一種從海南擬盤多毛孢菌代謝產(chǎn)物中提取紫杉醇的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及紫杉醇的提取方法，具體地說，涉及一種從海南擬盤多毛孢菌代謝產(chǎn)物中提取紫杉醇的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]紫杉醇(taxol)最早由Wani等分離自短葉紅豆杉(Taxus brevifolia Nutt)，是一種復(fù)雜的具有抗癌活性的二萜類化合物用于治療卵巢癌、乳腺癌、非小細胞肺癌、食道癌等。SchifT證實了紫杉醇作用機理是通過與微管蛋白結(jié)合，促進其聚合，抑制癌細胞有絲分裂，阻止癌細胞的無限增殖。
[0003]目前，主要從紅豆杉的樹皮中提取紫杉醇。由于紅豆杉系珍稀植物，而樹皮中紫杉醇含量很低，靠樹皮提取紫杉醇無法滿足市場需求，且嚴重地破壞自然資源，危及生態(tài)平。1993年，Stierle等從短葉紅豆杉的韌皮部中分離出一種紫杉醇產(chǎn)生菌，開拓了一條通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)紫杉醇的新途徑。1996年，Strobel等從西藏紅豆杉中分離到一株產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌，產(chǎn)量達到50ug/L ;2000年，Wang等從南方紅豆杉中分離出一株產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌，產(chǎn)量達185.4ug/L;周東坡等從東北紅豆杉一株內(nèi)生真菌，是我國的新記錄屬-樹狀多節(jié)孢，產(chǎn)量為51.06-125.70ug/L?近幾年來，國內(nèi)外學(xué)者們通過對紫杉醇高產(chǎn)菌的篩選以及對發(fā)酵條件的優(yōu)化方面做了研宄。Govindarajan Kathiravan等對短毛擬盤多毛孢進行發(fā)酵，檢測到紫杉醇含量為640ug/L ;耿直等從秦巴山區(qū)中國紅豆杉莖和根中分離出一株綠僵菌經(jīng)發(fā)酵后產(chǎn)量可達846.lug/L ;張遠都等從南方紅豆杉韌皮部篩選出一株鏈格孢屬的新種，其培養(yǎng)液中紫杉醇含量為1003ug/L，基本達到工業(yè)生產(chǎn)要求；耿直靳瑞等篩選到一株產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌XC1-07進行發(fā)酵條件的初步優(yōu)化，使紫杉醇的產(chǎn)量為1124.34ug/Lo我們從患皮膚病的大熊貓患病處分離出一株紫杉醇產(chǎn)生菌，經(jīng)鑒定為擬盤多毛孢屬。同時通過TLC、UV、HPLC, NMR多種檢測手段證實其產(chǎn)紫杉醇的能力。
[0004]2011，從位于雅安的中國大熊貓保護和研宄中心的大熊貓皮肩中，分離出一株海南擬盤多毛孢。海南擬盤多毛孢一般是一種從羅漢松等植物中分離出來的內(nèi)生真菌。據(jù)我們了解，這是在動物中發(fā)現(xiàn)海南擬盤多毛孢的第一次報告，而所有其他的擬盤多毛孢物種，均是從紅豆杉植物中分離的。雖然從非動物來源中分離出紫杉醇的量仍然很低，但是從動物來源中分離出的海南擬盤多毛孢產(chǎn)紫杉醇的量，是否高于非動物資源的水平仍然未知。非動物來源真菌產(chǎn)紫杉醇產(chǎn)量低，而大熊貓源海南擬盤多毛孢紫杉醇產(chǎn)量很少有報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，提供一種從海南擬盤多毛孢菌代謝產(chǎn)物中提取紫杉醇的方法，該方法調(diào)查了從大熊貓皮肩中分離出的海南擬盤多毛孢生產(chǎn)紫杉醇的產(chǎn)量。其具體技術(shù)方案為:
