專(zhuān)利名稱(chēng)：檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒的活毒抗體試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒的活毒抗體試劑盒，特別是涉及一種能夠區(qū)分活毒感染和滅活毒免疫豬群的液相阻斷ELISA制備方法，屬于一種新的動(dòng)物疫病診斷試劑，應(yīng)用于畜牧獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明具有深遠(yuǎn)的研究性和廣泛的應(yīng)用性，包括對(duì)地區(qū)內(nèi)豬繁殖與呼吸綜合征病毒流行病學(xué)調(diào)查，以及凈化豬場(chǎng)和區(qū)分野毒感染和滅活毒免疫的豬群。
背景技術(shù)：
ItMMi^Bf ^^-π Π: (Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS) 由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus. PRRSV)感染引起，主要特征為懷孕母豬發(fā)生流產(chǎn)、早產(chǎn)和死胎等嚴(yán)重的繁殖障礙以及仔豬與育肥豬的呼吸道疾病。PRRS是上世紀(jì)80年代后期暴發(fā)的一種新的傳染性疾病，于1987 年首發(fā)于北美地區(qū)，在隨后的幾年內(nèi)，便迅速地在歐、美大陸的許多國(guó)家流行，隨后又蔓延至亞洲的一些國(guó)家，成世界范圍內(nèi)的大流行，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。我國(guó)自 1995年底暴發(fā)此病，并迅速傳播至全國(guó)各地，成為我國(guó)規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)引發(fā)繁殖障礙的主要疫病之一。近年來(lái)PRRS呈持續(xù)性感染，并導(dǎo)致繼發(fā)性感染增加，嚴(yán)重威脅了養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。PRRS傳播非常迅速，豬群一旦感染即呈持續(xù)性，污染豬場(chǎng)可成為疫源地。雖然 PRRSV流行毒株有美洲型和歐洲型，但至今為止，我國(guó)分離到的PRRSV流行毒株均為美洲型。由于PRRS與其它許多引起豬繁殖障礙綜合征的疾病(如豬細(xì)小病毒病、豬偽狂犬病、 豬瘟等)的臨床癥狀相似，不具有特征性，加上RRRSV感染豬群易引起繼發(fā)感染，發(fā)生細(xì)菌性或病毒性繼發(fā)感染，更使得臨床表現(xiàn)和病理變化復(fù)雜化，豬只個(gè)體之間的臨床表現(xiàn)差異很大，而且近年來(lái)越來(lái)越多的PRRS是亞臨床型和慢性型病例。僅根據(jù)臨床癥狀和病變及流行病學(xué)特點(diǎn)很難做出診斷，因此PRRS的確診需要借助實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)，特別是新發(fā)生本病的地區(qū)和豬場(chǎng)。目前國(guó)內(nèi)外建立了一系列PRRS診斷方法。其中用于PRRSV檢測(cè)方法主要有病毒分離、免疫過(guò)氧化物酶單層試驗(yàn)(IPMA)、血清中和試驗(yàn)(SN)、間接熒光抗體試驗(yàn)(IFA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、乳膠凝集試驗(yàn)(LAT)、膠體金技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)、反轉(zhuǎn)錄.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT—PCR)、套式RT-PCR、實(shí)時(shí)RT-PCR和核酸探針原位雜交技術(shù)(ISH)。上述檢測(cè)PRRSV抗體的技術(shù)人多針對(duì)結(jié)構(gòu)蛋白，而有關(guān)PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白抗體的檢測(cè)方法還未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒的活毒抗體試劑盒，其利用固相酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)原理，以I3RRSV非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp9為診斷抗原，結(jié)合單抗和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG及其他配套試劑組成。