一種利用黃孢原毛平革菌固體發(fā)酵玉米秸稈生產(chǎn)厚垣孢子樣細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于厚垣抱子樣細(xì)胞的生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種利用黃抱原毛平革菌 固體發(fā)酵玉米賴桿生產(chǎn)厚垣抱子樣細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 黃抱原毛平革菌（Phanerochaete chiysosporium)為一種典型的白腐真菌，屬于 非權(quán)菌目，伏革科，顯革菌屬（李慧蓉.白腐真菌生物學(xué)和生物技術(shù).化學(xué)工業(yè)出版社. 2005)。其菌絲一般無(wú)隔膜，無(wú)鎖狀聯(lián)合。分生抱子為異核體，擔(dān)抱子是同核體。在固體培養(yǎng) 時(shí)，該真菌能產(chǎn)生厚垣抱子(chlamydospore)，厚垣抱子個(gè)體較大，細(xì)胞直徑為60μπι左右。此 外，P.chrysosporium還能?一種厚垣抱子樣細(xì)胞（chlamydospore-likΘcell，QX)的形 式存在（Eunyong C， Junse 0， Sangpill Η， Ik-Sung A, Yeo JY. Enhanced production of manganese peroxidase from immobilized Phanerochaete chrysosporium due to the increased autolysis of chlamydospore-like cells. Biotechnology Letter. 2005， 27 (7): 477-481; Zacchi L， Morris I， Harvey PJ. Disordered ultrastructure in lignin-peroxidase secreting hyphae of the white-rot fungus Phanerochaete chrysosporium. Microbiology. 2000，146 (3): 759-765)，CLC的細(xì)胞 直徑為9-15ym，在細(xì)胞體積上區(qū)別于黃抱原毛平革菌的厚垣抱子，但其也具備厚垣抱子的 易分散、細(xì)胞壁厚和易保藏等優(yōu)點(diǎn)。由于缺少簡(jiǎn)單、高效的生產(chǎn)手段，CLC的制備十分困難， 因此，國(guó)內(nèi)外研究人員均沒(méi)有把P. chrysosporium的化C當(dāng)作一個(gè)可深入研究的對(duì)象。根據(jù) 目前的文獻(xiàn)檢索，國(guó)內(nèi)外尚沒(méi)有P. chrysosporium厚垣抱子樣細(xì)胞生產(chǎn)技術(shù)的相關(guān)報(bào)道。 [0003] P. chrysosporium廣泛應(yīng)用于環(huán)境治理如廢水處理、上壤及河流污染修復(fù)、酶制 劑發(fā)酵、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。對(duì)于P. chrysosporium的研究最初集中在生物質(zhì)資源化方面，由于其 能產(chǎn)生木質(zhì)素過(guò)氧化物酶（lignin peroxidase，LiP)及輸依賴性過(guò)氧化物酶(manganese peroxidase，MnP)，并具有降解包括木質(zhì)素在內(nèi)的許多酷型或非酷型化合物的能力(Bumpus JA, Tien Μ, Wright D, Aust SD. Oxidation of persistent environmental pollutants by a white rot fungus. Science.1985, 228 (4076): 1434-1436)，因此可 用于木質(zhì)素的降解及資源化。隨后，大量報(bào)道表明P. chrysosporium在廢水處理(如焦化廢 水、染料廢水等）、上壤及水體污染生物修復(fù)領(lǐng)域也有著廣闊的應(yīng)用前景（Bogan BW， Schoenike B, Lamar 民Τ， Cullen D. Manganese peroxidase m民NA and enzyme activity levels during bioremediation of polycyclic aromatic hydrocarbon- contaminated soil with Phanerochaete chrysosporium. Applied and Environmental Microbiology. 