[0006]一種從海南擬盤多毛孢菌代謝產(chǎn)物中提取紫杉醇的方法，包括以下步驟:
[0007]步驟1:菌體的培養(yǎng)及發(fā)酵
[0008]將分離自大熊貓體表的海南擬盤多毛孢菌株接種到PDA固體培養(yǎng)基上，28°C避光培養(yǎng)，鏡檢產(chǎn)孢后，用20ml無菌生理鹽水沖洗菌落制成混懸液，將混懸液移入一無菌試管，密閉放入渦流器15s，使菌懸液充分混勻；
[0009]然后用移液器將制備好的菌懸液轉(zhuǎn)入CPDA發(fā)酵液，用震蕩培養(yǎng)箱，28 °C、200r/min恒溫震蕩培養(yǎng)21?28天；
[0010]步驟2:次級代謝產(chǎn)物的提取
[0011]CPDA發(fā)酵液4°C，10000r/min，離心lOmin，分別收集上清液和菌絲體。加入0.5gNaC03到上清液中，同時可加入NaCl，用等體積的乙酸乙酯:丙酮萃取三次，每次4h，向菌絲體加入甲醇攪拌均勻，用超聲破碎儀破碎細胞后冷凍24h，經(jīng)離心得有機相和菌絲體，菌絲體再進行索氏提取8h，溶劑為二氯甲烷，然后合并上述三部分有機相于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上35°C旋轉(zhuǎn)濃縮成浸膏狀，浸膏溶于1ml甲醇用于柱層析；
[0012]步驟3:柱層析純化
[0013]AB-8大孔樹脂進行預(yù)處理后，濕法裝柱。用無水乙醇以1.0ml/min的流速沖柱穩(wěn)定后，用濃度為30 %、40 %、50 %、60 %、70 %的乙醇溶液進行洗脫，流速為1.5ml/min，收集洗脫液，進行TLC檢測，展層體系，在254nm紫外燈下觀察熒光，再用1%香草醛的濃硫酸噴霧顯色，觀察有無紫杉作對照，收集上述具有特征性藍斑的洗脫液，經(jīng)濃縮后再重復(fù)過柱兩次得到純化后的樣品。
[0014]進一步，步驟I中所述菌懸液和發(fā)酵液的體積比為1: 100。
[0015]進一步，步驟2中所述菌絲重量:甲醇體積=Ig: 10ml。
[0016]進一步，步驟3中展層體系為二氯甲烷和甲醇，其體積比為20: I。
[0017]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為:
[0018]本發(fā)明方法所提取的海南擬盤多毛孢真菌產(chǎn)的紫杉醇，和標準紫杉醇有相同的結(jié)構(gòu)，且產(chǎn)量為1466.87 μ g/Lo大熊貓皮肩中的這種真菌，產(chǎn)紫杉醇的量顯著高于來自非動物來源的真菌。真菌生產(chǎn)紫杉醇可能是一個為紫杉醇工業(yè)規(guī)模化生產(chǎn)的潛在候選方法。
【具體實施方式】
[0019]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步詳細地說明。
[0020]本發(fā)明方法中的菌株
[0021]分離自大熊貓體表的海南擬盤多毛孢菌株。海南擬盤多毛孢菌(大熊貓源)采集于中國四川省雅安市碧峰峽鎮(zhèn)中國保護大熊貓研宄基地。
[0022]培養(yǎng)基及發(fā)酵液
[0023]PDA 固體培養(yǎng)基；CPDA 發(fā)酵液:200g 馬鈴薯，20g 葡萄糖，3g KH2P04，1.5gMgS04，0.15g檸檬酸三鈉(實驗中用檸檬酸三鈉代替檸檬酸)，0.0lg VBLlOOOmL自來水，pH6.5。