其反應(yīng)機(jī)理為包被抗原和樣品中抗PRRSV Nsp9抗體結(jié)合導(dǎo)致單抗和抗原的結(jié)合量減少，通過(guò)酶標(biāo)抗體形成“包被抗原+結(jié)合單抗+酶標(biāo)抗體”復(fù)合物，加入顯色劑，通過(guò)酶催化反應(yīng)顯色。顯色深淺與樣品中的檢測(cè)抗體含量成反比，當(dāng)顯色(OD49tl)超過(guò)設(shè)定的臨界值時(shí)結(jié)果判為陽(yáng)性，表明有活毒存在。 判定結(jié)果是這樣設(shè)定的抑制率PI= (0D未抑制-OD樣品)/OD未抑制*100%，PI>30%對(duì)應(yīng)的樣品為陽(yáng)性，小于則為陰性。具有簡(jiǎn)單、快速、敏感和特異性好等特點(diǎn)；適用于區(qū)分臨床區(qū)分豬繁殖與呼吸綜合征病毒活毒和滅活毒抗體。 本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒的活毒抗體試劑盒，其特征在于將96孔ELISA板、樣品稀釋液、20倍濃縮洗滌液、羊抗小鼠IgG-HRP結(jié)合物、結(jié)合單抗、終止液、底物A、底物B、陽(yáng)性樣品、陰性樣品、蓋板膜(11)分別用的廣口瓶加以封裝，貼上標(biāo)簽，組裝成試劑盒，具體組裝方法按以下步驟完成
第一步首先對(duì)96孔ELISA板進(jìn)行包被96空ELISA板上包被有PRRSV Nsp9蛋白，用包被緩沖液將Nsp9蛋白稀釋到1. 5ug/mL，每孔IOOul包被ELISA板，37°C包被Ih后用含 5%脫脂奶粉的PBS 37°C封閉lh，然后用PBS洗滌5次干燥后用鋁箔真空密封備用；
第二步配制樣品稀釋液(PBST PH7. 4) :NaCl 8. Og ；KH2PO4 0. 2g ；Na2HPO4 · Iffl2O 2. 9g ；KCl 0. 2g 補(bǔ)加二餾水致 IOOOml ；加入 0. 5ml Tween-20，最后 50ml 分裝；
第三步配制 20 倍濃縮洗滌液=NaCl 160. Og ；KH2PO4 4g ；Na2HPO4 · 12H20 58g ；KCl 4g 補(bǔ)加二餾水致IOOOml ；加入IOml Tween-20，最后50ml分裝；
第四步將購(gòu)買(mǎi)的羊抗小鼠IgG-HRP結(jié)合物用IOml PBST加入2ul羊抗小鼠IgG-HRP 二抗進(jìn)行稀釋?zhuān)缓蠹尤?%PEG，以25ml分裝； 第五步結(jié)合單抗的制備
首先根據(jù)豬繁殖與呼吸綜合征病毒BJ-4株及變異毒株(HB-l、SY0608、HN-HW、HuN4等) 的核苷酸序列，利用I^rimer軟件設(shè)計(jì)合成針對(duì)PRRSV Nsp9基因保守區(qū)域的特異性引物。用 RT-PCR方法擴(kuò)增出豬繁殖與呼吸綜合征病毒JL/07/SW株Nsp9基因片段，克隆到pMD18_ T載體并測(cè)序，基因克隆至表達(dá)載體pET-28a (+)，得到重組表達(dá)載體pET-28a-Nsp9，用經(jīng)鑒定的陽(yáng)性重組質(zhì)粒pET-28a-Nsp9轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂板挑菌(KanlOO mg/ mL)，陽(yáng)性菌在涂加卡那霉素(100 mg/mL)LB液體培養(yǎng)基(Kan 100 mg/mL)中振搖培養(yǎng)過(guò)夜后，按1%轉(zhuǎn)接種于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基(KanlOO mg/mL)，37°C振搖培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 (0D600nm=0. 6)，加入IPTG (終濃度lmmol/L)，37 °C誘導(dǎo)培養(yǎng)3 h。離心沉淀菌體，超聲破碎后經(jīng)電洗脫得到高純度的重組Nsp9蛋白，于-80°C保存?zhèn)溆茫?然后用重組Nsp9蛋白制備單克隆抗體，具體方法如下
1、動(dòng)物免疫選擇6-8周齡健康Balb/C小鼠以弗氏完全佐劑乳化純化的PRRSVNsp9蛋白，每只小鼠腹腔注射100μ g，14d后以弗氏不完全佐劑乳化蛋白腹腔注射100μ g，最后一次加強(qiáng)免疫時(shí)，直接腹腔注射100 μ g純化的蛋白，融合前3 4d尾靜脈注射50 μ g純化的蛋白；
2、細(xì)胞融合取免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0混合于融合管內(nèi)，以300g離心10min,棄去上清，振蕩細(xì)胞，使兩種細(xì)胞盡量混合均勻，然后60s內(nèi)緩慢滴加預(yù)熱的PEG-4000溶液，再緩慢加入無(wú)血清的1640培養(yǎng)基終止融合，靜置后再以1 000 r/min離心10 min， 棄去上清后加入HAT培養(yǎng)基，使細(xì)胞懸浮并混勻，于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，第14d開(kāi)始換液并開(kāi)始檢測(cè)篩選；
