l株對豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒NVDC-JXAl-R株的增殖培養(yǎng)，收獲的豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒NVDC-JXA1-R株病毒液的滴度均可以達到109_ 5TCID5ciAil。
[0030]在本發(fā)明的一個具體實施例中，采用猴腎細胞系Marcl45_l株對豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒CH-1R株的增殖培養(yǎng)，收獲的豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒CH-1R株病毒液的滴度均可以達到109_ 5TCID5tZml。
[0031]根據(jù)本發(fā)明的猴腎細胞系Marcl45-1株形態(tài)均一，生長性能好，生長曲線呈“S”型，細胞形態(tài)和生長速度穩(wěn)定，可連續(xù)傳代，在連續(xù)傳代過程中，每隔5代對其進行純凈性、病毒敏感性檢測，每隔10代對其進行“致畸、致瘤、致病變”試驗，結果表明，該細胞株無支原體、細菌、真菌、外源病毒的污染，并且不存在三致的危險，安全性高。 [0032]該猴腎細胞系Marcl45_l株在接種PRRSV后，病變特征發(fā)生了一些變化，表現(xiàn)為細胞崩解，且收獲的病毒液為Marcl45母細胞的4倍,病毒滴度測定表明，猴腎細胞系Marcl45-1株較之Marcl45母細胞更有利于PRRSV的復制與增殖，PRRSV病毒含量提高了1-2個滴度，并且這種敏感性可以穩(wěn)定遺傳，在傳代至50代內(nèi)沒有丟失，仍能保持這種對病毒的高敏感性。經(jīng)檢測，猴腎細胞系Marcl45-1株沒有細菌、真菌、支原體以及常見的幾種交叉感染病毒等外源污染。因此，采用該細胞株進行高滴度PRRSV的增殖培養(yǎng)有利于獲得有關PRRSV研究與疫病防治方面的更全面信息，進行更加直接有效的研究。對PRRSV高敏感的猴腎細胞系Marcl45-1株及高滴度PRRSV的增殖方法在PRRSV研究與疫病防治過程中具有廣闊的開發(fā)和應用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0033]圖1為實施例2中Marcl45母細胞和Marcl45_l細胞生長曲線比對結果。
[0034]圖1中的坐標軸含義如下:縱坐標活細胞總數(shù)(個/孔)；橫坐標為時間(d)。
[0035]mmm
[0036]猴腎細胞系Marcl45_l 株(Monkey kidney cell line strain Marc 145-1),由普萊柯生物工程股份有限公司篩選獲得，已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱=CCTCC ;地址:湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山路16號武漢大學)進行保藏，保藏日期:2012年12月10日，保藏編號:CCTCC N0:C2012185o
【具體實施方式】[0037]為使本發(fā)明更加容易理解，下面將結合實施例來詳細說明本發(fā)明，這些實施例僅起說明性作用，并不局限于本發(fā)明的應用范圍，下列實施例中未提及的具體實驗方法，通常按照常規(guī)實驗方法進行。
[0038]實施例
[0039]實施例1:Marcl45細胞系的克隆和篩選
[0040]1.Marc 145細胞有限稀釋法克隆培養(yǎng)
[0041]將實驗室保存的無支原體、細菌、真菌、外源病毒污染的Marcl45細胞(哈爾濱獸醫(yī)研究所)經(jīng)胰蛋白酶消化制成單細胞懸液，細胞計數(shù)后進行連續(xù)梯度稀釋，然后分別接種于96孔細胞培養(yǎng)板，370C 5%的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)l(Tl4d，挑選有單個細胞生長的細胞孔中的細胞轉入24孔板培養(yǎng)，并依次將細胞擴大培養(yǎng)到12孔板、6孔板、T25細胞培養(yǎng)瓶，獲得亞克隆細胞株；
[0042]2.對豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒敏感的Marcl45細胞株的篩選
[0043]挑選細胞狀態(tài)比較好的幾株克隆細胞分別接種于96孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，待細胞長滿單層接種NVDC-JXAl病毒(0.001M0I)，37°C吸附lh，接毒后48h觀察細胞病變，并以未接毒的細胞作為陰性對照，挑選病變最明顯的Marcl45細胞克隆株進行傳代，獲得Marcl45克隆細胞，亦即猴腎細胞系Marcl45-1株，并用液氮保存。
[0044]實施例2:猴腎細胞系Marcl45_l株的生物學性狀研究 [0045]1.細胞形態(tài)學
