的乙醇溶液進(jìn)行洗脫，流速為1.5ml/min，收集洗脫液，進(jìn)行TLC檢測，展層體系(二氯甲烷:甲醇=20: 1)，在254nm紫外燈下觀察熒光，再用1%香草醛的濃硫酸噴霧顯色，觀察有無紫杉作對照，收集上述具有特征性藍(lán)斑的洗脫液，經(jīng)濃縮后再重復(fù)過柱兩次得到純化后的樣品。
[0042]實施例3
[0043]一種從海南擬盤多毛孢菌代謝產(chǎn)物中提取紫杉醇的方法，包括以下步驟:
[0044]步驟1:菌體的培養(yǎng)及發(fā)酵
[0045]將分離自大熊貓體表的海南擬盤多毛孢菌株接種到PDA固體培養(yǎng)基上，28°C避光培養(yǎng)，鏡檢產(chǎn)孢后，用20ml無菌生理鹽水沖洗菌落制成混懸液，將混懸液移入一無菌試管，密閉放入渦流器15s，使菌懸液充分混勻；
[0046]然后用移液器將制備好的菌懸液轉(zhuǎn)入CPDA發(fā)酵液(按菌懸液:發(fā)酵液=
I: 100)，用震蕩培養(yǎng)箱，28°C、200r/min恒溫震蕩培養(yǎng)28天；
[0047]步驟2:次級代謝產(chǎn)物的提取
[0048]CPDA發(fā)酵液4°C，10000r/min，離心lOmin，分別收集上清液和菌絲體。加入0.5gNaC03(1000ml的量)到上清液中，同時可加入NaCl，用等體積的乙酸乙酯:丙酮萃取三次，每次4h，向菌絲體加入甲醇(按菌絲重量:甲醇體積=1:1Og:ml)攪拌均勾，用超聲破碎儀破碎細(xì)胞后冷凍24h，經(jīng)離心得有機相和菌絲體，菌絲體再進(jìn)行索氏提取8h，溶劑為二氯甲烷，然后合并上述三部分有機相于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上35°C旋轉(zhuǎn)濃縮成浸膏狀，浸膏溶于1ml甲醇用于柱層析；
[0049]步驟3:柱層析純化
[0050]AB-8大孔樹脂進(jìn)行預(yù)處理后，濕法裝柱。用無水乙醇以1.0ml/min的流速沖柱穩(wěn)定后，用濃度為50%的乙醇溶液進(jìn)行洗脫，流速為1.5ml/min，收集洗脫液，進(jìn)行TLC檢測，展層體系(二氯甲烷:甲醇=20: 1)，在254nm紫外燈下觀察熒光，再用1%香草醛的濃硫酸噴霧顯色，觀察有無紫杉作對照，收集上述具有特征性藍(lán)斑的洗脫液，經(jīng)濃縮后再重復(fù)過柱兩次得到純化后的樣品。
[0051]實施例4
[0052]一種從海南擬盤多毛孢菌代謝產(chǎn)物中提取紫杉醇的方法，包括以下步驟:
[0053]步驟1:菌體的培養(yǎng)及發(fā)酵
[0054]將分離自大熊貓體表的海南擬盤多毛孢菌株接種到PDA固體培養(yǎng)基上，28°C避光培養(yǎng)，鏡檢產(chǎn)孢后，用20ml無菌生理鹽水沖洗菌落制成混懸液，將混懸液移入一無菌試管，密閉放入渦流器15s，使菌懸液充分混勻；
[0055]然后用移液器將制備好的菌懸液轉(zhuǎn)入CPDA發(fā)酵液(按菌懸液:發(fā)酵液=
I: 100)，用震蕩培養(yǎng)箱，28°C、200r/min恒溫震蕩培養(yǎng)23天；
[0056]步驟2:次級代謝產(chǎn)物的提取
[0057]CPDA發(fā)酵液4°C，10000r/min，離心lOmin，分別收集上清液和菌絲體。加入0.5gNaC03(1000ml的量)到上清液中，同時可加入NaCl，用等體積的乙酸乙酯:丙酮萃取三次，每次4h，向菌絲體加入甲醇(按菌絲重量:甲醇體積=1:1Og:ml)攪拌均勾，用超聲破碎儀破碎細(xì)胞后冷凍24h，經(jīng)離心得有機相和菌絲體，菌絲體再進(jìn)行索氏提取8h，溶劑為二氯甲烷，然后合并上述三部分有機相于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上35°C旋轉(zhuǎn)濃縮成浸膏狀，浸膏溶于1ml甲醇用于柱層析；