3、雜交瘤細(xì)胞的篩選和克隆化克隆的篩選采用間接ELISA，用純化的PRRSVNsp9蛋白作為包被抗原。對(duì)所獲陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清進(jìn)行篩選；將ELISA篩選的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化，將檢出的陽(yáng)性孔再次克隆和亞克隆，直到所有的孔都為陽(yáng)性。通過(guò)三次細(xì)胞克隆最終獲得雜交瘤細(xì)胞株2D6 ；
4、腹水的制備0.5mL的高壓滅菌的石蠟油注射到小鼠腹腔，7d后注入106個(gè)雜交瘤細(xì)胞于小鼠腹腔，一周后抽取腹水，將收集好的腹水置37°C 24h，隨后置4°C過(guò)夜，第二天將腹水離心，上清56°C滅活30 min即可；
5、單克隆抗體的純化用4倍體積醋酸緩沖液稀釋腹水，調(diào)至pH4.5，緩慢滴加3.3 % 的正辛酸，攪拌30 min，離心取上清，加入1/10體積的10倍PBS，調(diào)至pH7. 4，4°C預(yù)冷后，用45 %飽和硫酸銨沉淀，離心后取沉淀，用PBS稀釋后移入透析袋，在50倍體積 PBS中透析，透析期間多次換液，透析結(jié)束后，紫外分光光度計(jì)觀0 nm測(cè)定蛋白濃度并分裝凍存；
6抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒Nsp9蛋白單克隆抗體的特性鑒定
(1)、腹水效價(jià)測(cè)定間接ELISA方法測(cè)定，細(xì)胞培養(yǎng)上清與腹水分別從10倍和100倍開(kāi)始做梯度稀釋?zhuān)瑫r(shí)分別以SP2/0細(xì)胞培養(yǎng)上清和腹水做同等稀釋度作為對(duì)照。通過(guò)檢測(cè)得知2D6單抗的腹水效價(jià)為6. 4 X IO5 ；
(2)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒Nsp9蛋白單克隆抗體IgG亞類(lèi)鑒定按小鼠mAbIgG亞類(lèi)檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。具體方法是將純化的每株單克隆抗體1000倍稀釋后包被酶標(biāo)板，每孔100 μ L，37°C孵育1 h，洗滌后每孔加入1 000倍稀釋的抗體亞類(lèi)試劑100 μ L ，37°C孵育1 h，洗滌3遍。然后加入羊抗小鼠IgG酶標(biāo)二抗，37°C孵育1 h，洗滌后加入底物顯色，確定單克隆抗體的亞類(lèi)為IgG2a ；
(3)、雜交瘤細(xì)胞株染色體的分析采用秋水仙素法對(duì)雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行染色體分析，結(jié)果顯示2D6雜交瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目為101條；
(4)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒單克隆抗體特異性鑒定將所獲單克隆抗體分別與豬偽狂犬病毒、豬流感病毒、豬細(xì)小病毒進(jìn)行間接ELISA，檢測(cè)所得知制備的單克隆抗體與其它豬病毒病均無(wú)交叉反應(yīng)性；
將以上純化單抗2D6以80000倍稀釋于PBS中加入4%PEG，25ml分裝；
第六步配制終止液2mol/L H2S04濃硫酸44. 5ml，雙蒸水；355. 5ml, IOml分裝；
第七步配制底物A :TMB 200mg，無(wú)水乙醇100ml，加雙蒸水至1000ml，IOml分裝；
第八步配制底物B (0. lml/L檸檬酸-0. 2ml/L磷酸氫二納，ρΗ5· 0-5. 4) :Na2HP04 14. 60g,檸檬酸 9. 33g，0. 75% 過(guò)氧化氫 6. 4ml，加三蒸水至 1000ml，調(diào)至 ρΗ5· 0-5. 43，IOml 分裝；
第九步配制陽(yáng)性樣品將標(biāo)準(zhǔn)PRRSV陽(yáng)性血清1:5稀釋于樣品稀釋液中，Iml分裝；
第十步配制陰性樣品將經(jīng)檢測(cè)PRRSV陰性血清1:5稀釋于樣品稀釋液中，Iml分裝。
