一種利用細(xì)胞工廠制備豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于疫苗技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗及其利用 細(xì)胞工廠制備所述豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS，又稱豬藍(lán)耳?。?，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒 (PRRSV)引起的一種母豬繁殖障礙和各日齡豬呼吸疾病為特征的高度接觸性傳染病。藍(lán)耳 病是目前影響世界養(yǎng)豬業(yè)最嚴(yán)重的疾病之一，自其被發(fā)現(xiàn)以來傳播迅速，危害性大，仔豬發(fā) 病率可達(dá)100 %，死亡率可達(dá)50 %以上，母豬流產(chǎn)率可達(dá)30 %以上，育肥豬也可發(fā)病死亡。
[0003] 目前普遍使用的是用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)細(xì)胞的傳統(tǒng)工藝，轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)具有結(jié)構(gòu)簡單，投資少， 技術(shù)成熟，重復(fù)性好，容易擴(kuò)大等優(yōu)點(diǎn)；但也有其缺點(diǎn)：勞動(dòng)強(qiáng)度大，占地空間大，單位體積 提供的細(xì)胞生長的面積小，細(xì)胞生長密度低，培養(yǎng)時(shí)監(jiān)測和控制環(huán)境條件限制等缺點(diǎn)。
[0004] 因此，本領(lǐng)域需要新的豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗及其制備方法和生產(chǎn)工藝。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 在本發(fā)明中，發(fā)明人提供了一種豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗及其利用細(xì)胞工廠 制備所述豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗的方法。
[0006] 在第一方面，本發(fā)明提供了一種豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗每20ml成品包括：
[0007] 白油佐劑：12~14ml
[0008] 病毒培養(yǎng)液：6~8ml
[0009] 其中每ml豬繁殖與呼吸綜合征病毒含量不低于106' 5TCID50。
[0010] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的疫苗可以為油乳劑滅活疫苗
[0011] 在第二方面，本發(fā)明提供了制備第一方面所述的疫苗的方法，所述方法包括：
[0012] (a)復(fù)蘇 MARC-145 細(xì)胞；
[0013] (b)將所述MARC-145細(xì)胞接種至細(xì)胞工廠進(jìn)行單層培養(yǎng)；
[0014] (c)將豬繁殖與呼吸綜合征病毒接種于所培養(yǎng)的MARC-145細(xì)胞；和
[0015] (d)收獲接種后的MARC-145細(xì)胞；和
[0016] (e)將所收獲的MARC-145細(xì)胞培養(yǎng)液滅活，加入適量白油佐劑乳化獲得所述豬繁 殖與呼吸綜合征滅活疫苗。
[0017] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的制備疫苗的方法可以包括：
[0018] (1)將MARC-145細(xì)胞懸浮于含5~8%牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，之后再培養(yǎng)瓶中 培養(yǎng)至90%以上的細(xì)胞貼壁；
[0019] (2)將步驟（1)中所培養(yǎng)的細(xì)胞用胰酶消化后接種至細(xì)胞工廠中，每層 150ml-250ml細(xì)胞懸液，蓋好進(jìn)液口蓋，放37°C溫室中靜止培養(yǎng)；
[0020] (3)細(xì)胞培養(yǎng)48~72小時(shí)后，棄去細(xì)胞工廠內(nèi)培養(yǎng)基，接種所述的適量的豬繁殖 與呼吸綜合征病毒，吸附1小時(shí)，吸附后加入維持液，將維持液分勻后放入37°C溫室中繼續(xù) 培養(yǎng)；和
[0021] (4)培養(yǎng)至70%及以上的細(xì)胞出現(xiàn)致細(xì)胞病變效應(yīng)時(shí)收獲所述MARC-145細(xì)胞，通 過反復(fù)凍融細(xì)胞2次，將所述MARC-145細(xì)胞從細(xì)胞工廠壁上搖下過濾去除細(xì)胞碎片后，收 集到無菌容器內(nèi)；和
[0022] (5)加入適量的甲醛溶液，混勻，37°C滅活至少18個(gè)小時(shí)，獲得所述豬繁殖與呼吸 綜合征病毒抗原，在抗原中加入適量白油，經(jīng)過乳化獲得滅活疫苗。
[0023] 在某些實(shí)施方案中，所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒可以是NVDC-JXA1株。
[0024] 在某些實(shí)施方案中，將所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒接種于所述MARC-145細(xì)胞 的方法可以是將所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒的工作毒種接種于所述細(xì)胞工廠中培養(yǎng)的 單層MARC-145細(xì)胞。
[0025] 在某些實(shí)施方案中，將所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒接種于所述MARC-145細(xì)胞 的方法可以是將所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒的工作毒種接種于MARC-145細(xì)胞懸液中后 分裝在所述細(xì)胞工廠中。
[0026] 在某些實(shí)施方案中，可以按3%~5%接種所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒。
[0027] 在某些實(shí)施方案中，滅活時(shí)可以按終濃度為0. 1%~0.2%比例加入所述甲醛溶 液。