[0058]步驟3:柱層析純化
[0059]AB-8大孔樹脂進(jìn)行預(yù)處理后，濕法裝柱。用無水乙醇以1.0ml/min的流速沖柱穩(wěn)定后，用濃度為60%的乙醇溶液進(jìn)行洗脫，流速為1.5ml/min，收集洗脫液，進(jìn)行TLC檢測，展層體系(二氯甲烷:甲醇=20: 1)，在254nm紫外燈下觀察熒光，再用1%香草醛的濃硫酸噴霧顯色，觀察有無紫杉作對照，收集上述具有特征性藍(lán)斑的洗脫液，經(jīng)濃縮后再重復(fù)過柱兩次得到純化后的樣品。
[0060]實施例5
[0061]一種從海南擬盤多毛孢菌代謝產(chǎn)物中提取紫杉醇的方法，包括以下步驟:
[0062]步驟1:菌體的培養(yǎng)及發(fā)酵
[0063]將分離自大熊貓體表的海南擬盤多毛孢菌株接種到PDA固體培養(yǎng)基上，28°C避光培養(yǎng)，鏡檢產(chǎn)孢后，用20ml無菌生理鹽水沖洗菌落制成混懸液，將混懸液移入一無菌試管，密閉放入渦流器15s，使菌懸液充分混勻；
[0064]然后用移液器將制備好的菌懸液轉(zhuǎn)入CPDA發(fā)酵液(按菌懸液:發(fā)酵液=
I: 100)，用震蕩培養(yǎng)箱，28°C、200r/min恒溫震蕩培養(yǎng)25天；
[0065]步驟2:次級代謝產(chǎn)物的提取
[0066]CPDA發(fā)酵液4°C，10000r/min，離心1min，分別收集上清液和菌絲體。加入
0.5gNaC03(1000ml的量)到上清液中，同時可加入NaCl，用等體積的乙酸乙酯:丙酮萃取三次，每次4h，向菌絲體加入甲醇(按菌絲重量:甲醇體積=1:1Og:ml)攪拌均勾，用超聲破碎儀破碎細(xì)胞后冷凍24h，經(jīng)離心得有機相和菌絲體，菌絲體再進(jìn)行索氏提取8h，溶劑為二氯甲烷，然后合并上述三部分有機相于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上35°C旋轉(zhuǎn)濃縮成浸膏狀，浸膏溶于1ml甲醇用于柱層析；
[0067]步驟3:柱層析純化
[0068]AB-8大孔樹脂進(jìn)行預(yù)處理后，濕法裝柱。用無水乙醇以1.0ml/min的流速沖柱穩(wěn)定后，用濃度為70%的乙醇溶液進(jìn)行洗脫，流速為1.5ml/min，收集洗脫液，進(jìn)行TLC檢測，展層體系(二氯甲烷:甲醇=20: 1)，在254nm紫外燈下觀察熒光，再用1%香草醛的濃硫酸噴霧顯色，觀察有無紫杉作對照，收集上述具有特征性藍(lán)斑的洗脫液，經(jīng)濃縮后再重復(fù)過柱兩次得到純化后的樣品。
[0069]以上所述，僅為本發(fā)明較佳的【具體實施方式】，本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，可顯而易見地得到的技術(shù)方案的簡單變化或等效替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1.