所述采用試劑盒進(jìn)行的檢測(cè)方法如下將待檢血清用樣品稀釋液2倍稀釋后 IOOul加入ELISA板中37°C孵育lh，設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照。用洗滌液清洗5 次，每次aiiin ；然后加入結(jié)合單抗每孔100ul，37°C孵育lh，洗滌液清洗5次，每次^iin ；然后加入羊抗小鼠IgG-HRP結(jié)合物37°C作用lh，洗滌液清洗5次，每次aiiin ；然后加入顯色底物溶液，將底物A和底物B以1 1混合，IOOul加入ELISA孔中，避光顯色15min,加入50ul 終止液，測(cè)其0D490值；判定結(jié)果是這樣設(shè)定的抑制率PI= (0D未抑制-OD樣品)/OD未抑制*100%，PI>30%對(duì)應(yīng)的樣品為陽(yáng)性，小于則為陰性。本發(fā)明的積極效果是
1、具有生物安全性，其所使用的原核表達(dá)的PRRSV Nsp9蛋白為抗原、捕獲單抗2D6為小鼠誘生獲得，不含豬繁殖與呼吸綜合征病毒，因此不存在散毒的危險(xiǎn)。2、特異性強(qiáng)，檢測(cè)抗體2D6為敏感性和特異性較好的單克隆抗體，因此提高了試劑盒的敏感性和特異性。3、生產(chǎn)成本低，捕獲單抗可由相應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞系通過(guò)注射Balb/c小鼠腹腔，誘生腹水，通過(guò)辛酸-硫酸銨純化而大量獲得。4、能夠良好區(qū)分豬繁殖與呼吸綜合征病毒活毒和滅活毒抗體，可應(yīng)用于豬場(chǎng)的凈化，和流行病學(xué)調(diào)查。


圖1為本發(fā)明的pETj8a-Nsp9經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)蛋白，其中1.空BL-21 2.空載體3. pET-28a-Nsp9 4.純化蛋白M.低分子量蛋白Marker。圖2為本發(fā)明腹水SDS電泳，其中1.純化腹水2.未純化M.低分子量蛋白 Marker0圖3為本發(fā)明的2D6染色體計(jì)數(shù)圖譜。圖4為本發(fā)明ELISA最佳一抗和二抗工作濃度。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)例對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)說(shuō)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例1豬繁殖與呼吸綜合征病毒Nsp9蛋白的制備及純化
經(jīng)鑒定的陽(yáng)性重組質(zhì)粒pETj8a-Nsp9轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂板挑菌(KanlOO mg/mL)，陽(yáng)性菌在涂加卡那霉素(100 mg/mL) LB液體培養(yǎng)基(Kan 100 mg/mL)中振搖培養(yǎng)過(guò)夜后，按1%轉(zhuǎn)接種于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基(KanlOO mg/mL)，37°C振搖培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(0D600nm=0. 6)，加入IPTG (終濃度lmmol/L)，37°C誘導(dǎo)培養(yǎng)3 h。離心沉淀菌體，超聲破碎后經(jīng)電洗脫得到高純度的重組蛋白，于-80°C保存?zhèn)溆?。鑒定結(jié)果見(jiàn)圖1。實(shí)施例2抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒Nsp9蛋白單克隆抗體的制備
1、動(dòng)物免疫選擇6-8周齡健康Balb/C小鼠以弗氏完全佐劑乳化純化的PRRSV Nsp9 蛋白，每只小鼠腹腔注射IOOyg左右，14d后以弗氏不完全佐劑乳化蛋白腹腔注射 100 μ g,最后一次加強(qiáng)免疫時(shí)，直接腹腔注射100 μ g純化的蛋白，融合前3 4d尾靜脈注射50 μ g純化的蛋白。2、細(xì)胞融合取免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0混合于融合管內(nèi)，以300g離心10 min,棄去上清，振蕩細(xì)胞，使兩種細(xì)胞盡量混合均勻，然后60s內(nèi)緩慢滴加預(yù)熱的 PEG-4000溶液，再緩慢加入無(wú)血清的1640培養(yǎng)基終止融合，靜置后再以1 000 r/min離心10 min，棄去上清后加入HAT培養(yǎng)基，使細(xì)胞懸浮并混勻，于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)， 第14d開(kāi)始換液并開(kāi)始檢測(cè)篩選。3、雜交瘤細(xì)胞的篩選和克隆化克隆的篩選采用間接ELISA，用純化的PRRSVNsp9蛋白作為包被抗原。