1996， 62 (7): 2381-2386;Rodarte-Morales AI, Feijoo G, Moreira MT, Lema JM. Biotransformation of three pharmaceutical active compounds by the fungus Ph過(guò)neroch過(guò)ete chrysosporium in 過(guò) fed batch stirred reactor under air and oxygen supply. Biodegradation. 2011， 23 (1): 145-156;Lu Y, Yan LH, Wang Υ, Zhou SF, Fu JJ, Zhang JF. Biodegradation of phenolic compounds from coking wastewater by immobilized white rot fungus Phanerochaete chrysosporium. Journal of Hazardous Material. 2009, 165 (1-3): 1091-1097)。此 夕hP. chrysosporium作為生物農(nóng)藥還可W防治病蟲害，并能通過(guò)降解作物連作后±壤里 的大量化感物質(zhì)（如酪酸類物質(zhì)），解除連作作物的自毒作用。徐淑霞等發(fā)現(xiàn)P. chrysosporium對(duì)黃瓜連作±壤中的徑基苯甲酸、香草酸、阿魏酸等酪酸類物質(zhì)具有明顯的 降解作用，±壤經(jīng)P. chrysosporium修復(fù)后，黃瓜根部病害明顯減輕，枯萎病及根結(jié)線蟲病 相對(duì)病情指數(shù)降低(徐淑霞，張世敏，尤曉顏，賈新成，吳坤.黃抱原毛平革菌對(duì)黃瓜連作上 壤酪酸物質(zhì)的降解.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào).2008，19 (11): 2480-2484)。因此，P. chrysospori皿 可作為防治劑用于作物病蟲害防治及連作障礙的消除。
[0004] 作物賴桿如玉米賴桿是農(nóng)作物生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的一種重要生物質(zhì)資源?，F(xiàn)階段我 國(guó)對(duì)賴桿處理的方法主要是W還田為主，約37%的賴桿直接W肥料的形式利用，但賴桿肥料 在使用前需要經(jīng)過(guò)一定的預(yù)處理工藝，變相增加了成本。其次22.6 %的賴桿被用作牲畜飼 料處理，但直接飼喂賴桿消化率極低，其中的營(yíng)養(yǎng)物和有效能量并不能直接被家畜吸收利 用。剩余的農(nóng)作物賴桿被直接焚燒或棄置，造成資源的極大浪費(fèi)，并對(duì)大氣環(huán)境造成嚴(yán)重污 染。因此，如何有效利用大量的賴桿資源已成為人們研究的焦點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明解決的技術(shù)問(wèn)題是提供了一種利用黃抱原毛平革菌固體發(fā)酵玉米賴桿生 產(chǎn)厚垣抱子樣細(xì)胞的方法，該方法W玉米賴桿作為營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，利用黃抱原毛平革菌固體發(fā) 酵生產(chǎn)厚垣抱子樣細(xì)胞，產(chǎn)生的厚垣抱子樣細(xì)胞在環(huán)境治理、酶制劑發(fā)酵和農(nóng)田生物修復(fù) 等領(lǐng)域具有一定的應(yīng)用潛力。
[0006] 本發(fā)明為解決上述技術(shù)問(wèn)題采用如下技術(shù)方案，一種利用黃抱原毛平革菌固體發(fā) 酵玉米賴桿生產(chǎn)厚垣抱子樣細(xì)胞的方法，其特征在于:黃抱原毛平革菌利用玉米賴桿為碳 源，通過(guò)固體發(fā)酵產(chǎn)生厚垣抱子樣細(xì)胞，其中每千克固體發(fā)酵培養(yǎng)基含W下成分:玉米賴桿 粉碎物300-500g、酒石酸錠50g、KH2P〇4 26g、MgS〇4.7H2〇 24g、CaCl2 20g、MnS〇4.5H2〇 lOg、維生素 B1 O.lg、苯甲醇0.5g，余量為水。
[0007] 所述的厚垣抱子樣細(xì)胞的直徑為9-15叫1，區(qū)別于直徑約6化m的黃抱原毛平革菌厚 垣抱子(chlamydospore)。