一種從海南擬盤多毛孢菌代謝產(chǎn)物中提取紫杉醇的方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟1:菌體的培養(yǎng)及發(fā)酵 將分離自大熊貓體表的海南擬盤多毛孢菌株接種到PDA固體培養(yǎng)基上，28°C避光培養(yǎng)，鏡檢產(chǎn)孢后，用20ml無菌生理鹽水沖洗菌落制成混懸液，將混懸液移入一無菌試管，密閉放入渦流器15s，使菌懸液充分混勻； 然后用移液器將制備好的菌懸液轉(zhuǎn)入CPDA發(fā)酵液，用震蕩培養(yǎng)箱，28°C、200r/min恒溫震蕩培養(yǎng)21?28天； 步驟2:次級代謝產(chǎn)物的提取 CPDA發(fā)酵液4°C，10000r/min，離心lOmin，分別收集上清液和菌絲體；加入0.5gNaC03到上清液中，同時加入NaCl，用等體積的乙酸乙酯:丙酮萃取三次，每次4h，向菌絲體加入甲醇攪拌均勻，用超聲破碎儀破碎細(xì)胞后冷凍24h，經(jīng)離心得有機相和菌絲體，菌絲體再進(jìn)行索氏提取8h，溶劑為二氯甲烷，然后合并上述三部分有機相于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上35°C旋轉(zhuǎn)濃縮成浸膏狀，浸膏溶于1ml甲醇用于柱層析； 步驟3:柱層析純化 AB-8大孔樹脂進(jìn)行預(yù)處理后，濕法裝柱；用無水乙醇以1.0ml/min的流速沖柱穩(wěn)定后，用濃度為30 %、40 %、50 %、60 %、70 %的乙醇溶液進(jìn)行洗脫，流速為1.5ml/min，收集洗脫液，進(jìn)行TLC檢測，展層體系，在254nm紫外燈下觀察熒光，再用I %香草醛的濃硫酸噴霧顯色，觀察有無紫杉作對照，收集上述具有特征性藍(lán)斑的洗脫液，經(jīng)濃縮后再重復(fù)過柱兩次得到純化后的樣品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從海南擬盤多毛孢菌代謝產(chǎn)物中提取紫杉醇的方法，其特征在于，步驟I中所述菌懸液和發(fā)酵液的體積比為1: 100。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從海南擬盤多毛孢菌代謝產(chǎn)物中提取紫杉醇的方法，其特征在于，步驟2中所述菌絲重量:甲醇體積=Ig: 10ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從海南擬盤多毛孢菌代謝產(chǎn)物中提取紫杉醇的方法，其特征在于，步驟3中展層體系為二氯甲烷和甲醇，其體積比為20: 1
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種從海南擬盤多毛孢菌代謝產(chǎn)物中提取紫杉醇的方法，包括以下步驟：菌體的培養(yǎng)及發(fā)酵；次級代謝產(chǎn)物的提取；柱層析純化。本發(fā)明方法所提取的海南擬盤多毛孢真菌產(chǎn)的紫杉醇，和標(biāo)準(zhǔn)紫杉醇有相同的結(jié)構(gòu)，且產(chǎn)量為1466.87μg/L。大熊貓皮屑中的這種真菌，產(chǎn)紫杉醇的量顯著高于來自非動物來源的真菌。真菌生產(chǎn)紫杉醇可能是一個為紫杉醇工業(yè)規(guī)模化生產(chǎn)的潛在候選方法。
【IPC分類】C07D305-14, C12P17-02, C12R1-645
【公開號】CN104846026
【申請?zhí)枴緾N201510161710
【發(fā)明人】馬曉平, 古玉, 曹三杰, 鄧俊良, 余樹民, 左之才, 顏其貴, 黃小波, 文翼平, 任志華, 伍銳, 王承東, 李德生, 凌珊珊, 沈留紅, 曹隨忠, 彭廣能, 鐘志軍, 王婭, 石錦江, 胡延春, 王英柱
【申請人】四川農(nóng)業(yè)大學(xué), 中國林業(yè)科學(xué)研究院大熊貓研究中心
【公開日】2015年8月19日
【申請日】2015年4月4日