對(duì)所獲陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清進(jìn)行篩選；將ELISA篩選的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化，將檢出的陽(yáng)性孔再次克隆和亞克隆，直到所有的孔都為陽(yáng)性。 通過(guò)三次細(xì)胞克隆最終獲得雜交瘤細(xì)胞株2D6。4、腹水的制備0. 5 mL的高壓滅菌的石蠟油注射到小鼠腹腔，7d后注入106個(gè)雜交瘤細(xì)胞于小鼠腹腔，一周后抽取腹水，將收集好的腹水置37°C 24h，隨后置4°C過(guò)夜， 第二天將腹水離心，上清56°C滅活30 min即可。5、單克隆抗體的純化用4倍體積醋酸緩沖液稀釋腹水，調(diào)至pH4. 5，緩慢滴加3. 3 %的正辛酸，攪拌30 min，離心取上清，加入1/10體積的10倍PBS，調(diào)至pH7. 4，4°C 預(yù)冷后，用45 %飽和硫酸銨沉淀，離心后取沉淀，用PBS稀釋后移入透析袋，在50倍體積PBS中透析，透析期間多次換液，透析結(jié)束后，紫外分光光度計(jì)觀0 nm測(cè)定蛋白濃度并分裝凍存。6抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒Nsp9蛋白單克隆抗體的特性鑒定
1、腹水效價(jià)測(cè)定間接ELISA方法測(cè)定，細(xì)胞培養(yǎng)上清與腹水分別從10倍和100倍開(kāi)始做梯度稀釋?zhuān)瑫r(shí)分別以SP2/0細(xì)胞培養(yǎng)上清和腹水做同等稀釋度作為對(duì)照。通過(guò)檢測(cè)得知2D6單抗的腹水效價(jià)為6. 4X 105。鑒定結(jié)果見(jiàn)圖3。2、豬繁殖與呼吸綜合征病毒Nsp9蛋白單克隆抗體IgG亞類(lèi)鑒定按小鼠mAb IgG亞類(lèi)檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。具體方法是將純化的每株單克隆抗體1000倍稀釋后包被酶標(biāo)板，每孔100 μ L，37°C孵育1 h，洗滌后每孔加入1 000倍稀釋的抗體亞類(lèi)試劑100 μ L ，37°C孵育1 h，洗滌3遍。然后加入羊抗小鼠IgG酶標(biāo)二抗，37°C孵育1 h，洗滌后加入底物顯色，確定單克隆抗體的亞類(lèi)為IgGh.
3、雜交瘤細(xì)胞株染色體的分析采用秋水仙素法對(duì)雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行染色體分析，結(jié)果顯示2D6雜交瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目為101條，鑒定結(jié)果見(jiàn)圖2。4、豬繁殖與呼吸綜合征病毒單克隆抗體特異性鑒定將所獲單克隆抗體分別與豬偽狂犬病毒、豬流感病毒、豬細(xì)小病毒進(jìn)行間接ELISA，檢測(cè)所得知制備的單克隆抗體與其它豬病毒病均無(wú)交叉反應(yīng)性，鑒定結(jié)果見(jiàn)表二。實(shí)施例3阻斷ELISA方法的建立 1.反應(yīng)程序的建立
(1)間接ELISA方法的程序
包被用PH9. 6碳酸緩沖液稀釋的ELISA抗原稀釋成0. 2 μ g/孔，以每孔100 μ L的量加入酶標(biāo)板中，4°C過(guò)夜。甩干包被液，PBST (含0. 05%Tween-20的PBS，pH7. 2)洗板3次。 封閉加入5%脫脂牛奶封閉液，300 μ L/孔，370C 60min,甩干，洗滌液洗滌3次，300 μ L/孔， 3min/次。加樣加入抗PRRSV Nsp9蛋白單抗2D6，每孔100 μ L，37°C作用60 min ；洗滌液洗滌5次，300 μ L/孔，3min/次。加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠HRP酶標(biāo)二抗，每孔100 μ L，37°C 作用45 min ；甩去液體、洗板，加入ΤΜΒ，每孔100 μ L，室溫作用15 min ；加入1 mol/L H2SO4 50 μ L終止反應(yīng)，測(cè)定0D490nm值。(2)抗原最佳工作濃度的確定
以已測(cè)定濃度的目的重組蛋白為抗原做倍比稀釋?zhuān)瑵舛确謩e為1.6ug / mL,0. 8ug / mL，0. 4ug / mL，0. 2 ug / mL，0. lug / mL，0. 05 ug / mL, IOOug / 孔，4°C包被酶標(biāo)板過(guò)夜。 陰、陽(yáng)性血清也同時(shí)做系列倍比稀釋1 :20，1 40, 1 :80，1 :160，組成方陣，進(jìn)行間接ELISA。各步37°C反應(yīng)30 min，顯色12 15 min后終止。在酶聯(lián)檢測(cè)儀上490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣本OD值。選擇陽(yáng)性血清OD值在1左右且陽(yáng)性O(shè)D值/陰性O(shè)D值(P / N)比值最大時(shí)的抗原包被濃度和抗體稀釋度為最佳工作濃度。確定最佳抗原包被濃度為0. 5ug / mL 2.重組Nsp9蛋白阻斷ELISA程序
