一種人tscm細(xì)胞的制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于細(xì)胞免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是一種體外擴增人外周血TSCM細(xì)胞的方法及應(yīng)用。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003]近年來，隨著免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展，非特異性免疫細(xì)胞治療在臨床上因為有一定的效果，被越來越多的人接受。目前現(xiàn)有的免疫細(xì)胞治療的有CIK、CTL等細(xì)胞，這些在體內(nèi)存活時間短，并且治療效果隨個體差異及制備手段的不同效果差異也很大。免疫細(xì)胞的自我更新、維持穩(wěn)態(tài)、殺瘤能力都會隨著分化而減弱，最后變成終末分化細(xì)胞，呈現(xiàn)衰老等狀態(tài)。而市面上的CIK、CTL等細(xì)胞大多都趨近于終末分化細(xì)胞。TSCM細(xì)胞可以通過自我更新在體內(nèi)長期存在，維持自我穩(wěn)態(tài)，并具有更強的殺瘤活性。
[0004]國外現(xiàn)有的TSCM培養(yǎng)方法培養(yǎng)細(xì)胞量較少，不能滿足一次回輸所需要的量。本方法，通過使用細(xì)胞IL-7、IL-15維持體內(nèi)干性細(xì)胞數(shù)量并且增強細(xì)胞毒性和記憶性，頂-12獨斷GSK-30信號并且增強Wnt信號通路是TSCM細(xì)胞增殖但是維持干性，降低其分化程度，提高表達(dá)CD45RA的細(xì)胞的量，使這群細(xì)胞具有干細(xì)胞特性，維持穩(wěn)態(tài)及自我更新能力，并具有更強的殺瘤活性。而不僅僅是使用終末分化的CIK或者CTL細(xì)胞。并且TSCM細(xì)胞也是唯一一種可以在器官移植中增殖并且調(diào)節(jié)移植物抗宿主病的T細(xì)胞亞群。
[0005]TSCM細(xì)胞可以突破現(xiàn)有過繼性免疫的限制，解決T細(xì)胞的移植問題、在體內(nèi)存活時間短的問題、不能再持續(xù)產(chǎn)生免疫應(yīng)答等的問題，具有更強的抗瘤效應(yīng)。
[0006]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是為了提供一種實用高效的體外擴增人TSCM細(xì)胞的方法。
[0008]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種制備人TSCM細(xì)胞的方法，包括如下步驟:采集并分離外周血單個核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)，用抗CD3單抗和抗CD28單抗刺激，同時加入細(xì)胞因子rh IL-7、rh IL-15,rh IL-2及IM-12，置于37°C，5%C02和飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，72小時后進(jìn)行半兩更換培養(yǎng)并補加等量的rh IL-2、rh IL_7、rh頂-12及和頂-12，以后根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài)每2?3天進(jìn)行補加等量含有rh IL_2、rh IL_7、rhIL-15和IM-12的培養(yǎng)液，以維持細(xì)胞密度為(0.5?2) X 16個/mLdO?15天即可獲得TSCM細(xì)胞。
[0009]根據(jù)本發(fā)明，所述的PBMCs是采用聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度離心法分離手機，并用生理鹽水洗滌2次，低速離心后獲得。所述rh IL-7的終濃度為l-50ng/mL、rh IL-2終濃度為50-1500IU、頂-12終濃度為1-50μΜ、抗CD3單抗終濃度為l-50ng/mL、抗CD28單抗終濃度為5-300ng/mL。根據(jù)PBMCs的生長狀態(tài)，細(xì)胞培養(yǎng)時間約為10_21天。
[0010]本發(fā)明所用的原料和試劑除有特殊說明外，均市售可得。[0011 ]本發(fā)明的有益效果:利用抗CD3單抗和抗CD28單抗作為刺激劑，激活TSCM細(xì)胞，并聯(lián)合細(xì)胞因子rh IL-7、rh IL-15和rh IL-2共同刺激，利用頂-12阻斷干細(xì)胞分化培養(yǎng)TSCM細(xì)胞，使獲得的細(xì)胞具有記憶細(xì)胞和干細(xì)胞的共同特性。從而為臨床過繼性免疫細(xì)胞治療提供新的可選方案。
[0012]【具體實施方式】:
下面用實例說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下面實例中凡未注明具體條件的實驗方法，均為遵照常規(guī)方法和廠家提供的操作說明執(zhí)行。
[0013]實施例1
本實例I是用rh IL-7、rh IL-15,rh IL-2、抗CD3單抗、抗CD28單抗刺激PBMCs，用IM-12阻斷干性細(xì)胞分化，以獲得TSCM細(xì)胞。具體操作包括以下步驟:
I.無菌條件下用血細(xì)胞分離機或50mL注射器采集患者外周靜脈血，經(jīng)聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度離心獲得單個核細(xì)胞。具體步驟為:1500轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，吸取上層血漿層，56°C滅活30分鐘后離心備用，用生理鹽水按1:1稀釋沉淀的血細(xì)胞，人淋巴細(xì)胞分離液與稀釋血液按照1:2的比例加入離心管中，2000轉(zhuǎn)/分，離心20分鐘，放置時間較長的血液離心30分鐘，小心吸取白膜層，用生理鹽水洗滌兩次，轉(zhuǎn)速分別為1500轉(zhuǎn)/分，1200轉(zhuǎn)/分，均離心8分鐘，即可獲得外周血單個核細(xì)胞。
[0014]2.將上述分離的PBMCs置于含有刺激劑和細(xì)胞因子為25ng/mL rh IL_7、25ng/mLrh IL-15、300IU rh IL_2、30ng/mL 抗CD3單抗、lOOng/mL抗CD28單抗、2μΜ 頂-12和 1-10%自體血漿的RPMI 1640、0pTmizer、A頂-V、SCGM或GT-T551培養(yǎng)基內(nèi)，調(diào)整細(xì)胞密度為(I?2)X 1MVmL，轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)班板、培養(yǎng)瓶或者培養(yǎng)袋內(nèi)，于37°C、5%C02和飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，72小時后進(jìn)行半兩更換培養(yǎng)液并加等量的rh IL-2、rh IL_7、rh IL-15及頂-12，以后根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài)每2?3天進(jìn)行補加含有等量rh IL-2、rh IL_7、rh IL-15及頂-12的培養(yǎng)液，以維持細(xì)胞密度為(0.5?2) X 16個/mLlO?15天即可獲得數(shù)量較多的TSCM細(xì)胞。在細(xì)胞培養(yǎng)的第14天，培養(yǎng)增殖的人TSCM細(xì)胞絕對擴增細(xì)胞倍數(shù)平均為300倍。
[0015]實施例2
本實施例2將對上述培養(yǎng)的TSCM細(xì)胞形態(tài)學(xué)、活率及均一性檢測。具體操作包括以下步驟:
1.形態(tài)學(xué)觀察細(xì)胞培養(yǎng)24小時即可見TSCM細(xì)胞沉于培養(yǎng)皿底部，并趨于集落化，48小時集落開始變大，
2.活率檢測，取培養(yǎng)后的細(xì)胞，1500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，棄培養(yǎng)基，用用含5%的胎牛血清和0.1%疊氮鈉的100ng/mL PI進(jìn)行染色15分鐘，1500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，棄上清，重懸于生理鹽水中，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。
[0016]3.均一性檢測，分別取第0、7、14和21天的細(xì)胞，用含5%的胎牛血清和0.1%疊氮鈉的生理鹽水洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞密度為I X 16個/mL，每個檢測管內(nèi)加入50yL細(xì)胞懸液，加入熒光標(biāo)記抗體CD45、CD3、CD4、CD8、CD 133、CD95、CD 122、CD 127、CD45RA、CD45R0、CD62L、CCR7染色，4°C避光孵育30分鐘，用上述生理鹽水洗滌2次，重懸于上述生理鹽水中，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，數(shù)據(jù)文件采用Flow Jo軟件分析。本發(fā)明制備的細(xì)胞制劑，CD3+T細(xì)胞高度富集純度達(dá)98%，TSCM細(xì)胞的比例較其他培養(yǎng)方式中記憶性細(xì)胞的比例高出2-10倍。
【主權(quán)項】
1.一種人TSCM細(xì)胞的制備方法，包括步驟: (1)在無菌條件下用血細(xì)胞分離機或50mL注射器采集或者外周靜脈血，經(jīng)聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度離心獲得單個核細(xì)胞； (2)將上述分離的PBMCs置于含有刺激劑和細(xì)胞因子為l-500ng/mLrh IL-7、1-500ng/mL rh IL-15、10-1500IU rh IL-2、l_50ng/mL抗CD3單抗、5_300ng/mL 抗CD28單抗、0.05-50μΜ 頂-12和 1-10%自體血漿的RPMI 1640、0pTmizer、AIM_V、SCGM或GT-T551 培養(yǎng)基內(nèi)，調(diào)整細(xì)胞密度為(0.5?2) X 