[0024]實施例1
[0025]一種從海南擬盤多毛孢菌代謝產(chǎn)物中提取紫杉醇的方法，包括以下步驟:
[0026]步驟1:菌體的培養(yǎng)及發(fā)酵
[0027]將分離自大熊貓體表的海南擬盤多毛孢菌株接種到PDA固體培養(yǎng)基上，28°C避光培養(yǎng)，鏡檢產(chǎn)孢后，用20ml無菌生理鹽水沖洗菌落制成混懸液，將混懸液移入一無菌試管，密閉放入渦流器15s，使菌懸液充分混勻；
[0028]然后用移液器將制備好的菌懸液轉(zhuǎn)入CPDA發(fā)酵液(按菌懸液:發(fā)酵液=I: 100)，用震蕩培養(yǎng)箱，28°C、200r/min恒溫震蕩培養(yǎng)21天；
[0029]步驟2:次級代謝產(chǎn)物的提取
[0030]CPDA發(fā)酵液4°C，10000r/min，離心1min，分別收集上清液和菌絲體。加入0.5gNaC03(1000ml的量)到上清液中，同時可加入NaCl，用等體積的乙酸乙酯:丙酮萃取三次，每次4h，向菌絲體加入甲醇(按菌絲重量:甲醇體積=1:1Og:ml)攪拌均勾，用超聲破碎儀破碎細胞后冷凍24h，經(jīng)離心得有機相和菌絲體，菌絲體再進行索氏提取8h，溶劑為二氯甲烷，然后合并上述三部分有機相于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上35°C旋轉(zhuǎn)濃縮成浸膏狀，浸膏溶于1ml甲醇用于柱層析；
[0031]步驟3:柱層析純化
[0032]AB-8大孔樹脂進行預(yù)處理后，濕法裝柱。用無水乙醇以1.0ml/min的流速沖柱穩(wěn)定后，用濃度為30%的乙醇溶液進行洗脫，流速為1.5ml/min，收集洗脫液，進行TLC檢測，展層體系(二氯甲烷:甲醇=20: 1)，在254nm紫外燈下觀察熒光，再用1%香草醛的濃硫酸噴霧顯色，觀察有無紫杉作對照，收集上述具有特征性藍斑的洗脫液，經(jīng)濃縮后再重復(fù)過柱兩次得到純化后的樣品。
[0033]實施例2
[0034]一種從海南擬盤多毛孢菌代謝產(chǎn)物中提取紫杉醇的方法，包括以下步驟:
[0035]步驟1:菌體的培養(yǎng)及發(fā)酵
[0036]將分離自大熊貓體表的海南擬盤多毛孢菌株接種到PDA固體培養(yǎng)基上，28°C避光培養(yǎng)，鏡檢產(chǎn)孢后，用20ml無菌生理鹽水沖洗菌落制成混懸液，將混懸液移入一無菌試管，密閉放入渦流器15s，使菌懸液充分混勻；
[0037]然后用移液器將制備好的菌懸液轉(zhuǎn)入CPDA發(fā)酵液(按菌懸液:發(fā)酵液=I: 100)，用震蕩培養(yǎng)箱，28°C、200r/min恒溫震蕩培養(yǎng)25天；
[0038]步驟2:次級代謝產(chǎn)物的提取
[0039]CPDA發(fā)酵液4°C，10000r/min，離心1min，分別收集上清液和菌絲體。加入0.5gNaC03(1000ml的量)到上清液中，同時可加入NaCl，用等體積的乙酸乙酯:丙酮萃取三次，每次4h，向菌絲體加入甲醇(按菌絲重量:甲醇體積=1:1Og:ml)攪拌均勾，用超聲破碎儀破碎細胞后冷凍24h，經(jīng)離心得有機相和菌絲體，菌絲體再進行索氏提取8h，溶劑為二氯甲烷，然后合并上述三部分有機相于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上35°C旋轉(zhuǎn)濃縮成浸膏狀，浸膏溶于1ml甲醇用于柱層析；
[0040]步驟3:柱層析純化
[0041]AB-8大孔樹脂進行預(yù)處理后，濕法裝柱。用無水乙醇以1.0ml/min的流速沖柱穩(wěn)定后，用濃度為40%