包被用PH9. 6碳酸緩沖液稀釋的ELISA抗原稀釋成0. 2 μ g/孔，以每孔100 μ L的量加入酶標(biāo)板中，4°C過(guò)夜。甩干包被液，PBST (含0. 05%Tween-20的PBS, pH7. 2)洗板3次。 封閉加入5%脫脂牛奶封閉液，300 μ L/孔，370C 60min,甩干，洗滌液洗滌3次，300 μ L/孔， 3min/次。加樣1:加入被檢的豬血清，每孔100 μ L，37°C作用45 min ；甩去液體、洗板，洗滌液洗滌5次，300 μ L/孔，3min/次。加樣2:加入抗PRRSV Nsp9蛋白單抗2D6，80000倍稀釋?zhuān)靠?00 μ L，37°C作用60 min ；洗滌液洗滌5次，300 μ L/孔，3min/次。甩去液體、洗板，加入HRP標(biāo)記的羊抗豬二抗，每孔100μ ，37 作用60 min ；甩去液體、洗板，加入0PD， 每孔100 μ L，室溫作用15 min ；加入1 mol/L H2SO4 50 μ L終止反應(yīng)，測(cè)定0D490nm值。3.阻斷ELISA最適反應(yīng)條件的確定 (1) 一抗、二抗最佳工作濃度的確定
用已確定的抗原最適工作濃度進(jìn)行阻斷ELISA，方陣滴定法測(cè)定PRRSV單克隆杭體的最佳工作濃度和酶標(biāo)抗體的參考工作濃度。將結(jié)合單抗和酶標(biāo)二抗作不同稀釋度稀釋?zhuān)?各步37°C反應(yīng)60 min，顯色12 15 min后終止。490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣本OD值。選擇OD 值在1左右且陽(yáng)性O(shè)D值/陰性O(shè)D值(P / N)比值最大時(shí)的一抗和二抗稀釋度為最佳工作濃度。確定最佳一抗工作濃度為80000倍稀釋?zhuān)篂?000倍稀釋?zhuān)b定結(jié)果見(jiàn)圖4。(2)封閉液及作用時(shí)間的確定
用已確定的抗原、抗體及酶標(biāo)二抗的最適工作濃度進(jìn)行間接ELISA。分別用含m脫脂奶粉的PBS、5%脫脂奶粉的PBS、10%血清、0. 05%Tween-20的PBS作為反應(yīng)的封閉液及抗體稀釋液。37°C分別封閉30min、lh、2h。顯色12-15 min后終止。490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各樣本 OD值。比較各組的0D490值和P / N值，確定ELISA反應(yīng)的最適封閉液及封閉時(shí)間。選擇 5%脫脂奶粉的PBS作用Ih為最佳封閉液和作用時(shí)間。(3)阻斷ELISA敏感性試驗(yàn)
判定標(biāo)準(zhǔn)的確定取20份經(jīng)IDEXX PRRSV抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)為PRRSV抗體陽(yáng)性的豬血清，按1 100稀釋后進(jìn)行間接阻斷ELISA測(cè)定0D490nm值，規(guī)定以20份血清的平均0D490nm加3倍標(biāo)準(zhǔn)差作為陰陽(yáng)性的臨界值，計(jì)算其抑制率。結(jié)果顯示抑制率大于30% 為抗體陽(yáng)性，抑制率小于30%為陰性作為判斷標(biāo)準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒的活毒抗體試劑盒，其特征在于將96孔ELISA板、 樣品稀釋液、20倍濃縮洗滌液、羊抗小鼠IgG-HRP結(jié)合物、結(jié)合單抗、終止液、A底物、B底物、 陽(yáng)性樣品、陰性樣品、蓋板膜分別用的廣口瓶加以封裝，貼上標(biāo)簽，組裝成試劑盒，具體組裝方法按以下步驟完成第一步首先對(duì)96孔ELISA板進(jìn)行包被96空ELISA板上包被有PRRSV Nsp9蛋白，用包被緩沖液將Nsp9蛋白稀釋到1. 5ug/mL，每孔IOOul包被ELISA板，37°C包被Ih后用含 5%脫脂奶粉的PBS 37°C封閉lh，然后用PBS洗滌5次干燥后用鋁箔真空密封備用；第二步配制樣品稀釋液(PBST PH7. 4) :NaCl 8. Og ；KH2P04 0. 2g ；Na2HP04 · 12H20 2. 9g ；KCl 0. 2g 補(bǔ)加二餾水致 IOOOml ；加入 0. 5ml Tween-20，最后 50ml 分裝；第三步配制 20 倍濃縮洗滌液:NaCl 160. Og ；KH2P04 4g ；Na2HP04 · 12H20 58g ；KCl 4g補(bǔ)加二餾水致IOOOml ；加入IOml Tween-20，最后50ml分裝；第四步將購(gòu)買(mǎi)的羊抗小鼠IgG-HRP結(jié)合物用IOml PBST加入2ul羊抗小鼠IgG-HRP 二抗進(jìn)行稀釋?zhuān)缓蠹尤?