[000引所述的固體發(fā)酵過(guò)程為:接種10-20mL黃抱原毛平革菌分生抱子懸液于每千克固 體發(fā)酵培養(yǎng)基中，其中黃抱原毛平革菌分生抱子懸液的抱子濃度為3X107個(gè)/mL，固體發(fā)酵 罐的溫度控制在33°C，靜置發(fā)酵10天，發(fā)酵過(guò)程中每2小時(shí)攬拌一次。
[0009] 所述的玉米賴桿在使用之前進(jìn)行粉碎處理，粉碎物于50°C烘箱中烘干后備用。
[0010] 所述的黃抱原毛平革菌為商業(yè)化菌株，購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中屯、，菌株編號(hào) 為ATCC24725。
[0011] 本發(fā)明W玉米賴桿為碳源來(lái)生產(chǎn)厚垣抱子樣細(xì)胞，不僅可減輕賴桿焚燒對(duì)大氣環(huán) 境造成的污染，提高廢棄賴桿的利用率，而且產(chǎn)生的厚垣抱子樣細(xì)胞還可作為生物制劑用 于環(huán)境治理、酶制劑發(fā)酵及農(nóng)田上壤生物修復(fù)等領(lǐng)域。
【具體實(shí)施方式】
[0012] W下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但不應(yīng)該將此理解為本 發(fā)明上述主題的范圍僅限于W下的實(shí)施例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā) 明的范圍。 實(shí)施例
[0013] 一、不同賴桿量對(duì)化C產(chǎn)量的影響 1、利用PDA(馬鈴馨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基)平板培養(yǎng)P. chrysosporium，3-5天后，平板上 分生抱子用無(wú)菌水洗脫，適當(dāng)稀釋后，制備成濃度為3X107個(gè)/mL的分生抱子懸液。
[0014] 2、根據(jù)配方1 -3分別制備固體發(fā)酵培養(yǎng)基： 配方1:玉米賴桿粉碎物300g、酒石酸錠50g、K此P〇4 26g、MgS〇4.7出0 24g、CaCl2 20邑、 1記〇4'5出0 10邑、維生素 810.1邑、苯甲醇0.5邑，加水至總重為化邑。
[0015] 配方2:玉米賴桿粉碎物400g、酒石酸錠50g、K此P〇4 26g、MgS〇4.7此0 24g、CaCl2 20邑、1記04'5出0 10邑、維生素 810.1邑、苯甲醇0.5邑，加水至總重為化邑。
[0016] 配方3:玉米賴桿粉碎物500g、酒石酸錠50g、K此P〇4 26g、MgS〇4 · 7此0 24g、CaCl2 20邑、1記04'5出0 10邑、維生素 810.1邑、苯甲醇0.5邑，加水至總重為化邑。
[0017] 3、接種與發(fā)酵 固體發(fā)酵罐體積為2 L，裝1 kg經(jīng)滅菌的固體發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵罐內(nèi)接種15 mL P. chrysosporium分生抱子懸液(抱子濃度=3 X 107個(gè)/mL)，溫度控制在33°C，固體發(fā)酵過(guò)程中 每2小時(shí)攬拌一次，發(fā)酵時(shí)間為10天。
[001引 4、化村十?dāng)?shù) 利用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定CLC的數(shù)量，單位CRJ/g。
[0019] 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，固體發(fā)酵10天后，玉米賴桿粉碎物含量為400g/kg時(shí)，P. ch巧sosporium的化C產(chǎn)量最高，為8.9X108 CFU/g。玉米賴桿粉碎物含量為300g/kg和 500g/kg時(shí)，CLC的產(chǎn)量略有下降，分別為6.5 X 1〇8 C即/g和7.4 X 1〇8 CFU/g。W上結(jié)果表明 玉米賴桿可W作為營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)用于化C的固體發(fā)酵，玉米賴桿的不同用量對(duì)化C的產(chǎn)量具有一 定的影響。
[QQ2Q] 表1 不同玉米賴桿含量對(duì)化C產(chǎn)量的影響_