[0028] 在某些實(shí)施方案中，所述方法還可以包括將所述豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗以 冷凍水循環(huán)的方式進(jìn)行冷卻，并于4°C保存。
[0029] 本發(fā)明的有益效果：
[0030] 本發(fā)明采用NVDC-JXA1病毒株作為接種病毒株，并采用細(xì)胞工廠制備的豬繁殖與 呼吸綜合癥滅活疫苗，所獲得的疫苗質(zhì)量優(yōu)良，免疫效力高，免疫效果穩(wěn)定。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 下列實(shí)施例皆在進(jìn)一步舉例描述本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明。在不背 離本發(fā)明的精神及原則的前提下，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易實(shí)現(xiàn)的任何改動(dòng)或改變都將 本發(fā)明的待批權(quán)利要求范圍之內(nèi)。
[0032] 本發(fā)明實(shí)施例中，選用美國CORNING公司出品的Cell STACK 10層（636CM2/層） 或更多層數(shù)細(xì)胞工廠，采用同步感染法制備豬繁殖與呼吸綜合癥滅活疫苗；MARC-145細(xì)胞 和豬繁殖與呼吸綜合征病毒株NVDC-JXA1，由北京市獸醫(yī)生物藥品廠質(zhì)管部保管和供應(yīng)。
[0033] 實(shí)施例1 :
[0034] 制備工藝主要步驟如下：
[0035] 1)復(fù)蘇細(xì)胞
[0036] 從液氮罐中取出細(xì)胞管置37°C水浴中融化，將細(xì)胞移入裝有10ml無血清培養(yǎng)基 的離心管中，1，OOOrpm/分，離心5分鐘。用含8 %牛血清的DMEM培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，接種T175 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，37°C培養(yǎng)，當(dāng)長成良好單層時(shí)，用0. 25%胰酶消化細(xì)胞，按1:4傳代培養(yǎng)。
[0037] 2)細(xì)胞單層培養(yǎng)
[0038] 將以擴(kuò)大并長成良好單層的細(xì)胞，用0.25%胰酶消化，接種到細(xì)胞工廠中，每層 150ml-250ml細(xì)胞懸液，蓋好進(jìn)液口蓋，放37°C溫室中靜止培養(yǎng)。
[0039] 3)接種及更換維持液
[0040] 細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后，棄去細(xì)胞工廠內(nèi)培養(yǎng)基，按4.0%接種NVDC-JXA1病毒株，吸 附1小時(shí)（每層分勻），吸附后加入維持液，將維持液分勻，擰緊口帽，放入37°C溫室中繼續(xù) 培養(yǎng)
[0041] 4)培養(yǎng)與觀察
[0042] 接毒后24h后每天觀察一次，待70%以上細(xì)胞出現(xiàn)CPE時(shí)，即可收獲。
[0043] 5)收獲
[0044] 接毒后隨時(shí)觀察病變情況，培養(yǎng)至70%及以上的細(xì)胞出現(xiàn)致細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE) 時(shí)，即可收獲。反復(fù)凍融細(xì)胞2次，將細(xì)胞從細(xì)胞工廠壁上搖下，經(jīng)180目絹布過濾去除細(xì) 胞碎片，收集到無菌容器內(nèi)，取樣，做無菌檢驗(yàn)，將收獲的抗原放置于_20°C冷庫中保存。 [0045] 6)滅活
[0046] 將已解凍好的抗原通過管道進(jìn)入已滅菌的滅活罐中，混合完畢后攪拌10分鐘，通 過取樣閥取滅前樣20ml，檢驗(yàn)和計(jì)算病毒液含量，按終濃度為0. 2 %比例加入一定量的甲 醛溶液，并以120轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢?0分鐘，混勻，37°C (待罐內(nèi)溫度升至37°C開始計(jì)時(shí)）滅活 18個(gè)小時(shí)，滅活結(jié)束后取樣20ml，并做好記錄放4°C冰箱保存待檢。取樣后加入適量吐溫， 攪拌10分鐘，通過冷凍水循環(huán)的方式對抗原進(jìn)行冷卻。通過使用壓縮空氣把滅活罐內(nèi)抗原 打到滅菌白桶內(nèi)放4°C庫保存。
[0047] 7)乳化
[0048] 取油相（MARC52) 2份放入膠體磨中，開動(dòng)電機(jī)慢速轉(zhuǎn)動(dòng)攪拌，同時(shí)徐徐加入水相1 份，加完后再以10, 〇〇〇r/min，攪拌3-5分鐘，在終止攪拌前加入終濃度為0. 01 %硫柳汞溶 液。
[0049] 8)分裝
[0050] 將乳化好的疫苗打入灌裝間，疫苗瓶、膠塞分別滅菌后移入灌裝車間，按產(chǎn)品規(guī)格 定量灌裝、加塞、乳蓋。
[0051] 9)貼標(biāo)保存
[0052] 將灌裝好的疫苗瓶貼上標(biāo)簽，連同說明書裝箱。抽取樣品，掛待檢牌入成品庫待檢 區(qū)。
[0053] 10)檢驗(yàn)結(jié)果：
[0054]
[0055] 實(shí)施例2 :
[0056] 制備工藝主要步驟如下：
[0057] 1)復(fù)蘇細(xì)胞
[0058] 本生產(chǎn)用細(xì)胞為MARC-145細(xì)胞，由北京市獸醫(yī)生物藥品廠質(zhì)管部保管和供應(yīng)。
[0059] 從液氮罐中取出細(xì)胞管置37°C水浴中融化，將細(xì)胞移入裝有10ml無血清培養(yǎng)基 的離心管中，1，000印111/分，離心5分鐘。用含7%牛血清的01^11培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，接種1'175 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，37°C培養(yǎng)，當(dāng)長成良好單層時(shí)，用0. 25%胰酶消化細(xì)胞，按1:4傳代培養(yǎng)。
[0060] 2)細(xì)胞單層培養(yǎng)
[0061] 將以擴(kuò)大并長成良好單層的細(xì)胞，用0.25%胰酶消化，接種到細(xì)胞工廠中，每層 150ml-250ml細(xì)胞懸液，蓋好進(jìn)液口蓋，放37°C溫室中靜止培養(yǎng)。
[0062] 3)接種及更換維持液：
[0063] 細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后，棄去細(xì)胞工廠內(nèi)培養(yǎng)基，按4.