106個/mL，轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶或者培養(yǎng)袋內(nèi)，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)； (3)細(xì)胞培養(yǎng)48-72小時后進(jìn)行半量更換培養(yǎng)液并補加等量的l-500ng/mLrh IL_7、1_500 ng/mL rh IL-15、10-1500IU rh IL-2以及0.05_50μΜ IM-12，以后根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài)每2?3天進(jìn)行補加含有等量l-500ng/mL rh IL-7、1-500 ng/mL rh IL-15、10-1500IU rhIL-2以及0.05-50μΜ頂-12的培養(yǎng)液，以維持細(xì)胞密度為(0.5?2.0) X 106個/mL; 根據(jù)細(xì)胞的生長狀態(tài)，第10?21天收獲細(xì)胞。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種簡單高效制備人TSCM的方法，其特征在于所述刺激PBMCs過程中采用的刺激劑和細(xì)胞因子的濃度分別為:50-1500IU/mL rh IL-2、l_50ng/mL IL_7、1_50ng/mL IL_15、0.05_50μΜ 頂-12、l_50yg/mL 抗CD3單抗、5_300ng/mL抗CD28單抗，自體血漿濃度為1-10%，細(xì)胞的起始密度為(0.5?2) X 106個/mL。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述人TSCM細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述rhIL-2濃度為300IU/mLo4.根據(jù)權(quán)利要求2所述人TSCM細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述rhIL-7濃度為25ng/mLo5.根據(jù)權(quán)利要求2所述人TSCM細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述rhIL-15濃度為25ng/mL。6.根據(jù)權(quán)利要求2所述人TSCM細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述IM-12濃度為2yg/mL。7.根據(jù)權(quán)利要求2所述人TSCM細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述抗CD3單抗?jié)舛葹?0ng/mLo8.根據(jù)權(quán)利要求2所述人TSCM細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述抗CD28單抗?jié)舛葹?00ng/mLo9.根據(jù)權(quán)利要求1-7所述人TSCM細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所制備的人TSCM細(xì)胞用于腫瘤的治療藥物。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種人TSCM細(xì)胞的制備方法，包括步驟：（1）在無菌條件下用血細(xì)胞分離機或注射器采集或者外周靜脈血，經(jīng)聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度離心獲得單個核細(xì)胞；（2）將上述分離的PBMCs置于含有刺激劑和細(xì)胞因子培養(yǎng)基內(nèi)，調(diào)整細(xì)胞密度為（0.5～2）×106個/mL，轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶或者培養(yǎng)袋內(nèi)，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；（3）細(xì)胞培養(yǎng)48-72小時后進(jìn)行半量更換培養(yǎng)液并補加等量的培養(yǎng)液，以維持細(xì)胞密度為（0.5～2.0）×106個/mL;根據(jù)細(xì)胞的生長狀態(tài)，第10～21天收獲細(xì)胞。本發(fā)明利用抗CD3單抗和抗CD28單抗作為刺激劑，激活TSCM細(xì)胞，并聯(lián)合細(xì)胞因子rh？IL-7、rh？IL-15和rh？IL-2共同刺激，利用IM-12阻斷干細(xì)胞分化培養(yǎng)TSCM細(xì)胞，使獲得的細(xì)胞具有記憶細(xì)胞和干細(xì)胞的共同特性。從而為臨床過繼性免疫細(xì)胞治療提供新的可選方案。
【IPC分類】A61K35/17, C12N5/0783, A61P35/00
【公開號】CN105543169
【申請?zhí)枴緾N201511013852
【發(fā)明人】崔博靖, 付凡, 饒秀茸, 馬飛, 王宇環(huán)
【申請人】深圳市合一康生物科技股份有限公司
【公開日】2016年5月4日
【申請日】2015年12月31日