W上實(shí)施例描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征及優(yōu)點(diǎn)，本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解， 本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說(shuō)明書中描述的只是說(shuō)明本發(fā)明的原理，在 不脫離本發(fā)明原理的范圍下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，運(yùn)些變化和改進(jìn)均落入本發(fā) 明保護(hù)的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種利用黃孢原毛平革菌固體發(fā)酵玉米秸桿生產(chǎn)厚垣孢子樣細(xì)胞的方法，其特征在 于:黃孢原毛平革菌利用玉米秸桿為碳源，通過(guò)固體發(fā)酵產(chǎn)生厚垣孢子樣細(xì)胞，其中每千克 固體發(fā)酵培養(yǎng)基含以下成分:玉米秸桿粉碎物300-500g、酒石酸銨50g、KH 2P〇4 26g、MgS〇4 · 7H20 24g、CaCl2 20g、MnS〇4.5H20 10g、維生素 B1 O.lg、苯甲醇0.5g，余量為水。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用黃孢原毛平革菌固體發(fā)酵玉米秸桿生產(chǎn)厚垣孢子樣細(xì)胞 的方法，其特征在于:所述的厚垣孢子樣細(xì)胞的直徑為9-15 μπι。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用黃孢原毛平革菌固體發(fā)酵玉米秸桿生產(chǎn)厚垣孢子樣細(xì) 胞的方法，其特征在于:所述的固體發(fā)酵過(guò)程為接種10-20 mL黃孢原毛平革菌分生孢子懸 液于每千克固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，其中黃孢原毛平革菌分生孢子懸液的孢子濃度為3 X107 個(gè)/mL，固體發(fā)酵罐的溫度控制在33°C，靜置發(fā)酵10天，發(fā)酵過(guò)程中每2小時(shí)攪拌一次。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用黃孢原毛平革菌固體發(fā)酵玉米秸桿生產(chǎn)厚垣孢子樣細(xì)胞 的方法，其特征在于:所述的玉米秸桿在使用之前進(jìn)行粉碎處理，粉碎物于50°C烘箱中烘干 后備用。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用黃孢原毛平革菌固體發(fā)酵玉米秸桿生產(chǎn)厚垣孢子樣細(xì)胞 的方法，其特征在于:所述的黃孢原毛平革菌為商業(yè)化菌株，購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中 心，菌株編號(hào)為ATCC24725。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種利用黃孢原毛平革菌固體發(fā)酵玉米秸稈生產(chǎn)厚垣孢子樣細(xì)胞的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案要點(diǎn)為：黃孢原毛平革菌利用玉米秸稈為碳源，通過(guò)固體發(fā)酵產(chǎn)生厚垣孢子樣細(xì)胞，其中每千克固體發(fā)酵培養(yǎng)基含以下成分：玉米秸稈粉碎物300-500g、酒石酸銨50g、KH2PO4？26g、MgSO4·7H2O？24g、CaCl2？20g、MnSO4·5H2O？10g、維生素B1？0.1g、苯甲醇0.5g，余量為水。本發(fā)明以玉米秸稈為碳源來(lái)生產(chǎn)厚垣孢子樣細(xì)胞，不僅可減輕秸稈焚燒對(duì)大氣環(huán)境造成的污染，提高廢棄秸稈的利用率，而且產(chǎn)生的厚垣孢子樣細(xì)胞還可作為生物制劑用于環(huán)境治理、酶制劑發(fā)酵及農(nóng)田土壤生物修復(fù)等領(lǐng)域。
【IPC分類】C12R1/645, C12N3/00
【公開(kāi)號(hào)】CN105543159
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610117193
【發(fā)明人】王海磊, 王瑩, 李平, 李祎, 劉磊
【申請(qǐng)人】河南師范大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年5月4日
【申請(qǐng)日】2016年3月2日