[0046]分別接長成單層的Marcl45母細胞和猴腎細胞系Marcl45_l株制備成細胞懸液，經(jīng)細胞計數(shù)后，按照8 X IO4個/cm2接種于T25細胞培養(yǎng)瓶，加入含8%~?Ο%胎牛血清的DMEM生長液，于37°C 5%C02條件下培養(yǎng)48h，觀察兩者的細胞形態(tài)。細胞貼壁良好、形態(tài)飽滿、界限清晰，表面光滑。猴腎細胞系Marcl45-1株較Marcl45母細胞變小，密度增大，細胞之間的界限更明顯、整齊，細胞折光性強，胞質(zhì)飽滿，核質(zhì)清晰。
[0047]2.細胞動力學檢測
[0048]將長滿單層的Marcl45母細胞和猴腎細胞系Marcl45_l株制備成細胞懸液，經(jīng)細胞計數(shù)后，按照8 X IO4個/cm2接種于24孔細胞培養(yǎng)板，加入含8%~10%胎牛血清的DMEM生長液，于37°C 5%C02條件下培養(yǎng)。24h后取3瓶細胞，制成細胞懸液，分別進行計數(shù)，三次測定結果取平均值。以后每隔24h取3瓶細胞計數(shù)一次，連續(xù)計數(shù)7d。
[0049]根據(jù)細胞計數(shù)結果(見表1)，以活細胞總數(shù)(個/孔)為縱坐標，以時間為橫坐標繪制生長曲線(見圖1)。
[0050]用下列公式計算細胞的比生長速率(μ )和分裂指數(shù)(Cd)。
「 nInXn-1nX11-1
[0051]μ =-

tn - tn -1
[0052]其中，X代表每毫升活細胞數(shù)目；t代表采樣的時間點；n代表采樣點。
[0053]

細胞培養(yǎng)最后的密度
—°82 細胞接種的密度
[0054]表1細胞動力學檢測對比結果
[0055]
【權利要求】
1.一種用于豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒培養(yǎng)的細胞株，其中，所述細胞株為猴腎細胞系 Marcl45_l 株(Monkey kidney cell line strain Marcl45_l),其保藏編號為:CCTCCN0:C2012185，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心。
2.根據(jù)權利要求1所述的細胞株，其特征在于:所述培養(yǎng)為增殖培養(yǎng)。
3.一種根據(jù)權利要求1或2所述的細胞株在豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒培養(yǎng)中的應用，其包括: 步驟B，將豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒接種到猴腎細胞系Marcl45-1株進行培養(yǎng)； 步驟C,收獲病毒液。
4.根據(jù)權利要求3所述的應用，其特征在于:在步驟B中，所述的培養(yǎng)為增殖培養(yǎng)。
5.根據(jù)權利要求3所述的應用，其特征在于:在步驟B之前還包括步驟A，培養(yǎng)猴腎細胞系 Marcl45_l 株。
6.根據(jù)權利要求 5所述的應用，其特征在于:在步驟A中，所述的培養(yǎng)為增殖培養(yǎng)。
7.根據(jù)權利要求3所述的應用，其特征在于:在步驟C之后還包括步驟D，對步驟C中收獲的病毒液進行毒價測定。
8.根據(jù)權利要求3~7中任意一項所述的應用，其特征在于:所述豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒包括豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒強毒株NVDC-JXAl株、豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒弱毒株NVDC-JXAl-R株、豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒弱毒株ATCCVR-2332株、豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒弱毒株CH-1R株以及豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒弱毒株HBR株。
9.根據(jù)權利要求8所述的應用，其特征在于:所述豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒包括豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒強毒株NVDC-JXAl株、豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒弱毒株NVDC-JXA1-R株及豬繁殖以及呼吸系統(tǒng)綜合征病毒CH-1R株。
【文檔編號】C12R1/93GK103966157SQ201310046123
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2013年2月5日 優(yōu)先權日:2013年2月5日
【發(fā)明者】張許科, 孫進忠, 白朝勇 申請人:普萊柯生物工程股份有限公司