%PEG，以25ml分裝； 第五步結(jié)合單抗的制備首先根據(jù)豬繁殖與呼吸綜合征病毒BJ-4株及變異毒株(HB-l、SY0608、HN-HW、HuN4等) 的核苷酸序列，利用I^rimer軟件設(shè)計(jì)合成針對(duì)PRRSV Nsp9基因保守區(qū)域的特異性引物；用 RT-PCR方法擴(kuò)增出豬繁殖與呼吸綜合征病毒JL/07/SW株Nsp9基因片段，克隆到pMD18_ T載體并測(cè)序，基因克隆至表達(dá)載體pET-28a (+)，得到重組表達(dá)載體pET-28a-Nsp9，用經(jīng)鑒定的陽(yáng)性重組質(zhì)粒pET-28a-Nsp9轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂板挑菌(KanlOO mg/ mL)，陽(yáng)性菌在涂加卡那霉素(100 mg/mL)LB液體培養(yǎng)基(Kan 100 mg/mL)中振搖培養(yǎng)過(guò)夜后，按1%轉(zhuǎn)接種于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基(KanlOO mg/mL)，37°C振搖培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 (0D600nm=0. 6)，加入IPTG (終濃度lmmol/L)，37°C誘導(dǎo)培養(yǎng)3 h ；離心沉淀菌體，超聲破碎后經(jīng)電洗脫得到高純度的重組Nsp9蛋白，于-80°C保存?zhèn)溆茫?然后用重組Nsp9蛋白制備單克隆抗體，具體方法如下·1、動(dòng)物免疫選擇6-8周齡健康Balb/C小鼠以弗氏完全佐劑乳化純化的PRRSVNsp9蛋白，每只小鼠腹腔注射100μ g，14d后以弗氏不完全佐劑乳化蛋白腹腔注射100μ g，最后一次加強(qiáng)免疫時(shí)，直接腹腔注射100 μ g純化的蛋白，融合前3 4d尾靜脈注射50 μ g純化的蛋白；·2、細(xì)胞融合取免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0混合于融合管內(nèi)，以300g離心10min,棄去上清，振蕩細(xì)胞，使兩種細(xì)胞盡量混合均勻，然后60s內(nèi)緩慢滴加預(yù)熱的PEG-4000溶液，再緩慢加入無(wú)血清的1640培養(yǎng)基終止融合，靜置后再以1 000 r/min離心10 min， 棄去上清后加入HAT培養(yǎng)基，使細(xì)胞懸浮并混勻，于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，第14d開(kāi)始換液并開(kāi)始檢測(cè)篩選；·3、雜交瘤細(xì)胞的篩選和克隆化克隆的篩選采用間接ELISA，用純化的PRRSVNsp9蛋白作為包被抗原；對(duì)所獲陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清進(jìn)行篩選；將ELISA篩選的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化，將檢出的陽(yáng)性孔再次克隆和亞克隆，直到所有的孔都為陽(yáng)性；通過(guò)三次細(xì)胞克隆最終獲得雜交瘤細(xì)胞株2D6 ；·4、腹水的制備0.5mL的高壓滅菌的石蠟油注射到小鼠腹腔，7d后注入106個(gè)雜交瘤細(xì)胞于小鼠腹腔，一周后抽取腹水，將收集好的腹水置37°C 24h，隨后置4°C過(guò)夜，第二天將腹水離心，上清56°C滅活30 min即可；、5、單克隆抗體的純化用4倍體積醋酸緩沖液稀釋腹水，調(diào)至pH4. 5，緩慢滴加3. 3 % 的正辛酸，攪拌30 min，離心取上清，加入1/10體積的10倍PBS，調(diào)至pH7. 4，4°C預(yù)冷后，用45 %飽和硫酸銨沉淀，離心后取沉淀，用PBS稀釋后移入透析袋，在50倍體積 PBS中透析，透析期間多次換液，透析結(jié)束后，紫外分光光度計(jì)觀0 nm測(cè)定蛋白濃度并分裝凍存；6抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒Nsp9蛋白單克隆抗體的特性鑒定(1)、腹水效價(jià)測(cè)定間接ELISA方法測(cè)定，細(xì)胞培養(yǎng)上清與腹水分別從10倍和100倍開(kāi)始做梯度稀釋?zhuān)瑫r(shí)分別以SP2/0細(xì)胞培養(yǎng)上清和腹水做同等稀釋度作為對(duì)照；通過(guò)檢測(cè)得知2D6單抗的腹水效價(jià)為6. 4 X IO5 ；(2)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒Nsp9蛋白單克隆抗體IgG亞類(lèi)鑒定按小鼠mAbIgG亞類(lèi)檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；具體方法是將純化的每株單克隆抗體1000倍稀釋后包被酶標(biāo)板，每孔100 μ L，37°C孵育1 h，洗滌后每孔加入1 000倍稀釋的抗體亞類(lèi)試劑100 μ L ，37°C孵育1 h，洗滌3遍；然后加入羊抗小鼠IgG酶標(biāo)二抗，37°C孵育1 h，洗滌后加入底物顯色，確定單克隆抗體的亞類(lèi)為IgGh.(3)、雜交瘤細(xì)胞株染色體的分析采用秋水仙素法對(duì)雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行染色體分析， 結(jié)果顯示2D6雜交瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目為101條；(4)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒單克隆抗體特異性鑒定將所獲單克隆抗體分別與豬偽狂犬病毒、豬流感病毒、豬細(xì)小病毒進(jìn)行間接ELISA，檢測(cè)所得知制備的單克隆抗體與其它豬病毒病均無(wú)交叉反應(yīng)性；將以上純化單抗2D6以80000倍稀釋于PBS中加入4%PEG，25ml分裝；第六步配制終止液2mol/L H2S04濃硫酸44. 5ml，雙蒸水；355. 5ml, IOml分裝；第七步配制A底物TMB 200mg，無(wú)水乙醇100ml，加雙蒸水至1000ml，IOml分裝；第八步配制B底物(0. lml/L檸檬酸-0. 2ml/L磷酸氫二納，ρΗ5· 0-5. 4) :Na2HP04 14. 60g,檸檬酸 9. 33g，0. 75% 過(guò)氧化氫 6. 4ml，加三蒸水至 1000ml，調(diào)至 ρΗ5· 0-5. 43，IOml 分裝；第九步配制陽(yáng)性樣品將標(biāo)準(zhǔn)PRRSV陽(yáng)性血清1:5稀釋于樣品稀釋液中，Iml分裝；第十步配制陰性樣品將經(jīng)檢測(cè)PRRSV陰性血清1:5稀釋于樣品稀釋液中，Iml分裝。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒的活毒抗體試劑盒，其特征在于所述采用試劑盒進(jìn)行的檢測(cè)方法如下將待檢血清用樣品稀釋液2倍稀釋后IOOul加入ELISA板中37°C孵育lh，設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照；用洗滌液清洗5次，每次 2min ；然后加入結(jié)合單抗每孔100ul，37°C孵育lh，洗滌液清洗5次，每次^iin ；然后加入羊抗小鼠IgG-HRP結(jié)合物37°C作用lh，洗滌液清洗5次，每次^iin ；然后加入顯色底物溶液，將底物A和底物B以1 1混合，IOOul加入ELISA孔中，避光顯色15min,加入50ul終止液，測(cè)其0D490值；判定結(jié)果是這樣設(shè)定的抑制率PI= (0D未抑制-OD樣品)/OD未抑制 *100%，PI>30%對(duì)應(yīng)的樣品為陽(yáng)性，小于則為陰性。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒的活毒抗體試劑盒，其特征在于將待檢血清用樣品稀釋液2倍稀釋后100μl加入ELISA板中37℃孵育1h，設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照。用洗滌液清洗5次，每次2min；然后加入結(jié)合單抗每孔100μl，37℃孵育1h，洗滌液清洗5次，每次2min；然后加入羊抗小鼠IgG-HRP結(jié)合物37℃作用1h，洗滌液清洗5次，每次2min；然后加入顯色底物溶液，將底物A和底物B以1:1混合，100μl加入ELISA孔中，避光顯色15min，加入50μl終止液，測(cè)其OD490值。判定結(jié)果是這樣設(shè)定的抑制率PI=(OD未抑制-OD樣品)/OD未抑制*100%，PI>30%對(duì)應(yīng)的樣品為陽(yáng)性，小于則為陰性。該試劑盒方法技術(shù)成熟，重復(fù)性強(qiáng)，能夠有效區(qū)分豬繁殖與呼吸綜合征病毒活毒和滅活毒抗體，一般研究人員即可完成。
文檔編號(hào)G01N33/569GK102305859SQ20111021215
公開(kāi)日2012年1月4日 申請(qǐng)日期2011年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月27日
發(fā)明者丁壯, 吳娟, 張泉鵬, 楊閩楠, 母連志, 黃志強(qiáng) 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)